Name: 大规模生产昆虫致病真菌、 罗伯氏菌 和 异根真菌，用于昆虫害虫的商业应用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-31T13:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: 了解大规模生产昆虫致病真菌Metarhizium robertsii和M. pinghaense分生孢子的方法，使用大米作为最优固体基质进行发酵培养。该技术为农业害虫生物防治和综合虫害管理提供了可扩展的解决方案。

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作者感谢Hort Pome、Hort Stone以及产业技术与人力资源计划（THRIP：TP14062571871）对本项目的资助。
ORCID: 
Letodi L. Mathulwe http://orcid.org/0000-0002-5118-3578
Antoinette P. Malan http://orcid.org/0000-0002-9257-0312
Nomakholwa F. Stokwe http://orcid.org/0000-0003-2869-5652

1. 真菌菌株来源
<ol>
	<li>使用南非分离的两种真菌菌株 M. pinghaense 5 HEID（GenBank 登录号：MT367414/MT895630）和 M. robertsii 6EIKEN（MT378171/MT380849）, 采自南非西开普省的苹果园。</li>
	<li>在添加1 g酵母提取物的60 g沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDAY）上培养每种虫生真菌分离物 10 µL 链霉素 
	注意：将EPF培养物在严格控制的温度下孵育，温度为± 25 °C 在暗处。</li>
</ol>
2. Metarhizium pinghaense 和 M. robertsii 分生孢子悬液接种
<ol>
	<li>固体基质的制备
	<ol>
		<li>选用两种农产品，即燕麦片和大麦片，作为两种虫生真菌分离株的培养基质，并使用灭菌袋（305 mm × 660 mm）作为发酵袋。</li>
		<li>使用一段小型聚氯乙烯废管（1000 mm × 50 mm），在灭菌袋的开口端制作发酵袋的颈部，并使用灭菌胶带将管道固定在袋子上。</li>
		<li>用无菌棉塞封闭管道，以在发酵过程中实现充分的气体交换。</li>
		<li>分别称取200 g干燥的燕麦片和大麦片，放入发酵袋中，向每个袋中加入100 mL蒸馏水，并充分混合袋内内容物。</li>
		<li>将湿润的谷物静置15–30分钟，使其充分吸水，然后进行高压灭菌。每种谷物类型准备六个袋子，为防止污染，将袋子放入另一层灭菌袋中，并在121 °C下高压灭菌55分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分生孢子悬浮液接种物的制备
	<ol>
		<li>使用无菌外科刀片刮取培养2–3周的M. pinghaense和M. robertsii真菌培养物中的分生孢子。</li>
		<li>将收集的真菌分生孢子悬浮于20 mL无菌蒸馏水中，加入0.05% Tween 20，并将分生孢子悬浮液涡旋振荡2分钟。</li>
		<li>制备20 mL浓度为1 × 107 个分生孢子/mL的分生孢子悬浮液，分别接种至燕麦片和大麦片固体基质中。 
		注意：使用血细胞计数板测定分生孢子浓度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>固体基质的接种
	<ol>
		<li>打开每个袋子，移除棉塞，将制备好的20 mL分生孢子悬浮液加入已冷却的灭菌基质中。</li>
		<li>重新用棉塞封闭袋子，并轻轻揉搓袋内内容物，使真菌接种物与谷物基质充分均匀混合。</li>
		<li>将发酵袋置于25 ± 1 °C的恒温条件下培养，并确保培养物与环境之间有充分的气体交换。 
		注意：该操作必须在超净工作台内进行。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>发酵阶段
	<ol>
		<li>接种并培养2天后，当观察到明显的菌丝生长且基质因真菌生长而开始结块时，手动揉搓发酵袋内的谷物基质。 
		注意：此操作旨在混合接种颗粒，促进真菌营养生长初期的菌丝分枝。</li>
		<li>使用厨房擀面杖处理基质层，以避免谷物基质层的物理不均一性及基质堆积厚度不均。 
		注意：该过程可促进真菌代谢，优化真菌孢子产量，并最大化表面积，从而提高分生孢子产量18。</li>
		<li>继续发酵过程，持续4–5周，每隔2天检查一次发酵袋，观察是否存在可能在发酵过程中出现的白色营养性过度生长，此类过度生长会显著影响真菌分生孢子的产量。 
		注意：一旦发现发酵袋中出现白色营养性过度生长，应立即终止该袋的发酵过程，并对真菌培养物进行干燥处理18。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 芽生孢子接种
<ol>
	<li>分生孢子的产生与接种
	<ol>
		<li>为 M. pinghaense 和 M. robertsii 准备液体培养基，包含 1 L 蒸馏水、30 g 葡萄糖、20 g 酵母提取物、4 g 磷酸氢二钾（K2HPO4）、15 mL 玉米浆液以及 10 µg/mL 抗生素链霉素。</li>
		<li>首先将蒸馏水加热，在接近沸点前关闭热源，除链霉素外，将所有成分加入热锅中的水中。使培养基轻微煮沸 3–4 分钟，并持续搅拌，以确保各成分充分混合，并防止部分成分在锅底沉积。</li>
		<li>将培养基共 100 mL 分装至九个不同的 250-mL 三角瓶中，每个瓶口塞入棉塞，并用铝箔覆盖棉塞作为封口（图 1A）。</li>
		<li>将装有培养基的三角瓶在 121 °C 下高压灭菌 55 分钟。灭菌后，让瓶内培养基冷却，并向每瓶中加入 10 mg/mL 的链霉素（图 1B）。</li>
		<li>在无菌条件下，从培养 2–3 周的 M. pinghaense 和 M. robertsii 真菌培养皿中，分别挑取 2–3 环真菌分生孢子，接种至各 100 mL 液体培养基（250-mL 三角瓶）中，并密封三角瓶。</li>
		<li>将液体培养的三角瓶置于 25 ± °C 条件下，在 140 rpm 的摇床中振荡培养 3 天，当培养物出现明显浑浊并观察到真菌分生孢子生长时，停止培养（图 1C）。</li>
		<li>为检测可能的细菌污染，在培养 24 小时后，从每个液体培养瓶中取 100 µL 样品，分别接种至三个 SDA 平板上（每株菌三个平板）。在 25 ± °C 的恒温条件下培养 48 小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>固体基质的制备
	<ol>
		<li>使用预煮的长粒白米作为 M. pinghaense 和 M. robertsii 分生孢子的固体基质培养基（参考 Jaronski 和 Jackson18 的方法修改）。</li>
		<li>按照上述步骤 2.1.1–2.1.3 准备发酵袋，每袋加入 1 kg 大米和 300 mL 无菌蒸馏水。</li>
		<li>轻轻混合发酵袋中的内容物，将其直立放入外层高压灭菌袋中，在 121 °C 下高压灭菌 55 分钟。灭菌后，在无菌条件下让基质冷却约 45 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>接种与发酵
	<ol>
		<li>在超净工作台中打开 M. pinghaense 和 M. robertsii 液体培养瓶的封口，并用火焰灼烧瓶口边缘 10 秒。</li>
		<li>移除三角瓶口的棉塞，将 100-mL 液体培养物倒入发酵袋中（图 2）。重新塞上棉塞，并用橡皮筋将手术纸固定在袋口颈部进行覆盖。 
		注：使用血球计数板测定每瓶中的分生孢子浓度，并采用 1 × 107 – 5 × 108 个分生孢子/mL 的浓度接种基质28。</li>
		<li>扭转发酵袋顶部，通过摇动及轻柔按摩基质使其混合均匀，将袋子在 25 ± °C 条件下培养，同时将袋内基质压平，以避免形成过厚的基质层18。</li>
		<li>接种并培养 2–3 天后，当观察到明显的菌丝生长且真菌已将基质粘连在一起时，通过按摩袋内内容物将基质打散（参考 Jaronski 和 Jackson18 的技术修改）。 
		注：继续发酵共 4 周。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="发酵实验；锥形瓶；微生物生长分析；不同肉汤条件。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63246/63246fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 1"> 
图 1：250 mL 锥形瓶中的液体培养基。（A）高压灭菌前。（B）高压灭菌后并接种杀虫真菌孢子。（C）含有真菌芽生孢子的浑浊培养基。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63246/63246fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="发酵过程、细菌培养瓶含生长培养基、生物危害设置、微生物学" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63246/63246fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2：制备好的分生孢子液体培养基。（A）Metarhizium robertsii 和（B）Metarhizium pinghaense，接种于大米作为固体基质前的状态。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63246/63246fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
4. 真菌培养物的干燥
<ol>
	<li>在试验使用前，将产孢的真菌培养物转移至26-30 kg（30 x 43 x 15250 cm3）的牛皮纸袋中，干燥10-12天。</li>
	<li>为提高纸袋的抗张强度，将每个袋子顶部水平切除三分之一，并对袋子底部进行衬里（图3A，B）。</li>
</ol>
<img alt="粉状材料的不同包装形式；展示不同构型的袋子；实验设置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63246/63246fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3：纸袋的制备、菌种干燥程序及包装方法。 （A，B）牛皮纸袋的制备过程。Metarhizium 物种在（C，E）预煮大米和（D，F）压片大麦上培养后的干燥过程。（G）用订书钉封口的纸袋，形成三角帐篷结构。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63246/63246fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<ol start="3">
	<li>轻轻揉碎每个发酵袋中的基质，剪去每个袋子的一角，通过剪角留出的开口将整个培养物转移至纸袋中（图 3C-F）。为避免真菌孢子大量逸散至空气中，操作应缓慢进行。 
	注意：此操作应在无菌条件下进行，使用层流洁净台，以防止污染。</li>
	<li>标记每个纸袋，将每个纸袋的顶部两端依次折叠两次，用订书钉封口，形成三角帐篷状结构，并将纸袋置于金属干燥架上，在温度控制为 ± 25 °C、相对湿度为 30–40% 的条件下进行充分且均匀的干燥。</li>
	<li>每天翻动纸袋一次，以确保培养物均匀干燥，并防止可能发生的营养体再生，从而避免可收获真菌孢子产量降低。</li>
	<li>在干燥过程中，每 2 天称量每个干燥袋的重量，并持续干燥直至连续数日间袋重几乎无变化或变化极小为止。</li>
</ol>
5. 收集真菌分生孢子
<ol>
	<li>使用三层嵌套筛网从培养物中机械采集真菌分生孢子：将孔径为500 µm的试验筛（ETS筛网编号35）置于孔径为212 µm的试验筛上，再将后者置于孔径为150 µm的ETS筛网编号100上，整体放置于收集盘上。</li>
	<li>缓慢将干燥的培养样品加载至ETS筛网编号35的筛网上，并盖上筛盖，以防止真菌分生孢子释放到空气中。</li>
	<li>向筛网中加入10–12颗玻璃珠，以促进分生孢子通过筛网，避免孢子滞留在筛网中，从而减少孢子回收率下降的风险。</li>
	<li>使用电工胶带密封各筛网连接处，防止分生孢子粉尘逸出。</li>
	<li>将筛网组放置于配备黏性垫的振动筛分仪上，以固定收集盘和筛网，振动20–25分钟，振动频率为每分钟560–640次（图4）。 
	注意：该技术改编自Jaronski和Jackson18。</li>
</ol>
<img alt="使用筛子和天平进行静力平衡实验；土壤分层过程。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63246/63246fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 4"> 
图 4：从大米和压碎大麦上干燥的 Metarhizium robertsii 培养物中收获真菌孢子。（A）在筛子中加入10-12个玻璃弹珠，以帮助真菌分生孢子通过筛网。M. robertsii 分生孢子从以下培养物中收获：（B）大米，以及（C）压碎大麦。（D）置于振动筛分仪上的筛子。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63246/63246fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<ol start="6">
	<li>从收集盘中取出试验筛，收集分生孢子，并将收集到的分生孢子置于密封且防水的拉链袋中，用于长期保存（3–6 个月）。</li>
</ol>
6. 真菌分生孢子产量的定量
<ol>
	<li>在从每种谷物培养基上收获真菌分生孢子之前，测量并记录每种谷物培养基的质量。</li>
	<li>通过从固体培养基与分生孢子的总质量中减去固体培养基的质量，计算所收集分生孢子的总重量。 
	注意：总分生孢子产量不仅包括收获的分生孢子，还包括残留在固体培养基上的真菌分生孢子。</li>
	<li>称量培养基，并从称重后的培养基中取出10 g。将10 g培养基悬浮于含0.05% Tween 20的10 mL无菌蒸馏水中。</li>
	<li>涡旋振荡悬浮液2分钟，使用血细胞计数板进行孢子计数，以确定从培养基上洗脱的分生孢子数量。</li>
	<li>通过将10 mL洗脱分生孢子悬浮液中的1000 µL转移至9 mL无菌蒸馏水中，定容至10 mL，进行进一步稀释，制备稀释悬浮液。</li>
	<li>涡旋振荡分生孢子悬浮液2分钟，并测定分生孢子浓度。 
	注意：按照Inglis、Enkerli和Goettel30所述的步骤和公式测定悬浮液中分生孢子的浓度。</li>
	<li>从每种培养物中收集并称取总共0.1 g的分生孢子粉末，悬浮于10 mL含0.05% Tween 20的无菌蒸馏水中，涡旋振荡分生孢子悬浮液2分钟，并使用血细胞计数板测定分生孢子浓度。</li>
	<li>通过将10 mL分生孢子悬浮液中的1000 µL转移至9 mL无菌蒸馏水中，定容至10 mL，进行进一步稀释，制备稀释悬浮液。</li>
	<li>涡旋振荡分生孢子悬浮液2分钟，计算分生孢子浓度，并确定每克培养基的分生孢子数量。</li>
	<li>将每克收获粉末中的分生孢子数乘以收获分生孢子粉末的初始质量；将从培养基中洗脱的分生孢子数乘以废培养基的总重量（即用于收获分生孢子的培养基）。</li>
	<li>将上述两个数值相加后，除以培养基的初始干重，计算每千克或每克培养基中的分生孢子数量18。 
	注意：上述计算主要针对大米培养基进行。对M. pinghaense和M. robertsii菌株均进行了萌发率或分生孢子活力检测，以评估所产分生孢子的活力。</li>
</ol>
7. 数据分析
<ol>
	<li>使用适当的计算机软件程序对获得的结果进行统计分析。 
	注意：本研究的数据统计分析采用 STATISTICA 13.5.0.17 版本完成。</li>
</ol>

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作者无任何利益冲突需要披露。

在农业生态系统中，成功整合微生物制剂用于重要农业害虫的生物防治，首先依赖于在实验室条件下能否成功且便捷地大规模生产昆虫病原体。虫生真菌（EPF）的大规模生产对于在病虫害综合管理（IPM）项目中大规模应用和获取基于生物防治的EPF产品至关重要9,10,11,12,13。不同虫生真菌菌株的大规模生产成效受培养基或生产基质营养成分的影响，这些营养成分显著影响所产生的分生孢子的特性，包括其致病效力、抗干燥能力、田间持效性以及分生孢子产量8,19,20,21。因此，在培养...

昆虫病原真菌（EPF）作为重要农业害虫生物防治中的作物保护制剂，其重要性日益凸显1,2。这类天然存在于土壤中的昆虫病原菌，可在多种害虫种群中引发流行病3。EPF 具有宿主特异性，对非靶标物种造成危害的风险相对较低，且对环境无毒4。EPF 具有独特的侵染机制，可在宿主体内繁殖并持续存在于其周围环境中1。它们主要通过无性孢子攻击宿主，孢子附着于宿主表皮并穿透进入血腔，在其中侵染并增殖。宿主最终因血淋巴营养物质耗尽或真菌释放的毒性代谢产物引起的毒血症而死亡。随后，在适宜的环境条件下，真菌会从宿主尸体的体表长出（显性真菌感染）5,6。
人们对化学残留物对人类健康、环境污染以及害虫抗药性发展的负面影响日益关注，这推动了全球减少化学杀虫剂投入并寻找作物保护和害虫防治替代性、创新性及可持续策略的行动6,7,8。这为开发基于微生物的杀虫剂以用于综合害虫管理（IPM）项目提供了机会，相较于传统的化学防治方法，这类策略具有更佳的生态友好性3,8。
要为一种农业害虫开发出成功的微生物防治剂，首先必须分离、鉴定并表征一种合适的微生物，并确认其对&#160;靶标害虫的致病性。然而，还需要一种简便且成本效益高的方法来实现该微生物制剂的大规模生产，以获得可用于生物防治项目的可行产品9,10,11,12,13。大量生产高质量的昆虫病原微生物取决于菌株特性、环境条件、靶标害虫、制剂形式、市场需求、施用策略以及期望的最终产品14,15,16。昆虫病原真菌（EPF）可通过液体基质发酵生产芽生孢子，或通过固体基质发酵工艺生产气生分生孢子6,17,18。然而，昆虫病原微生物的大规模生产与制剂工艺直接影响最终产品的毒力、成本、货架期以及田间效果。为了在综合害虫管理（IPM）中成功应用，昆虫病原微生物的生产工艺必须易于操作、所需人工最少、能够产生高浓度、高毒力、有活力且持久的繁殖体，并且成本低廉4,13,14,16。
了解昆虫病原体的营养需求对于采用各种培养方法进行大规模培养至关重要4,12。生产培养基的营养成分对所产生的繁殖体特性具有显著影响，包括生物防治效果、产量、抗干燥能力以及持效性8,19,20,21。生产流程的优化旨在解决这些影响因素22。对于昆虫病原真菌（EPF），实现良好生长、产孢及大量产生分生孢子的主要条件包括充足的水分、适宜的生长温度、pH值、CO2和O2的气体交换，以及营养供给，特别是良好的磷、碳水化合物、碳源和氮源18。
Jaronski 和 Jackson18 指出，与液体基质发酵法相比，固体基质发酵法是生产杀虫真菌（EPF）效率最高且最接近自然过程的方法，因为在自然条件下，真菌的分生孢子通常产生于固体直立结构上，例如昆虫尸体表面。淀粉类农产品及其副产品通常被用于虫草菌类真菌的大规模生产，因为这类真菌可通过菌丝尖端分泌高浓度的水解酶，迅速分解淀粉，穿透固体基质，并获取其中的营养物质11,17,18,23。谷物类产品还能满足健康生物量生产的需求，因为当它们被水合并灭菌后，基质可进一步从液体培养基中吸收营养16,18,24。
此前，已有若干研究尝试在不同基质上大规模培养虫生真菌（EPF）物种，例如 Beauveria bassiana (Bals.) Vuil.、Cordyceps fumosorosea (Wize) Kelper B. Shrestha &amp;#38; Spatafora、Verticillium lecanii (Zimm.) Viegas 以及部分 Metarhizium anisopliae (Metschn.) Sorokin 物种复合体的分离株16,23,24。这些已实现大规模生产并商业开发的菌株包括 Green Muscle®（菌株 IMI 330189），源自 M. anisopliae 变种 Metarhizium acridum (Driver &amp;#38; Milner) J.F. Bisch, Rehner &amp;#38; Humber；Metarhizium 69（Meta 69 菌株 ICIPE69）和 Real Metarhizium 69（L9281），源自 M. anisopliae；以及 Broadband®（菌株 PPRI 5339）和 Eco-Bb®，源自 B. bassiana25,26。然而，目前对 Metarhizium robertsii J.F. Bisch., S.A. Rehner &amp;#38; Humber 和 Metarhizium pinghaense Chen &amp;#38; Guo 进行大规模培养的研究仍较为有限。在先前的一项研究中，这两种分离株被筛选为对粉蚧 Pseudococcus viburni Signoret（半翅目：粉蚧科）具有最强防控效果的菌株27。因此，本研究旨在配制并大规模生产足量、具有强抗逆性的本地分离株 M. robertsii 和 M. pinghaense 的感染性繁殖体，以用于商业化的害虫防治应用。采用固体基质发酵法对两种虫生真菌分离株的分生孢子进行大规模生产。接种时采用了两种虫生真菌接种方法：分别使用分生孢子悬浮液和芽生孢子的液体真菌培养物来接种固体基质。

<table><tbody><tr><td>0.05% 吐温 20</td><td>Lasec</td><td></td><td>添加至分生孢子悬浮液中，使真菌孢子能够与水充分混合</td></tr><tr><td>20 mL 麦克弗森瓶</td><td>Lasec</td><td></td><td>用于制备分生孢子悬浮液</td></tr><tr><td>铝箔</td><td></td><td></td><td>用作 250 mL 三角瓶棉塞的覆盖材料</td></tr><tr><td>高压灭菌器</td><td></td><td></td><td>用于对分生孢子生产过程中所用材料和成分进行灭菌</td></tr><tr><td>高压灭菌袋</td><td>Lasec</td><td></td><td>发酵袋或固体基质容器</td></tr><tr><td>高压灭菌指示胶带</td><td>Lasec</td><td></td><td>用于固定发酵袋上的聚氯乙烯管</td></tr><tr><td>棕色牛皮纸袋</td><td></td><td></td><td>用于干燥农业谷物上的分生孢子培养物</td></tr><tr><td>本生灯</td><td>Labnet (Labnet International, Inc.)</td><td></td><td>用于对实验器械（手术刀片、接种环及三角瓶瓶口）进行火焰灭菌</td></tr><tr><td>透明边缘试验筛</td><td></td><td></td><td>用于将真菌分生孢子从农业谷物基质中分离出来</td></tr><tr><td>玉米浆</td><td>SIGMA</td><td>66071-94-1</td><td>芽生孢子液体培养基的成分之一</td></tr><tr><td>脱脂棉</td><td>Lasec</td><td></td><td>用作发酵袋瓶口的塞子</td></tr><tr><td>杜兰玻璃实验瓶</td><td>Neolab</td><td></td><td>用于高压灭菌 SDA 培养基和蒸馏水</td></tr><tr><td>电工胶带</td><td></td><td></td><td>用于缠绕并密封筛网接头，防止分生孢子粉尘逸出</td></tr><tr><td>ENDECOTTS 试验筛</td><td></td><td></td><td>用于将真菌分生孢子从农业谷物基质中分离出来</td></tr><tr><td>耐热锥形瓶，窄口，250 mL</td><td>Lasec</td><td></td><td>芽生孢子液体培养基的载体</td></tr><tr><td>乙醇（99%）</td><td>Lasec</td><td></td><td>用于对手术刀片和接种环进行灭菌</td></tr><tr><td>压片大麦</td><td>Health Connection Wholefoods</td><td></td><td>农业谷物，作为 &lt;em&gt;M. pinghaense&lt;/em&gt; 和 &lt;em&gt;M. robertsii&lt;/em&gt; 分生孢子的固体基质生长培养基</td></tr><tr><td>压片燕麦</td><td>Tiger brands</td><td></td><td>农业谷物，作为 &lt;em&gt;M. pinghaense&lt;/em&gt; 和 &lt;em&gt;M. robertsii&lt;/em&gt; 分生孢子的固体基质生长培养基</td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Merck</td><td></td><td>芽生孢子液体培养基的成分之一</td></tr><tr><td>培养箱/恒温培养箱</td><td></td><td></td><td>用于真菌分生孢子培养物的培养</td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td></td><td></td><td>用于测定分生孢子浓度</td></tr><tr><td>接种环</td><td>Lasec</td><td></td><td>用于采集孢子以接种液体培养基，促进芽生孢子生长</td></tr><tr><td>厨房擀面杖</td><td></td><td></td><td>用于操作固体谷物基质床</td></tr><tr><td>层流柜</td><td>ESCO Laminar Flow Cabinet</td><td></td><td>在基质接种过程中提供无菌环境</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Metarhizium pinghaense&lt;/em&gt; 分生孢子</td><td>Stellenbosch University</td><td>5HEID</td><td>用于大规模培养 &lt;em&gt;Metarhizium pinghaense&lt;/em&gt; 分生孢子的培养物</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Metarhizium robertsii&lt;/em&gt; 分生孢子</td><td>Stellenbosch University</td><td>6EIKEN</td><td>用于大规模培养 &lt;em&gt;Metarhizium robertsii&lt;/em&gt; 分生孢子的培养物</td></tr><tr><td>显微镜</td><td>ZEIZZ (Scope. A1)</td><td></td><td>用于测定分生孢子浓度及分生孢子活力</td></tr><tr><td>旋转摇床</td><td>IncoShake- LABOTEC</td><td></td><td>用于芽生孢子的生产过程</td></tr><tr><td>预煮米</td><td>Spekko</td><td></td><td>农业谷物，作为 &lt;em&gt;M. pinghaense &lt;/em&gt;和 &lt;em&gt;M. robertsii&lt;/em&gt; 分生孢子的固体基质生长培养基</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>SIGMA</td><td></td><td>添加至 SDA 培养基中以防止细菌污染</td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Lasec</td><td></td><td>SDA 培养基的容器</td></tr><tr><td>移液器及移液器吸头</td><td>Labnet (BioPette PLUS)</td><td></td><td>用于量取液体成分</td></tr><tr><td>聚氯乙烯 Marley 排水管</td><td></td><td></td><td>用于为发酵袋制作瓶口</td></tr><tr><td>磷酸氢二钾（K2HPO4）</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td></td><td>芽生孢子液体培养基的成分之一</td></tr><tr><td>橡胶圈</td><td></td><td></td><td>用于将手术纸固定在发酵袋的聚氯乙烯管瓶口上</td></tr><tr><td>沙氏葡萄糖琼脂（SDA）</td><td>NEOGEN Culture Media</td><td></td><td>用于培养 &lt;em&gt;Metarhizium pinghaense&lt;/em&gt; 和 &lt;em&gt;Metarhizium robertsii&lt;/em&gt; 孢子的培养基</td></tr><tr><td>无菌蒸馏水</td><td></td><td></td><td>用于水合农业谷物及制备分生孢子悬浮液</td></tr><tr><td>防滑垫</td><td></td><td></td><td>用于将筛网固定在振动筛分仪上</td></tr><tr><td>手术刀片</td><td>Lasec</td><td></td><td>用于从真菌培养物上刮取孢子</td></tr><tr><td>手术纸</td><td>Lasec</td><td></td><td>用于覆盖发酵袋的聚氯乙烯管口和棉塞</td></tr><tr><td>振动筛分仪</td><td></td><td></td><td>用于将分生孢子从农业谷物基质上振落</td></tr><tr><td>涡旋混合器</td><td>Labnet (Labnet International, Inc.)</td><td></td><td>用于在麦克弗森瓶中混合分生孢子悬浮液</td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>Biolab</td><td></td><td>添加至 SDA 培养基中以促进孢子萌发和生长</td></tr><tr><td>自封袋</td><td>GLAD</td><td></td><td>用于储存收获的真菌分生孢子</td></tr></tbody></table>

昆虫病原真菌 metarhizium robertsii 和 metarhizium pinghaense 的大规模生产及其在防治害虫中的商业应用

Mass Production of Entomopathogenic Fungi, Metarhizium robertsii and Metarhizium pinghaense, for Commercial Application Against Insect Pests

绿僵菌属（Metarhizium anisopliae）复合种的昆虫病原真菌作为农业害虫的生物防治剂日益受到重视。由于害虫对化学杀虫剂的抗性不断增强，人们对杀虫剂对人类健康产生的负面影响以及农药造成的环境污染日益关注，全球正积极推动寻找新型可持续的作物保护与害虫防控策略。此前已有研究尝试大规模培养如球孢白僵菌（Beauveria bassiana）等昆虫病原真菌（EPF）物种。然而，针对金龟子绿僵菌（Metarhizium robertsii）和平壤绿僵菌（M. pinghaense）的大规模培养研究仍十分有限。本研究旨在大量生产具有较强抗逆性的南非分离株 M. robertsii 和 M. pinghaense 感染性繁殖体，以满足商业化应用需求。实验选用三种农业谷物——燕麦片、大麦片和大米——作为EPF固态发酵的培养基质。采用两种接种方法：分生孢子悬浮液和液态芽生孢子菌液，用于接种固态基质。结果显示，使用分生孢子悬浮液接种的效果相对较差，因在固态基质上观察到的污染水平高于芽生孢子接种法。燕麦片被发现不适合作为 M. robertsii 和 M. pinghaense 的生长基质，因未能从该基质中收获到干燥的分生孢子。大麦片有利于 M. robertsii 分生孢子的生产，而不利于 M. pinghaense 的生产，从该基质中平均收获了 1.83 g ± 1.47 g 的干燥 M. robertsii 分生孢子，而 M. pinghaense 分生孢子产量为零。大米颗粒则有利于两种菌株 M. pinghaense 和 M. robertsii 的分生孢子大规模生产，分别从该基质中平均收获 8.2 g ± 4.38 g 和 6 g ± 2 g 的分生孢子。

在真菌培养物的干燥过程中，随着时间的推移，观察到 M. pinghaense 和 M. robertsii 在大米培养基上的培养物干重逐渐减少，而在培养物完全干燥后，其质量则基本保持不变或变化极小（图5）。图6 展示了收获的 M. pinghaense 和 M. robertsii 干燥分生孢子粉末。
<img alt="质量分解图；随时间变化的罗伯茨绿僵菌与平海绿僵菌；带误差棒的数据点。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63246/63246fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 5"> 
图 5：在10天内，以大米...

昆虫病原真菌作为农业害虫的生物防治制剂，其重要性日益凸显。本研究利用农业谷物产品，成功实现了对两种南非分离的Metarhizium robertsii和M. pinghaense菌株产生大量具有强感染活性的繁殖体的规模化生产，可用于防治害虫的商业化应用。

昆虫病原真菌 Metarhizium robertsii 和 Metarhizium pinghaense 的大规模生产及其在防治害虫中的商业应用

绿僵菌属（Metarhizium anisopliae 复合种）的昆虫病原真菌作为农业害虫的生物防治剂日益受到重视。

该方法提供了有关如何大规模生产昆虫病原真菌感染性分生孢子的新信息，以控制商业农业生态系统中的重要害虫。在当前大多数杀虫剂因对环境和人类健康产生毒性影响而逐步被淘汰的背景下，该技术描述了在大规模生产过程中确保昆虫病原真菌（EPF）分生孢子最佳产量的方法。该方法有助于害虫综合治理和生物防治，通过揭示大规模生产的分生孢子在农业生态系统中对具有杀虫剂抗性的破坏性害虫进行大范围防控的有效性，提供科学依据。该实验步骤由Letodi Luki Mathulwe博士、Nomakholwa Faith Stokwe博士以及Antoinette Paula Malan教授开发并演示。将一升蒸馏水加热，在接近沸点前关闭热源。随后加入30克葡萄糖、4克磷酸氢二钾、20克酵母提取物、15毫升玉米浆，并将混合物轻轻煮沸2至3分钟。将总共100毫升培养基分装到九个不同的250毫升锥形瓶中。在每个锥形瓶口塞入棉塞，并用铝箔覆盖棉塞作为封口。在121摄氏度下高压灭菌锥形瓶中的培养基55分钟。随后，让烧瓶中的培养基冷却，并向每个烧瓶的培养基中加入 10 毫克/毫升的链霉素。从培养 2 至 3 周的真菌培养皿中，用接种环分别取 2 至 3 环的真菌分生孢子，用于两种虫生真菌分离株。在无菌条件下，将真菌分生孢子转移至 250 毫升烧瓶中的各 100 毫升液体培养基中，并密封烧瓶。将液体培养瓶置于约25摄氏度、140转/分钟的摇床中振荡培养三天，当培养物出现明显浑浊并有真菌芽生孢子生长时，停止培养。为检测培养物中可能存在的细菌污染，于培养24小时后，从每个液体培养瓶中取100 µL样品，每株分别接种至三块SDA平板上。将平板在25±2摄氏度的恒温条件下培养48小时。使用一段小型聚氯乙烯废料管在高压灭菌袋的开口端为发酵袋制作一个颈部，并用高压灭菌胶带固定管道。用无菌的棉塞封闭管道，以在发酵过程中实现充分的气体交换。采用预煮过的长粒白米作为固态基质培养基，用于玫球孢绿僵菌（Metarhizium pinghaense）和罗伯茨绿僵菌（Metarhizium robertsii）的芽生孢子培养。每个发酵袋中加入一公斤大米和300毫升无菌蒸馏水。轻轻混合发酵袋中的内容物。将发酵袋直立放入外层高压灭菌袋中，在121摄氏度下高压灭菌55分钟。高压灭菌后，在无菌条件下让基质冷却约45分钟。在超净工作台中打开金龟子绿僵菌（Metarhizium pinghaense）和罗伯茨绿僵菌（Metarhizium robertsii）的液体培养瓶封口，并将每个培养瓶瓶口在火焰上灼烧10秒。拔掉发酵袋颈部的棉塞，将100毫升液体培养物倒入发酵袋中。将棉塞重新放回，并用橡皮筋将手术纸固定在袋口颈部。扭紧袋的上部，通过摇晃和按摩基质来混合袋内内容物。将袋中的基质摊平，置于约25摄氏度条件下培养，以防止形成过厚的基质层。接种并培养

mass-production-entomopathogenic-fungi-metarhizium-robertsii

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科研

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Biology

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昆虫病原真菌 Metarhizium robertsii 和 Metarhizium pinghaense 的大规模生产及其在防治害虫中的商业应用

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