Name: 使用茜素红染色检测斑马鱼幼虫中化学诱导的骨质流失 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 3 s
Description: 学习使用茜素红染色技术检测斑马鱼幼虫中醋酸铅诱导的骨质流失，建立骨骼变化永久记录。该方法可评估多种毒性物质对骨骼发育的影响，为骨质疏松研究提供可靠模型。

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本工作得到国家自然科学基金（81872646；81811540034；81573173）和江苏省高校优势学科建设工程项目（PAPD）的支持。

本文所述所有动物实验程序均已通过苏州大学伦理委员会动物护理研究所的审查和批准。
1. 鱼类饲养与胚胎收集 14
<ol>
	<li>每天喂鱼三次；确保斑马鱼在28.5 ± 0.5 °C条件下饲养，并保持14小时光照与10小时黑暗的光周期。</li>
	<li>傍晚时，在产卵缸中使用隔离板按2:1的雄雌比例将成年雄鱼和雌鱼分开。</li>
	<li>次日上午9:00移除隔离板，并在2小时后收集胚胎。</li>
	<li>将胚胎置于维持在28.5 °C的生化培养箱中，等待实验开始。</li>
</ol>
2. 化学暴露
<ol>
	<li>制备母液：称取乙酸铅三水合物（5 g），溶于超纯水（50 mL）中，搅拌至溶解。 
	警告：乙酸铅（PbAc）具有毒性。操作时需佩戴合适的防尘口罩、防护服和手套，并在通风橱内进行实验。</li>
	<li>选取斑马鱼胚胎，随机分配至洁净的6孔板中（每孔30个胚胎，加入3 mL斑马鱼养殖用水；其成分见表1），自受精后2小时（hpf）至120小时期间，分别暴露于不同浓度的PbAc溶液（0、5、10、20 mg/L）。 
	注意：PbAc的浓度选择依据剂量预实验结果。实验结果显示，在120 hpf时，乙酸铅对斑马鱼胚胎的LC50为41.044 mg/L。因此，最高浓度设定为LC50的一半，并通过2倍梯度稀释法配制一系列浓度溶液。</li>
	<li>从受精后第5天（dpf）开始，每日喂食幼鱼两次。将斑马鱼胚胎维持在28.5 ± 0.5 °C条件下，光照周期为14小时光照/10小时黑暗。</li>
	<li>每隔24小时更换一次不含铅的培养基（斑马鱼养殖用水），直至9 dpf。 
	&#8203;注意：实验结束后，所有含铅溶液均需倒入指定液体废液桶，由实验管理中心统一处理。</li>
</ol>
3. 茜素红染色
注意：在整个染色过程中，请佩戴合适的防尘口罩、防护服和手套。所有溶液的组成见表1。
<ol>
	<li>特定染色步骤 
	注意：染色过程在24孔板中于室温下进行。每次加入溶液后，将24孔板置于低速摇床上。
	<ol>
		<li>在9 dpf时，从每组中随机取出10条斑马鱼幼鱼，用1 mL的2%多聚甲醛/1×磷酸盐缓冲液固定2小时。</li>
		<li>倾去溶液，用100 mM Tris-HCl (pH 7.5)/10 mM MgCl2洗涤斑马鱼幼鱼10分钟。</li>
		<li>倾去溶液，将幼鱼依次浸入以下溶液中各5分钟以进行脱色：无水乙醇（EtOH）溶液（80% EtOH/100 mM Tris-HCl (pH 7.5)/10 mM MgCl2）、50% EtOH/100 mM Tris-HCl (pH=7.5) 和 25% EtOH/100 mM Tris-HCl (pH=7.5)。</li>
		<li>倾去溶液，用含3% H2O2和0.5% KOH的溶液漂白去除色素，每10分钟观察一次，直至色素完全去除。</li>
		<li>用25%甘油/0.1% KOH多次冲洗斑马鱼幼鱼，每次10分钟，直至无气泡产生。 
		注意：必须避免产生气泡；否则，斑马鱼体内的气泡将在显微镜下呈现为黑色视野，影响观察和定量分析。</li>
		<li>将幼鱼浸入1 mL的0.01%茜素溶液中染色50分钟。</li>
		<li>倾去溶液，加入1 mL的50%甘油/0.1% KOH处理10分钟以清除背景。随后将鱼体保存于新鲜的50%甘油/0.1% KOH溶液中，用于后续观察。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 图像采集
<ol>
	<li>每次将一条幼虫转移至载玻片上，使幼虫保持在液滴中央。</li>
	<li>在体视显微镜下观察幼虫。</li>
	<li>打开相机，启动软件（参见材料表），并保持默认设置。</li>
	<li>点击AE，选择合适的曝光时间（本实验中为60 ms），以获得最佳图像。</li>
	<li>在相同设置下采集所有图像。将图像保存为.tif格式，用于后续分析。</li>
</ol>
5. 图像分析
注意：有关图像分析的示例图表集，请参见补充文件。
<ol>
	<li>双击 ImageJ 图标，分析在步骤 4.5 中保存的图像。
	<ol>
		<li>点击 文件 | 打开，以打开在步骤 4.5 中保存的图像。</li>
		<li>点击 图像 | 类型，选择 8 位。</li>
		<li>点击 编辑 | 反转。</li>
		<li>点击 分析 | 校准，在弹出界面中选择 未校准的 OD，在下方界面左下角勾选 全局校准，然后点击 确定。</li>
		<li>点击 分析 | 设置标尺 | 点击以移除标尺，在弹出界面中勾选下方的 全局，然后点击 确定。</li>
		<li>点击 分析 | 设置测量，在弹出界面中选择 面积 项，勾选下方的 限定于阈值范围（仅测量选定范围），然后点击 确定。</li>
		<li>点击 图像 | 调整 | 阈值，拖动弹出界面中间的滑块，设置合适的阈值（每张图像需单独调整阈值），使图像中所有待测目标均被选中，然后点击 设置。</li>
		<li>点击 分析 | 测量，记录每组的数据。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>采用单因素方差分析（one-way ANOVA），随后进行 Tukey 多重比较检验以分析差异，并将显著性水平设定为 p &#60; 0.001（***）。</li>
</ol>

<ol><li>Compston, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recommendations+for+the+registration+of+agents+for+prevention+and+treatment+of+glucocorticoid-induced+osteoporosis%3A+an+update+from+the+Group+for+the+Respect+of+Ethics+and+Excellence+in+Science%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoporosis+International%22%5BJournal%5D)">Recommendations for the registration of agents for prevention and treatment of glucocorticoid-induced osteoporosis: an update from the Group for the Respect of Ethics and Excellence in Science.</a> Osteoporosis International. 19 (9), 1247-1250 (2008).</li>
<li>Rachner, T. D., Gobel, A., Jaschke, N. P., Hofbauer, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+in+preventing+bone+loss+induced+by+aromatase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Endocrinology+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Challenges in preventing bone loss induced by aromatase inhibitors.</a> Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 105 (10), (2020).</li>
<li>Kataba, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+exposure+to+environmentally+relevant+lead+levels+induces+oxidative+stress+and+neurobehavioral+alterations+in+larval+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Aquatic+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Acute exposure to environmentally relevant lead levels induces oxidative stress and neurobehavioral alterations in larval zebrafish (Danio rerio).</a> Aquatic Toxicology. 227, 105607(2020).</li>
<li>Morin, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+fracture+prevalence+and+in+bone+mineral+density+between+Chinese+and+White+Canadians%3A+the+Canadian+Multicentre+Osteoporosis+Study+%28CaMos%29%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Osteoporosis%22%5BJournal%5D)">Differences in fracture prevalence and in bone mineral density between Chinese and White Canadians: the Canadian Multicentre Osteoporosis Study (CaMos).</a> Archives of Osteoporosis. 15 (1), 147(2020).</li>
<li>Lee, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+lead+poisoning+magnifies+bone+detrimental+effects+in+an+ovariectomized+rat+model+of+postmenopausal+osteoporosis%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Toxicologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Chronic lead poisoning magnifies bone detrimental effects in an ovariectomized rat model of postmenopausal osteoporosis.</a> Experimental Toxicologic Pathology. 68 (1), 47-53 (2016).</li>
<li>Theppeang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Associations+of+bone+mineral+density+and+lead+levels+in+blood%2C+tibia%2C+and+patella+in+urban-dwelling+women%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Health+Perspectives%22%5BJournal%5D)">Associations of bone mineral density and lead levels in blood, tibia, and patella in urban-dwelling women.</a> Environmental Health Perspectives. 116 (6), 784-790 (2008).</li>
<li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoporosis+in+a+Chinese+population+due+to+occupational+exposure+to+lead%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+Industrial+Medicine%22%5BJournal%5D)">Osteoporosis in a Chinese population due to occupational exposure to lead.</a> American Journal Industrial Medicine. 51 (6), 436-442 (2008).</li>
<li>Guadalupe-Grau, A., Fuentes, T., Guerra, B., Calbet, J. A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exercise+and+bone+mass+in+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Sports+Medicine%22%5BJournal%5D)">Exercise and bone mass in adults.</a> Sports Medicine. 39 (6), 439-468 (2009).</li>
<li>Ottani, V., Raspanti, M., Ruggeri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+structure+and+functional+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Collagen structure and functional implications.</a> Micron. 32 (3), 251-260 (2001).</li>
<li>Kelly, W. L., Bryden, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+differential+stain+for+cartilage+and+bone+in+whole+mount+preparations+of+mammalian+fetuses+and+small+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Stain+Technology%22%5BJournal%5D)">A modified differential stain for cartilage and bone in whole mount preparations of mammalian fetuses and small vertebrates.</a> Stain Technology. 58 (3), 131-134 (1983).</li>
<li>Barrett, R., Chappell, C., Quick, M., Fleming, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid%2C+high+content%2C+in+vivo+model+of+glucocorticoid-induced+osteoporosis%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">A rapid, high content, in vivo model of glucocorticoid-induced osteoporosis.</a> Biotechnology Journal. 1 (6), 651-655 (2006).</li>
<li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).</li>
<li>Fernandez, I., Gavaia, P. J., Laize, V., Cancela, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fish+as+a+model+to+assess+chemical+toxicity+in+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Aquatic+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Fish as a model to assess chemical toxicity in bone.</a> Aquatic Toxicology. 194, 208-226 (2018).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+GH%2FIGF+axis+in+arsenite-induced+developmental+toxicity+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Ecotoxicology+Environmental+Safety%22%5BJournal%5D)">Role of GH/IGF axis in arsenite-induced developmental toxicity in zebrafish embryos.</a> Ecotoxicology Environmental Safety. 201, 110820(2020).</li>
<li>Bergen, D. J. M., Kague, E., Hammond, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+an+emerging+model+for+osteoporosis%3A+a+primary+testing+platform+for+screening+new+osteo-active+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as an emerging model for osteoporosis: a primary testing platform for screening new osteo-active compounds.</a> Frontiers in Endocrinology. 10, 6(2019).</li>
<li>Charles, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utility+of+quantitative+micro-computed+tomographic+analysis+in+zebrafish+to+define+gene+function+during+skeletogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Utility of quantitative micro-computed tomographic analysis in zebrafish to define gene function during skeletogenesis.</a> Bone. 101, 162-171 (2017).</li>
<li>Hammond, C. L., Moro, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+transgenic+reporters+to+visualize+bone+and+cartilage+signaling+during+development+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Using transgenic reporters to visualize bone and cartilage signaling during development in vivo.</a> Frontiers in Endocrinology. 3, 91(2012).</li>
<li>Bensimon-Brito, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+in+vivo+staining+with+alizarin+red+S--a+valuable+approach+to+analyse+zebrafish+skeletal+mineralization+during+development+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Revisiting in vivo staining with alizarin red S--a valuable approach to analyse zebrafish skeletal mineralization during development and regeneration.</a> BMC Developmental Biology. 16, 2(2016).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

斑马鱼是研究骨代谢性疾病的合适模型。与啮齿类动物模型相比，斑马鱼模型的建立相对较快，且疾病严重程度的检测更为简便。在野生型斑马鱼幼体中，头骨的矿化发生在5 dpf，轴向骨骼的矿化发生在7 dpf15。因此，到9 dpf时，前额骨（PS）、顶骨（OP）、颅基骨（CB）和鼻软骨（NC）等颅骨已充分发育。在幼体完全脱色并漂白后，软组织被清除，使鱼体呈现透明外观。加入茜素红染色试剂以将斑马鱼体内的矿化骨骼染成红色并进行可视化观察。
图像分析对于获得本实验可靠的实验结论至关重要。选择姿态良好、背景干净的斑马鱼照片进行定量分析。在对单张图像的染色区域进行量化时，将计算一条鱼中所有被染成红色的矿化骨骼区域。因此，我们可以比较铅暴露组与对照组之间的骨量变化。本研究中，醋酸铅（PbAc）暴露导致斑马鱼出现发育毒性，在9天龄时，10和20 mg/L PbAc暴露组中矿化骨骼的染色面积显著减少。因此，早期胚胎阶段暴露于PbAc会减少斑马鱼幼鱼的骨量。图1展示了通过茜素红染色显示的斑马鱼幼鱼中PbA...

近期研究表明，由糖皮质激素、芳香化酶抑制剂以及过量饮酒引起的骨质疏松较为常见1,2。铅（Pb）是一种存在于植物、土壤和水生环境中的有毒金属3。尽管铅对人體有害的影响已受到广泛关注，但其对骨骼的不可逆影响仍需进一步研究。铅中毒可导致发育中及成年骨骼发生多种病理改变，影响正常的生理活动。研究发现，长期暴露于铅环境与骨损伤之间存在关联4，包括骨结构受损5,6、骨矿物质密度降低，甚至骨质疏松风险增加7。
矿化组织对骨强度具有重要意义8，骨矿化基质的沉积是评价骨形成的关键指标9。茜素红对钙离子具有高亲和力，茜素红染色是评估骨形成的常规方法10。根据该方法，矿化组织被染成红色，而其他所有组织保持透明。随后通过数字图像分析对染色区域进行定量11。
斑马鱼是一种重要的模式生物，广泛应用于药物发现和疾病模型研究。斑马鱼与人类的遗传学研究表明，两者在骨骼形态发生分子机制方面具有相似性12。此外，与小鼠模型相比，斑马鱼的大规模繁殖特性使其更适用于高通量药物或生物分子筛选，从而促进对促成骨或成骨毒性分子的作用机制研究13。整体骨骼差异染色法in toto10常用于研究小型脊椎动物及哺乳动物胎儿的骨骼发育异常。本研究采用茜素红染色法，以检测化学物质对斑马鱼幼体骨骼发育的毒性作用。本文以铅为例，介绍一种用于检测醋酸铅诱导斑马鱼幼体骨骼缺陷的实验方案。

<table><tbody><tr><td>1 M Tris-HCl (pH=7.5)</td><td>Solarbio,北京,中国</td><td>21</td><td>用于固定</td></tr><tr><td>4% 多聚甲醛固定液</td><td>BBI,上海,中国</td><td>14</td><td>组织固定</td></tr><tr><td>10x PBS 缓冲液</td><td>BBI,上海,中国</td><td>15</td><td>用于固定</td></tr><tr><td>35% H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>永华,江苏,中国</td><td>8</td><td>去除色素</td></tr><tr><td>50 mL 离心管</td><td>AKX,江苏,中国</td><td>4</td><td></td></tr><tr><td>95% 无水乙醇</td><td>Enox,江苏,中国</td><td>2</td><td>脱色</td></tr><tr><td>茜素红（纯度 99.5%）</td><td>Solarbio,北京,中国</td><td>1</td><td>染色</td></tr><tr><td>生化培养箱</td><td>一恒,上海,中国</td><td>3</td><td>培养斑马鱼胚胎</td></tr><tr><td>电子天平</td><td>Sartorius,德国</td><td>5</td><td>称量固体原料</td></tr><tr><td>甘油（纯度 99.5%）</td><td>BBI,上海,中国</td><td>7</td><td>保存染色后的鱼</td></tr><tr><td>ImageJ（软件）</td><td>美国</td><td>9</td><td>数字分析</td></tr><tr><td>KOH（纯度 99.9%）</td><td>Sigma,美国</td><td>10</td><td>漂白液</td></tr><tr><td>三水合醋酸铅（纯度 99.5%）</td><td>阿拉丁,上海,中国</td><td>11</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2 &lt;/sub&gt;（纯度 99.9%）</td><td>阿拉丁,上海,中国</td><td>12</td><td>清洗液</td></tr><tr><td>NIS-Elements F（软件）</td><td>尼康,日本</td><td>13</td><td>观察和拍照</td></tr><tr><td>移液管</td><td>AKX,江苏,中国</td><td>18</td><td>移除胚胎和溶液</td></tr><tr><td>培养板（24 孔）</td><td>Corning,美国</td><td>17</td><td>胚胎染色容器</td></tr><tr><td>培养板（6 孔）</td><td>Corning,美国</td><td>16</td><td>胚胎培养容器</td></tr><tr><td>摇床</td><td>碧云天,中国</td><td>19</td><td>混匀溶液</td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>尼康,日本</td><td>20</td><td>观察和拍照</td></tr><tr><td>斑马鱼</td><td>苏州大学斑马鱼实验中心,苏州,中国</td><td>22</td><td>实验动物</td></tr></tbody></table>

使用茜素红染色检测化学诱导的斑马鱼幼鱼骨量减少

Using Alizarin Red Staining to Detect Chemically Induced Bone Loss in Zebrafish Larvae

铅（Pb）暴露引起的化学性骨质流失可能对人类和动物的骨骼系统造成一系列不良影响。然而，其在斑马鱼中的具体效应及作用机制尚不明确。茜素红对钙离子具有高亲和力，可用于可视化骨骼并显示骨骼矿化质量。本研究旨在通过茜素红染色法检测醋酸铅（PbAc）诱导的斑马鱼幼鱼骨质流失。斑马鱼胚胎在受精后2至120小时期间，暴露于一系列浓度的PbAc（0、5、10、20 mg/L）中。在受精后第9天对幼鱼进行整体骨骼染色，并使用ImageJ软件定量分析总染色面积。结果显示，矿化组织呈红色染色，PbAc暴露组的染色面积显著减少，且骨骼矿化程度呈现剂量依赖性变化。本文提供了一种用于研究PbAc诱导骨骼缺陷中骨骼变化的染色方案。该方法也可用于斑马鱼幼鱼中其他化学物质诱导骨质流失的检测。

茜素红染色是一种用于检测斑马鱼幼鱼骨矿化变化的灵敏且特异的方法。本研究中，我们观察到乙酸铅（PbAc）对斑马鱼幼鱼具有不良影响，包括死亡、畸形、心率降低以及体长缩短。此外，通过评估斑马鱼幼鱼的矿化骨骼区域，以检测PbAc诱导的骨量减少。在受精后9天（图1A），头部骨骼的许多结构已发生矿化，因而呈现红色染色，例如副蝶骨（PS）、鳃盖骨（OP）、角鳃骨（CB）和脊索（NC）。相比之下，耳石（OT）（非骨性结构）呈棕黑色而非红色。通过数字图像分析对每张图像中的总染色面积进行定量。与对照组相比，经10和20 mg/L PbAc处理的乙酸铅组染色面积显著减少（p &lt; 0.001）（图1B）。骨矿化的变化呈剂量依赖性。
<img alt="显微鱼类结构分析，PbAc暴露，示意图；柱状图显示矿化程度降低。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63...

在此，我们采用茜素红染色法证明乙酸铅暴露可导致斑马鱼幼鱼的骨量发生变化。该染色方法可适用于研究其他有害毒物诱导的斑马鱼幼鱼骨量减少。

由于铅（Pb）暴露引起的化学性骨质流失可能对人类和动物的骨骼系统造成一系列不良影响。然而，……

该方法可用于检测化学物质在斑马鱼中引起的骨毒性。对固定组织进行茜素红染色可永久记录骨骼变化，便于对多个样本进行比较。该技术可能有助于研究斑马鱼模型中的骨质疏松症，因为骨质疏松症的特征之一是骨量减少。在受精后第九天，从每组中随机取出10条斑马鱼幼鱼，用1毫升2%多聚甲醛和1×PBS固定2小时。倾去溶液，使用pH为7.5的100毫摩尔Tris HCl或10毫摩尔氯化镁洗涤斑马鱼幼鱼。进行脱色时，倾去溶液，按照文稿中所述，将幼鱼在一系列溶液中依次孵育，每次5分钟。最后一次孵育后，倾去溶液，并用含有3%过氧化氢和0.5%氢氧化钾的溶液漂白以去除色素。每10分钟观察一次，直至色素完全去除。用25%甘油、0.1%氢氧化钾溶液清洗斑马鱼幼体数次，每次10分钟，直至无气泡产生。将幼虫浸入1毫升0.01%茜素溶液中染色。倾去溶液，加入1毫升50%甘油或0.1%氢氧化钾以清除背景。将鱼样保存于新鲜的50%甘油或0.1%氢氧化钾溶液中，以备后续观察。每次转移一只幼虫至载玻片上，使幼虫保持在液滴中央。在体视显微镜下观察幼虫。打开相机。打开软件，并保持默认设置。点击AE，选择合适的曝光时间以获得最佳图像。在相同设置下采集所有图像。将图像保存为 .tiff 格式，以供后续分析。双击 ImageJ 图标。要分析已保存的图像，请点击文件，然后点击打开，再点击图像，选择类型并选中八位。单击编辑，然后选择反相。单击分析，再选择校准。在弹出的界面中选择未校准的吸光度（Uncalibrated OD）。在下部界面的左下角检查全局校准，然后单击确定。单击分析，设置比例尺，然后移除比例尺。在下方勾选全局，然后单击确定。单击“分析”，然后设置测量参数。在弹出界面中选择项目面积。勾选下方的“限制为阈值”以仅测量选定范围，然后单击“确定”。单击图像，进行调整，然后设置阈值，滑动弹出界面中间的滑块。选择合适的阈值，以确保图像中所有待检测的目标均被选中，然后单击“设置”。点击分析，然后进行测量，并保存数据。茜素红染色是一种用于检测斑马鱼幼鱼骨骼矿化变化的灵敏且特异的方法。受精后第九天，头部骨骼的许多结构，如副蝶骨、鳃盖骨、角鳃骨和脊索，均已发生矿化，因此被染成红色。相比之下，非骨性结构（如耳石）呈棕黑色。通过对总染色面积进行数字分析，结果显示，10 和 20 毫克/升醋酸铅处理组的染色面积显著减少。骨矿化的变化呈现出剂量依赖性。为了获得更好的染色效果和观察效果，必须去除斑马鱼幼虫原有的色素，并在漂白后去除气泡。

using-alizarin-red-staining-to-detect-chemically-induced-bone-loss

Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

使用茜素红染色检测斑马鱼幼虫中化学诱导的骨质流失

本视频演示了一种染色技术，用于检测培养的原代成骨细胞中矿化或钙沉积程度，所用染料为茜素红（Alizarin...

茜素红染色：一种用于可视化培养成骨细胞矿化作用的技术

在本视频中，我们介绍一种利用阴离子染料茜素红S检测成骨细胞分泌的钙沉积物的方法。培养的成骨细胞首先经染色处理，随后回收染料，通过比色法对钙沉积物进行定量分析，以评估成骨细胞矿化的程度。...

体外矿化检测：通过茜素红S染色与提取进行比色法定量分析骨移植替代材料上成骨细胞钙沉积

由于许多神经系统和非神经系统疾病的斑马鱼模型是在成年鱼而非胚胎/幼鱼中进行研究的，我们开发了一种可应用于成年斑马鱼疾病模型的定量侧线再生检测方法。该检测方法包括在1）神经丘和2）单个毛细胞水平上的评估。...

成年斑马鱼侧线再生检测方法

本研究中，我们介绍了一种对斑马鱼幼鱼进行伊文思蓝染料（EBD）分析的简便方法。该技术是表征骨骼肌完整性和建立斑马鱼肌肉营养不良模型的有力工具，也是开发新型治疗手段的重要方法。...

伊文思蓝染色法分析斑马鱼幼鱼骨骼肌完整性

小型实验鱼类已成为研究人类骨骼疾病机制及筛选骨调节药物的流行模型。本报告中，我们描述了一种评估阿仑膦酸钠对骨质疏松病变青鳉幼鱼骨细胞作用的实验方案。...

药物处理与 在体 内 青鳉鱼骨质疏松模型中成骨细胞与破骨细胞相互作用的成像研究

本实验方案的目的是通过选择性育种改变斑马鱼致死性骨骼突变表型的外显率。致死性突变体无法生长至成年并进行自交繁殖，因此本方案描述了一种通过子代检测在多代中追踪和选择外显率的方法。...

通过子代检测改变斑马鱼致死性骨骼突变体的外显率

本文介绍了3种成年斑马鱼损伤模型及其与免疫抑制药物治疗的联合应用。我们提供了再生组织成像以及其中骨矿化检测的技术指导。...

成年斑马鱼损伤模型用于研究泼尼松龙在骨组织再生中的作用

本方案描述了斑马鱼硬鳞的收获与可视化方法 体内 再生。此外， 离体...

斑马鱼鳞片再生 整体上 和 离体 鳞片培养

本方案提供了一种利用简单方法研究细胞动态的技术 体外...

斑马鱼鳞片中细胞动态的体外培养技术

本方案描述了一种在斑马鱼幼鱼中进行的双光子激光消融方法，该模型可用于研究骨再生以及免疫反应对消融的影响。...

利用双光子激光消融发育期斑马鱼幼鱼中的成骨细胞

本文所述方案提供了一种简单且易于操作的方法，用于对5日龄斑马鱼幼鱼的颅面软骨进行染色和解剖。该方法可用于在不同发育条件下研究这些结构的解剖形态、形状和大小。...

用阿尔新蓝染色后斑马鱼颅面组织的解剖

学习使用茜素红染色技术检测斑马鱼幼虫中醋酸铅诱导的骨质流失，建立骨骼变化永久记录。该方法可评估多种毒性物质对骨骼发育的影响，为骨质疏松研究提供可靠模型。

使用茜素红染色检测化学诱导的斑马鱼幼鱼骨量减少

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