Name: 小鼠原代肺内皮细胞的分离 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 41 s
Description: 学习使用磁珠分选和荧光激活细胞分选技术分离小鼠原代肺内皮细胞的方法。该技术可获得高纯度CD31阳性细胞，适用于血管生物学功能研究和内皮细胞功能障碍治疗靶点发现。

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本工作由 NIH T32GM008440（JH/EW）和 NIH R01AI058106（JH）资助。我们感谢加州大学旧金山分校（UCSF）Parnassus 流式细胞术核心设施（RRID:SCR_018206），该设施部分由 NIH P30 DK063720 基金以及 NIH S10 仪器基金 S10 1S10OD021822-01 支持。

所有动物实验程序均经加州大学旧金山分校机构动物护理和使用委员会批准。研究使用雄性C57BL/6新生小鼠（5-7日龄）。整个实验方案需时7-10天（图1）。
1. 内皮细胞培养基的制备
<ol>
	<li>配制基础培养基：在含有4,500 mg/L葡萄糖和4 mM L-谷氨酰胺的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中，加入20%（v/v）热灭活胎牛血清、100 U/100 μg/mL青霉素/链霉素以及25 mM HEPES（参见材料表）。使用22 μm滤膜进行无菌过滤。将基础培养基于4 °C保存，并在配制后一个月内使用。</li>
	<li>配制完全培养基：在基础培养基中添加100 μg/mL肝素、100 μg/mL内皮细胞生长补充物、1×非必需氨基酸以及1 mM丙酮酸钠（参见材料表）。使用22 μm滤膜进行无菌过滤。于4 °C保存，并在配制后一个月内使用。</li>
</ol>
2. 抗大鼠磁珠的预包被13
<ol>
	<li>配制 50 mL 磁珠洗涤缓冲液：在磷酸盐缓冲液（PBS）中添加 0.1%（w/v）牛血清白蛋白（BSA）。使用 22 μm 滤膜无菌过滤，4 °C 保存，并在配制后一个月内使用。</li>
	<li>将磁珠涡旋震荡数秒以重悬，用移液器吸取 50 μL 磁珠（2 × 107 个磁珠）加入两个 1.5 mL 微量离心管中，分别用于 CD-31 和 CD-102（参见材料表）。每管加入 1 mL 磁珠洗涤缓冲液，充分混匀。 
	注意：上述所有体积适用于从 3–4 只新生小鼠仔鼠（5–7 日龄）中分离内皮细胞。CD-31 和 CD-102 是用于磁性免疫磁珠筛选的内皮细胞表面标志物。</li>
	<li>将离心管置于磁力架上，用玻璃巴斯德吸管吸除上清液。每次用 1 mL 磁珠洗涤缓冲液重复洗涤 3 次。</li>
	<li>用磁珠洗涤缓冲液将磁珠重悬至原始体积（50 μL），然后每 50 μL 磁珠悬液中加入 5 μL（2.5 μg）抗体（CD-31/CD-102）。</li>
	<li>将磁珠悬液置于 4 °C 下轻轻旋转（翻转式旋转仪）孵育过夜，或室温孵育 3 小时。重复洗涤 4 次。</li>
	<li>用磁珠洗涤缓冲液将免疫磁珠重悬至原始体积（50 μL），4 °C 保存，1–2 周内使用。</li>
</ol>
3. 肺细胞的分离与接种
<ol>
	<li>在分离当天制备 I 型胶原酶溶液：将 25 mg I 型胶原酶加入 25 mL HBSS 中（见材料表）。在 37 °C 下轻轻旋转孵育 1 小时，并使用 22 μm 滤器进行无菌过滤。将溶液保持在 37 °C 的温热状态。</li>
	<li>在安乐死前 10 分钟，对出生后 5–7 天的小鼠幼崽进行肌肉注射肝素（每只小鼠 25 μL，1,000 U/mL），以最小化内皮细胞活化和血凝块形成14,15。</li>
	<li>根据 2020 年 AVMA 安乐死指南，使用&#160;锋利的剪刀通过断头法处死小鼠幼崽。然后，&#160;将小鼠腹侧朝上固定在解剖板上。</li>
	<li>用 70% 乙醇喷洒尸体，然后先剪开膈肌，再沿胸壁两侧向上剪开，暴露胸腔。将肋骨向后翻起，即可暴露心脏和肺脏。 
	注：由于新生小鼠体型较小，此步骤应使用更小的镊子和剪刀，并注意不要刺破心脏或肺脏，以免影响肺内血液的充分清除。</li>
	<li>将 25 G 针头连接至 10 mL 注射器，向心脏右心室注入 5 mL 冷 DMEM，以清除肺部血液。肺组织将变为白色。</li>
	<li>逐叶剪断各肺叶支气管远端，将肺叶从胸腔中取出。</li>
	<li>将所有肺叶收集至一个预先加入 20 mL 冰冷基础培养基（步骤 1.1）的 50 mL 锥形管中。</li>
	<li>对其他小鼠幼崽重复步骤 3.2–3.7，将所有肺叶收集至同一个 50 mL 锥形管中。</li>
	<li>用手轻轻振荡管子 10–15 秒，以去除肺表面肉眼可见的多余红细胞。 
	注：无需完全清除肺组织内部或周围的血液，但此步骤可提高纯度。后续所有组织操作均需在无菌操作台中进行。</li>
	<li>使用细胞筛网将肺组织从培养基中取出，转移至无菌的一次性 100 mm 直径组织培养皿中，并用灭菌剪刀剪碎。</li>
	<li>将剪碎的组织转移至含有 25 mL 预热胶原酶溶液（步骤 3.1）的 50 mL 锥形管中。在 37 °C 下于旋转混合器上轻柔振荡孵育 45 分钟。 
	注：即使过度消化 60 分钟也可能导致得率降低。</li>
	<li>将 20 mL 注射器连接至 15 G 钝头套管（见材料表），反复吹打悬液 10–15 次，使组织分散为单细胞悬液。操作应充分有力，但避免产生过多泡沫。 
	注：此步骤完成后，不应再观察到可见的肺组织碎片，悬液将呈现浑浊状态。</li>
	<li>将悬液通过 70 μm 细胞筛网过滤至新的 50 mL 锥形管中。随后，用额外的 15 mL 基础培养基冲洗用于消化的锥形管及细胞筛网。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，以 400 × g 离心 8 分钟。</li>
	<li>用玻璃巴斯德吸管吸除上清液，将沉淀重悬于 2 mL 完全培养基中。转移至 T-75 培养瓶，加入 8 mL 完全培养基，在 37 °C、5% CO2 的加湿培养箱中培养。</li>
	<li>次日，用不含钙和镁的 Hank's 平衡盐溶液（HBSS/CMF）（见材料表）洗涤培养瓶两次，每次 10 mL，并加入 10 mL 完全培养基。 
	&#8203;注：培养 2–3 天后，细胞融合度可达 90–95%，可用于初次免疫磁珠分离。</li>
</ol>
4. 内皮细胞的免疫磁珠初代分离与培养
<ol>
	<li>用 10 mL HBSS/CMF 将贴壁的内皮细胞洗涤两次。加入 2 mL 无胰酶细胞解离液（见材料表），在 37 °C 下孵育约 5 分钟。确保所有细胞均已从培养瓶中脱落。 
	注意：必须使用无胰酶的解离液而非胰酶，因为胰酶可能破坏细胞表面黏附标志物 CD-31。</li>
	<li>加入 8 mL 基础培养基以中和细胞解离液，并将内容物转移至 15 mL 圆锥形离心管中。在室温下以 400 × g 离心 4 分钟。</li>
	<li>使用玻璃巴斯德吸管吸除上清液，并将细胞重悬于 2 mL 基础培养基中。将 2 mL 细胞悬液转移至 5 mL 圆底聚苯乙烯管中（见材料表）。</li>
	<li>涡旋振荡抗 CD-31 包被的磁珠数秒以重悬磁珠，每 2 mL 细胞悬液加入 30 μL 磁珠。盖紧管盖。</li>
	<li>将管子置于翻转混合仪上，在室温下孵育 10 分钟。然后将管子置于磁力分离器上，静置 2 分钟。</li>
	<li>使用玻璃巴斯德吸管轻轻吸走上清液。将管子从磁铁上取下，向管中加入 3 mL 基础培养基，通过反复吹打重悬磁珠-细胞沉淀。</li>
	<li>将管子再次放回磁力分离器上静置 2 分钟，然后使用玻璃巴斯德吸管小心吸走上清液。</li>
	<li>重复洗涤步骤（步骤 4.6–4.7）至少 4 次，直至上清液变得澄清。</li>
	<li>最后一次洗涤后，将磁珠-细胞沉淀重悬于 3 mL 完全生长培养基中，并转移至 T-75 培养瓶。加入 7 mL 完全生长培养基，在 37 °C、含 5% CO2 的湿润培养箱中孵育。</li>
	<li>次日用 HBSS/CMF 洗涤细胞，然后加入 10 mL 新鲜完全培养基。&#160;每 2–3 天更换一次培养基，每次加入 10 mL 新鲜完全培养基，直至细胞融合度达到 90–95%。 
	&#8203;注意：当细胞融合度达到约 90–95% 时（约需 3–4 天），培养物即可用于二次免疫磁珠分离。</li>
</ol>
5. 内皮细胞的二次免疫磁珠分离与培养
<ol>
	<li>用 10 mL HBSS/CMF 溶液洗涤贴壁内皮细胞两次。加入 2 mL 无胰蛋白酶细胞解离溶液，在 37 °C 下孵育约 5 分钟。确保所有细胞均已从培养瓶中脱落。</li>
	<li>加入 8 mL 基础培养基以中和细胞解离溶液，并转移至 15 mL 圆锥形离心管中。在室温下以 400 × g 离心 4 分钟。</li>
	<li>使用玻璃巴斯德吸管移除上清液，并将细胞重悬于 2 mL 基础培养基中。将 2 mL 细胞悬液转移至 5 mL 圆底聚苯乙烯管中。</li>
	<li>涡旋抗 CD-102 包被的磁珠数秒以重悬磁珠，并为每 2 mL 细胞悬液加入 30 μL 磁珠。盖紧管盖。</li>
	<li>将管子置于翻转摇床（end-over-end rotator）上，在室温下孵育 10 分钟。将管子置于磁力架上静置 2 分钟，然后使用玻璃巴斯德吸管轻轻吸走上清液。</li>
	<li>将管子从磁力架上取下，向管中加入 3 mL 基础培养基，重悬磁珠-细胞沉淀，并反复吹打数次。</li>
	<li>再次将管子放回磁力架上静置 2 分钟，然后小心使用玻璃巴斯德吸管吸走上清液。</li>
	<li>重复洗涤步骤（步骤 5.6–5.7）4 次或更多次，直至上清液变得澄清。</li>
	<li>最后一次洗涤后，将磁珠-细胞沉淀重悬于 3 mL 完全生长培养基中，并转移至 T-75 培养瓶。加入 7 mL 完全生长培养基，在 37 °C、含 5% CO2 的湿润培养箱中孵育。</li>
	<li>次日用 HBSS/CMF 洗涤细胞，然后加入 10 mL 新鲜完全培养基。每 2–3 天更换一次培养基，每次加入 10 mL 新鲜完全培养基，直至细胞融合度达到 90–95%。当内皮细胞完全融合后，即可用于实验。细胞传代不应超过第六代，以免发生衰老，或其他细胞类型占据优势。</li>
</ol>
6. 通过流式细胞术确认内皮细胞表面标志物
<ol>
	<li>使用无胰蛋白酶的细胞解离溶液解离细胞后，将细胞沉淀重悬至 1 x 105 个细胞/mL，取 100 μL 细胞悬液分装至三支 1.5 mL 微量离心管中，分别标记为 1、2 和 3 号管。</li>
	<li>用 1 mL 的 1× PBS 洗涤细胞，于 4 °C 下以 500 × g 离心 2 分钟，弃去上清液，重复洗涤两次。</li>
	<li>将细胞沉淀重悬于 100 μL 的 1× PBS 中。向 1 号管中加入 1 μL 偶联的抗小鼠 CD-31（PECAM-1）抗体（例如：藻红蛋白（PE）标记的抗小鼠 CD-31 抗体）和 1 μL 偶联的抗小鼠 CD-102（ICAM-2）抗体（例如：异硫氰酸荧光素（FITC）标记的抗小鼠 CD102 抗体）（参见 材料表）。向 2 号管中加入相应同型对照抗体。3 号管不加染色剂，保持未染色状态。</li>
	<li>将各管置于冰上避光孵育 30–45 分钟。</li>
	<li>每管加入 1 mL PBS，轻轻涡旋混匀，于 4 °C 下以 500 × g 离心 2 分钟，弃去上清液，重复洗涤三次。最后将沉淀重悬于 500 μL PBS 中。</li>
	<li>用铝箔纸包裹各管，于 4 °C 保存直至上机分析。分析应在 3–4 小时内完成。</li>
	<li>使用流式细胞仪采集数据。以未染色样本作为空白对照，根据细胞自发荧光情况正确设置激光电压。通过前向散射光（FSC）和侧向散射光（SSC）图门控总细胞群。 
	注意：排除双联体后，CD31+ CD102+ 双阳性细胞定义为内皮细胞。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

该简单方案可从鼠肺中获得高纯度的内皮细胞。尽管从开始到结束的总时长为7-10天，但实际操作时间约为3-4小时。与其他方法13,14,15,16相比，本方案经过优化，保留了关键步骤，同时不降低得率和纯度。
值得注意的是，本方案中有一些关键要点。首先，必须使用新生小鼠而非成年小鼠。根据我们的经验，成年小鼠来源的内皮细胞增殖能力不如新生小鼠，且容易被具有纺锤形形态、符合成纤维细胞或间充质干细胞特征的细胞所过度生长而污染15,16。造成这种差异的可能原因是，新生小鼠肺部正处于肺泡发育阶段，其内皮细胞增殖速度较快20。此外，随着年龄增长，细胞可能在一定程度上出现衰老现象21。酶消化时间也必须精确控制：消化不足会导致单细胞悬液得率偏低；而过度消化则会引起大量细胞死亡。我们确定胶原酶消化的最佳时间为45分钟，随后使用钝头套管进行机械解离。已有文献报道在酶消化过程中通过气管内灌注胶原酶的方法14,15；然而，该方法较为耗时，在本研究中会导致消化不完全。最后，部分方案在酶消化后直接进行免疫磁珠分离13,16。但我们发现&#160;，在进行免疫磁珠筛选前，先将解离所得肺组织细胞在培养基中培养一至两天，可显著提高存活率高且纯度高的内皮细胞的收获量。这一现象可能与将分离细胞尽快接入组织培养基的速度有关，从而减少了从小鼠体内取出后早期阶段的细胞死亡，提高了初始接种密度，并为内皮细胞在首次免疫磁珠分离前提供足够的时间以贴壁并增殖。
小鼠内皮细胞制备与分析的局限性如下：每只小鼠仅能提供有限数量的细胞，且这些细胞必须在少数几代传代内使用。这一问题可通过合并多只小鼠的肺组织消化液来克服。遗憾的是，我们未能成功冻存并复苏这些细胞以供后续使用。尽管存在这些局限性，小鼠内皮细胞仍具有一些优势。它们在某些情况下尤为有用，例如当人源内皮细胞无法使用时（如基因敲除实验），或需要与人源细胞结果相互验证的互补性研究，或当不同人源供体来源的内皮细胞反应异质性导致实验间重复性困难时6。来自遗传背景一致的小鼠的同质性内皮细胞群体，可在稳定背景下实现实验间的可重复性，并有利于对特定基因和信号通路进行研究。
小鼠内皮细胞可用于多种研究，以深入了解不同疾病过程中内皮细胞的活化与功能障碍。例如，在脓毒症中，内皮细胞发挥着关键作用，通过介导局部和全身性炎症反应、促进白细胞在组织中的迁移与活化、调节凝血过程以及调控内皮通透性，参与有益和病理性的生理反应2,22,23。本简单实验方案可提供具有活性和功能的内皮细胞，适用于上述各项内皮细胞功能的研究实验。

近年来，人们对研究血管内皮细胞的兴趣日益增加，因为微血管内皮细胞功能障碍出现在多种人类疾病中，例如中风、心血管疾病、糖尿病、急性肺损伤、脓毒症以及非感染性损伤1,2,3,4,5。为了明确这些疾病的发病机制，并理解特定基因在保护性及失调性内皮细胞反应中的作用，迫切需要建立可靠的方法，以从鼠类中分离并培养高纯度的微血管内皮细胞。尽管许多研究使用人源内皮细胞，如人脐静脉内皮细胞（HUVEC）或人肺微血管内皮细胞（HMVEC），但使用小鼠内皮细胞研究内皮功能与功能障碍具有多个优势。首先，来自不同人源供体的内皮细胞在反应上存在显著异质性，导致个体实验之间结果的变异性6,7,8。其次，在原代人源细胞系中沉默目标基因也可能导致蛋白表达水平的不一致9,10。相比之下，若实验组间遗传背景一致，则小鼠内皮细胞的反应异质性极小11。此外，可通过汇集多只新生小鼠的肺组织来制备大量小鼠内皮细胞。这些因素使得实验间的结果更加一致且可重复。最后，基因敲除或转基因小鼠的可获得性，也为分离缺乏特定目标蛋白的细胞类型提供了可能。
使用已发表方法分离健康且纯度较高的小鼠肺内皮细胞所面临的重要挑战12,13,14,15,16 从而开发出一种更可靠且简便的方法，用于分离高质量的小鼠肺微血管内皮细胞。本方案的优势包括使用易于获得的新生小鼠，从而减少动物饲养和维护成本。此外，根据我们的经验，新生小鼠来源的内皮细胞活力显著高于成年小鼠来源的内皮细胞。由于新生小鼠肺组织量较小，可通过以下方法收获内皮细胞&#160;消化&#160;将切除的肺组织放入胶原酶中&#160;而不是采用推荐用于成年小鼠取材的气管内灌注胶原酶的方法16这还能缩短小鼠安乐死后将其内皮细胞接种至细胞培养基并放入培养箱所需的时间，且不影响内皮细胞的纯度、得率或内皮反应的可重复性。最后，无需使用流式细胞术即可分离获得高纯度的细胞群体，避免了该技术可能对内皮细胞造成的损伤或导致细胞得率降低的问题。14,15,17.
当前改进的方案在7-10天内 consistently 获得高纯度且具有活性的内皮细胞，可立即用于 体外 实验。直接从基因敲除动物中分离细胞还能在实验前最大限度地减少对细胞的干预。这些方法可用于研究各种蛋白质在内皮功能中的作用，从而发现基于内皮细胞的多种疾病治疗靶点。

<table><tbody><tr><td>50 mL 离心管</td><td>康宁生命科学</td><td>430829</td><td></td></tr><tr><td>Accutase 细胞解离液</td><td>Innovative Cell Technologies, Inc</td><td>AT-104</td><td></td></tr><tr><td>BD PrecisionGlide 针头 25 G × 5/8&quot;</td><td>Becton Dickinson</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>BioRender.com</td><td>BioRender</td><td></td><td></td></tr><tr><td>钝头套管针 15 G × 1-1/2&quot;</td><td>Covidien</td><td>8881202314</td><td></td></tr><tr><td>CD-102 大鼠抗小鼠单克隆抗体（3C4 (MIC2/4)）</td><td>BD 生物科学</td><td>553326</td><td></td></tr><tr><td>CD-31 大鼠抗小鼠（MEC 13.3）</td><td>BD 生物科学</td><td>557355</td><td></td></tr><tr><td>I型胶原酶</td><td>沃辛顿生化公司</td><td>LS004194</td><td></td></tr><tr><td>DMEM，高糖</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads 羊抗大鼠 IgG</td><td>Invitrogen</td><td>11035</td><td></td></tr><tr><td>内皮细胞生长补充剂</td><td>EMD Millipore Corp</td><td>02-102</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 细胞筛（70 &amp;micro;m)</td><td>康宁生命科学</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清，热灭活</td><td>Gibco</td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>精细剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>14060-09</td><td></td></tr><tr><td>精细剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>14060-10</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 一次性硼硅酸盐玻璃巴斯德吸管</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20B</td><td></td></tr><tr><td>FITC 标记大鼠抗小鼠 CD102（3C4）</td><td>BD 生物科学</td><td>557444</td><td></td></tr><tr><td>FITC 大鼠 IgG2a，&amp;nbsp;&amp;kappa; 同型对照（R35-95）</td><td>BD 生物科学</td><td>553929</td><td></td></tr><tr><td>格拉夫镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11050-10</td><td></td></tr><tr><td>HBSS，无钙，无镁，无酚红</td><td>Gibco</td><td>14175095</td><td></td></tr><tr><td>肝素钠注射液（1,000 单位/毫升）</td><td>Medline</td><td>0409-2720-02</td><td></td></tr><tr><td>来自猪肠黏膜的肝素钠盐</td><td>Sigma</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Gibco</td><td>15630106</td><td></td></tr><tr><td>非必需氨基酸（100倍）</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>PE 小鼠抗小鼠 CD31（MEC 13.3）</td><td>BD 生物科学</td><td>553373</td><td></td></tr><tr><td>PE 大鼠 IgG2a&amp;nbsp; &amp;kappa;&amp;nbsp;同型对照 R35-95</td><td>BD 生物科学</td><td>553930</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（10,000 U/mL，10,000 &amp;micro;g/mL</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>重组小鼠IFN-&amp;gamma;</td><td>Peprotech</td><td>315-05</td><td></td></tr><tr><td>重组小鼠IL-1&amp;beta;</td><td>Peprotech</td><td>211-11B</td><td></td></tr><tr><td>重组小鼠TNF-&amp;alpha;</td><td>Peprotech</td><td>315-01A</td><td></td></tr><tr><td>圆底聚苯乙烯试管</td><td>康宁生命科学</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>Semken 止血钳</td><td>Fine Science Tools</td><td>11008-13</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠（100 mM）</td><td>Gibco</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>Stericup Quick Release-GP 无菌真空过滤系统，250 mL</td><td>Millipore</td><td>S2GPU02RE</td><td></td></tr><tr><td>Steriflip-GP 无菌离心管顶置滤器单元</td><td>Millipore</td><td>SCGP00525</td><td></td></tr><tr><td>无菌注射器（10 mL）</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-459</td><td></td></tr><tr><td>无菌注射器（20 mL）</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-460</td><td></td></tr><tr><td>带透气盖的T-75细胞培养瓶，CellBIND处理</td><td>康宁生命科学</td><td>3290</td><td></td></tr></tbody></table>

原代小鼠肺内皮细胞的分离

Isolation of Primary Mouse Lung Endothelial Cells

内皮细胞在调节血管张力、免疫、凝血和通透性方面发挥关键作用。内皮功能障碍可见于糖尿病、动脉粥样硬化、脓毒症和急性肺损伤等疾病状态。为了研究内皮细胞在这些及其他疾病发病机制中的作用，需要一种可靠且可重复的小鼠内皮细胞分离方法。本方案中，从小鼠新生仔鼠（5–7日龄）中分离制备肺微血管内皮细胞。取出肺组织，剪碎后用I型胶原酶进行酶消化，释放的细胞过夜培养。随后使用与磁珠偶联的抗PECAM1（CD31）IgG抗体富集内皮细胞，并将细胞再次培养至融合。为进一步提高内皮细胞纯度，再使用与磁珠偶联的抗ICAM2（CD102）IgG抗体进行二次细胞筛选，随后再次将细胞培养至融合。整个过程约需7–10天，之后细胞即可用于实验。该简易方案可获得高纯度（纯度 &#62;92% 的内皮细胞，可立即用于 体外 研究，包括聚焦于内皮细胞分泌细胞因子和趋化因子、白细胞-内皮细胞相互作用、内皮凝血通路以及内皮通透性的研究。由于存在多种基因敲除和转基因小鼠品系，该方法还可用于探究内皮细胞在健康及病理状态下对损伤、感染和炎症反应中所表达的特定基因的功能。

该简单方案可在7-10天内实现小鼠微血管内皮细胞的分离、培养和鉴定（图1）。简言之，取出肺组织后进行酶消化，然后接种。接种后立即可见内皮细胞及其他细胞悬浮于细胞培养基中。至次日，内皮细胞及污染细胞将贴附于培养皿表面，此时需采用强力洗涤方法以去除碎片和未贴壁细胞。当细胞达到汇合状态后，进行首次免疫磁珠筛选。CD-31阳性细胞随后开始呈现铺路石样形态生长（图2）。不具有铺路石样形态或过度生长的细胞为污染细胞，不属于内皮细胞13,14,15,16。
随后使用包被抗CD-102抗体的免疫磁珠进行第二次免疫磁珠筛选，以提高内皮细胞的纯度，该方法与其他方案类似13,16。经过第二次免疫磁珠筛选后，细胞生长至融合状态即可用于实验。采用荧光激活细胞分选（FACS）技术确认细胞群体为CD-31阴性且CD-102阳性（图3）。
这些内皮细胞随后可用于多种应用，例如研究内皮炎症通路和内皮屏障功能。例如，观察到使用小鼠细胞因子混合物（murine cytomix，含 IFNg、TNFa 和 IL1b，每种均为 10 ng/mL）处理后，内皮细胞产生 IL-6 （图 4A）。随后采用电动细胞-基质阻抗传感技术（Electric Cell-substrate Impedance Sensing, ECIS）18 测量跨内皮电阻（transendothelial resistance, TER），以评估电流通过小鼠肺内皮细胞单层时的阻力。观察到经细胞因子混合物处理的细胞导致 TER 降低 （图 4B），这与内皮通透性增加一致。这些实例说明了利用本方案制备的内皮细胞可研究多种内皮相关过程。鉴于目前可获得的基因敲除和转基因小鼠品系日益增多，该方法可使研究人员更便捷地在内皮细胞中研究目标基因的功能。
<img alt="小鼠肺细胞分离、胶原酶消化示意图；CD31、CD102筛选；实验流程。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63253/63253fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：小鼠肺内皮细胞分离示意图。取5-7日龄新生幼鼠的肺组织，收获后剪碎。将剪碎的组织用I型胶原酶进行酶消化。细胞悬液接种并培养2-3天。随后使用CD31包被的免疫磁珠进行初次分离，并继续培养3-4天。再通过CD102包被的免疫磁珠进行第二次分离，之后再培养2-3天。此时细胞已可用于功能性实验。该图像由基于网页的绘图工具Biorender生成。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63253/63253fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="显微镜下的细胞培养；相差图像；细胞增殖；比例尺 100 μm。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63253/63253fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2：小鼠肺内皮细胞的形态学特征。 培养的小鼠肺内皮细胞呈现铺路石样形态。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63253/63253fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="流式细胞术分析；CD102 和 CD31 表达图；细胞群体分布。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63253/63253fig03v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 3"> 
图 3：通过流式细胞术分析内皮细胞。（A）所有事件均显示在前向散射（FSC）与侧向散射（SSC）的点图中。（B）散点图证实小鼠肺内皮细胞对内皮特异性细胞表面抗原 CD-31 和 CD-102 均呈阳性。（C）同型对照样本与使用 CD-31/CD-102 特异性抗体染色样本的直方图。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63253/63253fig03largev2.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="培养基中IL-6的比较及细胞因子混合物处理；包含柱状图和折线图结果的双部分图表。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63253/63253fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图4"> 
图4：细胞因子混合物诱导小鼠肺微血管内皮细胞产生IL-6并增加内皮细胞通透性。 来自C57BL/6小鼠的肺微血管内皮细胞用细胞因子混合物（IFNγ、TNFα 和 IL-1β，每种均为10 ng/mL）处理。(A) 培养15小时后，检测上清液中IL-6的水平（**p&lt;0.01，n = 每组4个孔）。(B) 采用细胞电阻传感技术（Electric Cell-Substrate Impedance Sensing）在15小时内多次测定跨内皮电阻（TER）。数据以加入细胞因子混合物前的电阻值为基准进行归一化处理，并采用双因素方差分析（two-way ANOVA）进行统计分析，随后进行Tukey多重比较检验19（**p&lt;0.01，n = 每组4个孔）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63253/63253fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本文中，从新生小鼠分离并培养了原代肺内皮细胞。

内皮细胞在血管张力、免疫、凝血和通透性的调控中发挥关键作用。内皮功能障碍发生在……

本方案展示了一种可靠且可重复的小鼠高纯度内皮细胞分离与培养方法，具有多种应用潜力。该技术是一种更为简便的方法，可保持内皮细胞的得率和纯度。本实验操作将由本实验室的研究助理Nina Nguyen进行演示。首先，将磁珠涡旋震荡数秒。用移液器将50 µL磁珠分别加入两个1.5 mL微量离心管中，用于CD31和CD102。加入1 mL磁珠洗涤缓冲液，并充分混匀。将试管置于磁力架上，用玻璃巴斯德吸管吸除上清液。用50 µL珠洗缓冲液重悬磁珠。然后向每50 µL磁珠中加入5 µL或2.5 µg的CD31或CD102抗体。将珠子悬浮液置于4摄氏度下，使用翻转式旋转仪轻轻旋转孵育过夜，或在室温下孵育三小时。用珠子洗涤缓冲液将免疫珠洗涤四次，然后将免疫珠重悬于50微升珠子洗涤缓冲液中。在分离当天，向25毫克I型胶原酶中加入25毫升HBSS，并轻轻旋转孵育。然后使用22微米滤器进行过滤。安乐死一只5至7日龄的幼鼠后，用70%乙醇喷洒尸体。接着，沿胸腔两侧壁向上方剪开膈肌，以暴露胸腔。向心脏右心室注入5毫升冷DMEM，直至肺组织变白。随后依次在相应支气管远端切断肺叶以取出肺组织。将肺叶放入已预装20毫升冰冻基础培养基的50毫升锥形管中。用手轻轻振荡试管 10 至 15 秒，以洗涤去除多余的红细胞。用细胞筛将肺组织从培养基中取出，并用灭菌剪刀剪碎。将剪碎的组织转移至含有 25 毫升预热的胶原酶溶液的 50 毫升锥形管中。在旋转混合器上轻轻振荡。将一个20毫升注射器连接到15号钝头套管上，用力反复吹打悬浮液10至15次，制成单细胞悬液，注意避免产生泡沫。将悬液通过70微米细胞滤网过滤至50毫升锥形管中。然后用 15 毫升基础培养基冲洗用于消化的锥形管和细胞筛。在 4 摄氏度下，以 400 × g 离心细胞悬液 8 分钟。将沉淀重悬于 2 毫升完全培养基中。加入8 mL完全培养基并进行培养。次日，用不含钙和镁的HBSS洗涤培养瓶两次，每次10 mL，并加入10 mL完全培养基。当细胞融合度达到90%至95%时，即可用于初次免疫磁珠分离。用10毫升不含钙和镁的HBSS缓冲液洗涤贴壁内皮细胞两次。加入2毫升无胰蛋白酶细胞解离溶液，孵育以确保所有细胞从培养瓶中脱落。加入8毫升基础培养基。接下来，在室温下以400 × g离心细胞4分钟，然后将细胞重悬于2毫升基础培养基中。涡旋振荡抗CD31包被的磁珠数秒，以充分重悬磁珠。每2毫升细胞悬液中加入30微升磁珠，并拧紧管盖。将离心管置于室温下，使用翻转混匀仪孵育10分钟。然后将离心管置于磁力架上静置2分钟。吸除上清液，并将离心管从磁力架上取下。向离心管中加入三毫升基础培养基，上下吹打数次，重悬磁珠细胞沉淀。将离心管放回磁力架上静置两分钟，然后用玻璃巴斯德吸管小心吸除上清液。最后一次洗涤后，当上清液变澄清时，将珠子和细胞沉淀重悬于 3 mL 完全培养基中，并转移至 T75 培养瓶。加入 7 mL 完全培养基，进行孵育。次日，用不含钙和镁的 HBSS 重新洗涤细胞。然后加入10毫升完全培养基。当细胞融合度达到90%至95%时，即可进行二次免疫磁珠分离。第一次免疫磁珠筛选可鉴定出CD31阳性细胞，这类细胞呈鹅卵石样形态生长。使用抗CD102包被的免疫磁珠进行第二次富集，可提高内皮细胞纯度，并通过荧光激活细胞分选技术确认细胞群体为CD31阳性且CD102阳性。为研究内皮细胞炎症通路及内皮屏障功能，采用小鼠Cytomix处理诱导内皮细胞显著产生IL-6（P值小于0.01）。此外，跨内皮电阻下降，表明内皮通透性增加。分离的内皮细胞可用于内皮细胞刺激或屏障功能检测，以发现内皮功能障碍相关疾病的内皮细胞治疗靶点。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

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