使用茜素红染色检测化学诱导的斑马鱼幼鱼骨量减少
2021年12月28日
在此，我们采用茜素红染色法证明乙酸铅暴露可导致斑马鱼幼鱼的骨量发生变化。该染色方法可适用于研究其他有害毒物诱导的斑马鱼幼鱼骨量减少。
该方法可用于检测化学物质在斑马鱼中引起的骨毒性。对固定组织进行茜素红染色可永久记录骨骼变化，便于对多个样本进行比较。该技术可能有助于研究斑马鱼模型中的骨质疏松症，因为骨质疏松症的特征之一是骨量减少。
在受精后第九天，从每组中随机取出10条斑马鱼幼鱼，用1毫升2%多聚甲醛和1×PBS固定2小时。倾去溶液，使用pH为7.5的100毫摩尔Tris HCl或10毫摩尔氯化镁洗涤斑马鱼幼鱼。进行脱色时，倾去溶液，按照文稿中所述，将幼鱼在一系列溶液中依次孵育，每次5分钟。
最后一次孵育后，倾去溶液，并用含有3%过氧化氢和0.5%氢氧化钾的溶液漂白以去除色素。每10分钟观察一次，直至色素完全去除。用25%甘油、0.1%氢氧化钾溶液清洗斑马鱼幼体数次，每次10分钟，直至无气泡产生。
将幼虫浸入1毫升0.01%茜素溶液中染色。倾去溶液，加入1毫升50%甘油或0.1%氢氧化钾以清除背景。将鱼样保存于新鲜的50%甘油或0.1%氢氧化钾溶液中，以备后续观察。
每次转移一只幼虫至载玻片上，使幼虫保持在液滴中央。在体视显微镜下观察幼虫。打开相机。
打开软件，并保持默认设置。点击AE，选择合适的曝光时间以获得最佳图像。在相同设置下采集所有图像。
将图像保存为 .tiff 格式，以供后续分析。双击 ImageJ 图标。要分析已保存的图像，请点击文件，然后点击打开，再点击图像，选择类型并选中八位。
单击编辑，然后选择反相。单击分析，再选择校准。在弹出的界面中选择未校准的吸光度（Uncalibrated OD）。
在下部界面的左下角检查全局校准，然后单击确定。单击分析，设置比例尺，然后移除比例尺。在下方勾选全局，然后单击确定。
单击“分析”，然后设置测量参数。在弹出界面中选择项目面积。勾选下方的“限制为阈值”以仅测量选定范围，然后单击“确定”。
单击图像，进行调整，然后设置阈值，滑动弹出界面中间的滑块。选择合适的阈值，以确保图像中所有待检测的目标均被选中，然后单击“设置”。
点击分析，然后进行测量，并保存数据。茜素红染色是一种用于检测斑马鱼幼鱼骨骼矿化变化的灵敏且特异的方法。受精后第九天，头部骨骼的许多结构，如副蝶骨、鳃盖骨、角鳃骨和脊索，均已发生矿化，因此被染成红色。
相比之下，非骨性结构（如耳石）呈棕黑色。通过对总染色面积进行数字分析，结果显示，10 和 20 毫克/升醋酸铅处理组的染色面积显著减少。骨矿化的变化呈现出剂量依赖性。
为了获得更好的染色效果和观察效果，必须去除斑马鱼幼虫原有的色素，并在漂白后去除气泡。
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概述
本研究利用茜素红染色证明，醋酸铅暴露会导致斑马鱼幼鱼骨量发生变化。该方法可适用于研究多种有害毒物引起的骨丢失。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 毒理学
- 发育生物学
背景
- 茜素红染色是一种用于观察骨骼结构的技术。
- 斑马鱼是研究骨骼发育和毒性的模式生物。
- 乙酸铅已知对生物系统具有毒性作用。
- 骨质疏松症的特征是骨量减少，该病症可在斑马鱼中建立模型进行研究。
研究目的
- 评估醋酸铅对斑马鱼幼虫骨量的影响。
- 建立一种检测化学物质诱导骨毒性的方法。
- 促进不同样本间骨骼变化的比较。
使用的方法
- 固定斑马鱼组织的茜素红染色。
- 使用多聚甲醛和PBS固定斑马鱼幼体。
- 用Tris HCl或氯化镁洗涤幼体。
- 按照文稿中所述进行脱色步骤。
主要结果
- 醋酸铅暴露导致骨量出现可观察到的变化。
- 染色方法为骨骼变化提供了永久记录。
- 研究结果支持使用斑马鱼作为研究骨质疏松症的模型。
- 该方法学可用于探究其他有害毒物的影响。
结论
- 茜素红染色法对评估斑马鱼的骨毒性具有良好的效果。
- 本研究强调了斑马鱼在毒理学研究中的潜力。
- 未来的研究可进一步拓展各类毒物对骨骼健康影响的探讨。
常见问题
行业高层相关性
该方法能够实现对化学诱导的斑马鱼幼鱼骨量减少的早期检测，有助于毒理学中的机制性风险排除以及骨骼健康通路的靶点验证。通过茜素红染色定量矿化组织的变化，可提供一种可重复、剂量依赖性的读数，用于评估化合物对骨矿化的影响。该方法有助于在先导化合物优化及骨活性化合物的临床前安全性筛选中建立预测性信心。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：能够验证与骨矿化和骨骼完整性相关的治疗假设。
- 操作价值：通过提供跨样本的骨骼变化的永久性、可量化记录，支持生物学风险降低。
- 预测价值：可在药物发现早期识别对骨量具有剂量依赖性效应的化合物，从而促进项目组合的筛选。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：提供基于定量阈值的染色区域测量，实现不同处理组之间的客观比较。
- 操作价值：标准化样本制备和成像流程，确保在多孔板格式中的可重复性和可扩展性。
- 检测适用性：生成与 ImageJ 分析兼容的数字输出，支持对骨毒性表型进行高内涵筛选。
转化与临床前研究
- 科学价值：模拟人类相关的骨骼对毒物的反应，支持骨丢失相关转化生物标志物的比对。
- 操作价值：通过提供一种保守的、基于脊椎动物的骨矿化检测方法，连接发现阶段与临床前研究流程。
- 风险缓解：在开展哺乳动物研究之前检测到骨丢失信号，从而为风险调整后的研发推进决策提供依据。
流程与工作流整合
该方法适用于从靶点验证到先导化合物筛选直至临床前安全性评价的整个发现流程，尤其适用于对骨骼系统具有潜在脱靶效应的化合物。
- 发现生物学：支持在脊椎动物模型中对化学物质对骨骼发育和矿化通路影响的假设验证。
- 筛选：实现检测染色区域剂量依赖性变化的定量读数和检测方法的标准化。
- 分析：提供经过校准的、基于阈值的面积测量，允许在不同条件下对骨骼矿化程度进行统计学比较。
- 转化研究：通过斑马鱼幼体模拟对毒物保守的骨骼反应，连接临床前研究的连续性。
- 企业级复用：建立一个可重复使用的平台，用于筛选多种化合物库的骨骼毒性风险。
运营与企业影响
- 科学价值：通过降低骨相关通路中的机制模糊性，提高靶点验证的预测可信度。
- 操作价值：通过标准化的固定、染色和数字化定量步骤，增强实验的可重复性和可扩展性。
- 战略价值：通过提供早期、定量的骨丢失风险信号，优化决策流程中的立项或终止判断。
- 项目组合影响：在投入大量资源前识别出骨骼毒性风险，支持基于风险调整的优先级排序。
实施注意事项
- 需要具备斑马鱼操作、组织学以及荧光/比色成像方面的专业知识。
- 依赖体视显微镜和图像分析软件（例如 ImageJ）进行标准化定量。
- 为获得可重复的结果，需在不同团队间统一染色方案和阈值设定。
- 在将该方法拓展至其他模式系统或除乙酸铅以外的化学物质类别时，需考虑适应性调整。
- 由于需要去除色素并进行背景清除步骤以确保信号检测的准确性，存在一定的局限性。
