Name: 年龄依赖性肾损伤小鼠肾脏和血清中MicroRNA表达的定量实时聚合酶链反应评估 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 48 s
Description: 了解如何使用qRT-PCR技术定量评估年龄依赖性肾损伤小鼠肾脏和血清中的microRNA表达水平。该方法具有高灵敏度和准确性，可用于研究肾脏疾病中的基因调控机制。

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实验方案经由日本医科大学动物伦理委员会批准，并依照日本医科大学实验动物使用与护理指南进行。本方案使用四只50周龄的SAMR1雄性小鼠和SAMP1雄性小鼠（40-45 g）。
1. 血清样本采集
<ol>
	<li>为每只小鼠准备以下物品：30 G针头配1.0 mL注射器、含肝素的1.0 mL尖底离心管、1.5 mL微量离心管、异氟烷麻醉剂、软木板、70%乙醇、两个用磷酸盐缓冲液（PBS）润湿的棉签、盛有PBS的培养皿、镊子和手术剪。</li>
	<li>使用1.5%异氟烷对小鼠进行麻醉，并以1.5%维持麻醉。皮下注射镇痛剂（美洛昔康5 mg/kg），然后向其腹腔注入1.0 mL 70%乙醇，并将小鼠仰卧位固定于软木板上。</li>
	<li>通过脚趾回缩反射消失确认麻醉深度。使用镊子和手术剪切开腹部皮肤，从膀胱至左肋下缘剪开肌肉和腹膜。</li>
	<li>用镊子提起腹膜，用手术剪在腹膜上缘做一侧向切口，并沿肋骨最低边缘继续延长切口。</li>
	<li>使用两个PBS润湿的棉签辨认下腔静脉。将配有1.0 mL注射器的30 G针头插入下腔静脉后缓慢回抽采血。缓慢拔出针头以避免溶血。将采集的血液转移至含肝素的1.0 mL尖底离心管中，并通过反复倒置混匀。&#160; 
	注意：小鼠通过颈椎脱臼法实施安乐死。</li>
	<li>在室温（RT）下，以3,000 × g 离心10分钟。</li>
	<li>缓慢吸取上清液，确保不混入沉淀物，然后将其转移至新的1.5 mL微量离心管中。</li>
	<li>使用前将样品管储存于−80 °C。 
	&#8203;注意：若立即进入第3步操作，则无需在−80 °C保存。</li>
</ol>
2. 肾脏样本采集
<ol>
	<li>为每只小鼠准备以下物品：2.0 mL 冻存管、异氟烷麻醉剂、软木板、70% 乙醇、含 PBS 的培养皿、镊子和手术剪。</li>
	<li>使用 1.5% 异氟烷麻醉小鼠，并以 1.5% 维持麻醉。皮下注射镇痛剂（美洛昔康 5 mg/kg），然后向其腹腔内注射 1.0 mL 70% 乙醇，将小鼠仰卧位固定于软木板上。</li>
	<li>通过脚趾回缩反射消失确认麻醉深度。使用镊子和手术剪在腹部皮肤上做切口，从膀胱至肋骨左下缘剪开肌肉和腹膜。</li>
	<li>用镊子提起腹膜，用手术剪在腹膜上缘做一侧向切口，并沿肋骨最下缘继续延长切口。</li>
	<li>识别左肾。用 PBS 反向灌流以冲洗血管中的血液，直至肾脏变为淡黄白色。先用手术剪切断左肾动脉和静脉，完整切除肾脏。将肾脏置于培养皿中，并用 PBS 轻柔清洗。&#160; 
	注意：通过颈椎脱臼法处死小鼠。</li>
	<li>使用镊子和手术剪将肾脏切成 10 mg 的组织样本（10 mg 是适用于下一步的合适样本量）。将每个肾脏样本分别放入 2.0 mL 冻存管中，盖紧管盖。</li>
	<li>如需长期保存，将各冻存管转移至液氮中，并在 −80 °C 下保存。</li>
</ol>
3. 从血清样本中提取总RNA
<ol>
	<li>首先准备以下物品：涡旋混合器、基于苯酚/胍的裂解试剂、80% 乙醇、100% 乙醇、100% 氯仿、生物聚合物离心柱（置于 2.0 mL 收集管中）11），膜锚定的离心柱（置于2.0 mL收集管中）11）、洗涤缓冲液#1（即含有胍和100%乙醇，比例为1:2的洗涤缓冲液）、洗涤缓冲液#2（即含有胍和100%乙醇，比例为1:4的洗涤缓冲液）、无RNase水、1.5 mL微量离心管和2.0 mL微量离心管。</li>
	<li>首先，取200 µL血清样本置于1.5 mL微量离心管中，然后加入1,000 µL基于苯酚/ guanidine的裂解试剂。涡旋振荡混合物5秒。</li>
	<li>在室温下孵育样品5分钟。</li>
	<li>向试管中的血清样本加入 200 µL 氯仿，拧紧管盖。颠倒试管 15 次以混匀氯仿与血清样本。</li>
	<li>每个样品在室温下孵育3分钟。随后，将样品在4 °C、12,000 x g条件下离心15分钟。 g.</li>
	<li>将300 µL上清液转移至新的1.5 mL微量离心管中，注意勿扰动沉淀。加入450 µL 100%乙醇，涡旋振荡管子5秒。 
	注意：在以下所有步骤中，将用于分离 RNA 和 DNA 的膜锚定式离心柱置于 2.0 mL 收集管中进行离心。</li>
	<li>然后，移除700 µL样品，将其加载至膜固定型离心柱中，并盖紧盖子。在室温下以8,000 × g离心15 s 克， 保留柱中的上清液，弃去收集管中残留的沉淀。</li>
	<li>加入700 µL血清/血浆试剂盒中的洗涤缓冲液#1（参见 材料表)加入膜固定型离心柱中，以彻底清洗样品。盖紧柱帽，在室温下以8,000 × g离心15秒。 克， 将上清液留在柱中，弃去收集管中残留的沉淀。</li>
	<li>为去除痕量盐分，取 500 µL 洗涤缓冲液 #2，加入膜固定式离心柱中。盖紧柱帽后，在室温下以 8,000 × g 离心 15 秒。 克， 并让上清液留在柱中. 弃去收集管中的沉淀。</li>
	<li>为去除痕量盐分，取 500 µL 80% 乙醇并加样至膜固定型离心柱中。盖紧柱帽后，在室温下以 8,000 × g 离心 15 秒 克， 并让上清液留在柱中. 弃去收集管中的沉淀物。</li>
	<li>在室温下以15,000 × g离心膜结合型离心柱5分钟 g.</li>
	<li>将膜结合型离心柱转移至新的1.5 mL收集管后，向柱中加入14 µL无RNase水以溶解总RNA。关闭柱盖后，室温静置5 min。再次以15,000 × g离心1 min g 室温下</li>
	<li>将装有样品的试管于使用前在 −80 °C 保存。</li>
</ol>
4. 从肾脏样本中提取总RNA
<ol>
	<li>首先准备以下物品：硅胶匀浆器、冰、涡旋混合器、100% 乙醇、100% 氯仿、生物聚合物离心柱（置于 2.0 mL 收集管中11）、膜锚定离心柱（置于 2.0 mL 收集管中11）、基于苯酚/胍的裂解试剂、洗涤缓冲液 #1（与步骤 3.1 中的缓冲液相同）、洗涤缓冲液 #2（与步骤 3.1 中的缓冲液相同）、无 RNase 水、1.5 mL 微量离心管和 2.0 mL 微量离心管。</li>
	<li>将 10 mg 肾组织样本放入硅胶匀浆器中，加入 700 µL 基于苯酚/胍的裂解试剂。</li>
	<li>安装匀浆器。轻轻按压并旋转匀浆器的研杵，使其与肾组织样本接触以进行匀浆。持续按压并旋转研杵，直至肾组织样本在基于苯酚/胍的裂解试剂中完全匀浆。</li>
	<li>为进一步匀浆，将匀浆后的裂解液（在 2.0 mL 收集管中）转移至一个生物聚合物离心柱中。</li>
	<li>在室温下以 14,000 × g 离心 3 分钟，然后将全部沉淀物转移至一个新的 1.5 mL 微量离心管中，倒置以松动沉淀物。</li>
	<li>在管中加入 140 µL 氯仿，与沉淀物混合；然后紧密盖上管盖。反复倒置管子 15 次，使裂解液与氯仿充分混合。 
	注意：氯仿可在无通风橱条件下安全使用。</li>
	<li>将样本在室温下孵育 2–3 分钟。随后在 4 °C 下以 12,000 × g 离心 15 分钟。</li>
	<li>将上清液（通常约为 300 µL）转移至新的 1.5 mL 微量离心管中，注意不要扰动沉淀物。加入 1.5 倍体积的 100% 乙醇（通常约为 450 µL）。涡旋混合 5 秒。 
	注意：在后续所有步骤中，将用于分离 RNA 和 DNA 的膜锚定离心柱置于 2.0 mL 收集管中进行离心。</li>
	<li>将 700 µL 样本加载到一个膜锚定离心柱中。盖紧盖子，并以 15,000 × g 离心 15 秒。弃去收集管中残留的沉淀裂解液。</li>
	<li>向离心柱中加入 700 µL 洗涤缓冲液 #1，彻底清洗。盖紧盖子，并以 15,000 × g 离心 15 秒。弃去收集管中残留的沉淀裂解液。</li>
	<li>为去除微量盐分，向膜锚定离心柱中加入 500 µL 洗涤缓冲液 #2。盖紧柱盖后，以 15,000 × g 离心 15 秒。弃去收集管中的沉淀裂解液。</li>
	<li>重复步骤 4.11。</li>
	<li>再次以 15,000 × g 离心膜锚定离心柱 1 分钟。弃去收集管中的沉淀裂解液。</li>
	<li>取下膜锚定离心柱，转移至新的 1.5 mL 收集管中。向柱中加入 30 µL 无 RNase 水以溶解总 RNA。盖紧柱盖后，在室温下静置 5 分钟，然后以 15,000 × g 离心 1 分钟。</li>
	<li>将含有总 RNA 的全部样本转移至新的微量离心管中。将管子置于冰上，通过分光光度法测定总 RNA 浓度。确保总 RNA 浓度约为 300–1,500 ng/µL。</li>
	<li>将含有样本的管子在使用前储存于 −80 °C。</li>
</ol>
5. 血清总RNA逆转录合成cDNA
注意：定量实时 PCR 实验最低信息标准（MIQE）指南建议采用更优的实验方法，以获得可靠且明确的结果17。在本方案中，cDNA 是通过两步法由纯化的总 RNA 合成，该过程使用逆转录酶、多聚(A)聚合酶以及寡聚(dT)引物。
<ol>
	<li>首先准备以下物品：涡旋混合器、热循环仪、八联管、每个八联管的管盖、蒸馏水、冰、逆转录试剂盒（见材料表）13,14（融化状态）以及1.5 mL微量离心管。</li>
	<li>启动热循环仪。</li>
	<li>配制预混液；为每条八联管获得总量为8.0 µL的预混液，在1.5 mL微量离心管中加入2.0 µL逆转录酶混合液（试剂盒提供）和2.0 µL 10×核酸混合液至4.0 µL逆转录缓冲液中。</li>
	<li>将8.0 µL预混液分别加入八联管的每一管中。</li>
	<li>向八联管的每管中加入12 µL总RNA，并盖上管盖。在室温下以2,000 × g离心15秒。</li>
	<li>将八联管放入热循环仪中，在37 °C孵育60分钟。随后在95 °C继续孵育5分钟以完成cDNA合成。</li>
	<li>孵育结束后，将cDNA转移至新的1.5 mL微量离心管中。用蒸馏水将cDNA稀释十倍（1:10）。涡旋混匀后，在室温下以2,000 × g离心5秒。</li>
	<li>将稀释后的cDNA暂时保存在冰上。使用前将稀释样品储存在−80 °C。</li>
</ol>
6. 利用肾脏总RNA的逆转录合成cDNA
注意：MIQE 指南建议采用更优的实验实践，以确保获得可靠且明确的结果17。本方案采用逆转录酶、多聚腺苷酸聚合酶和寡聚 dT 引物，通过两步法从 1.0 µg 纯化的总 RNA 中合成 cDNA。
<ol>
	<li>首先准备以下物品：涡旋振荡器、PCR仪、1.5 mL 微量离心管、八联排管、每个八联排管的管盖、蒸馏水、冰、逆转录试剂盒（参见材料表）13,14，并将其融化。</li>
	<li>启动PCR仪。</li>
	<li>配制预混液；为每管获得总量为8.0 µL的预混液，将试剂盒中提供的2.0 µL逆转录酶混合液和2.0 µL 10x核酸混合液加入4.0 µL逆转录缓冲液中。</li>
	<li>将8.0 µL预混液加入每个八联排管的各管中。</li>
	<li>按如下方式调整总RNA浓度：若需从肾组织样本中分离1.0 µg总RNA并用12 µL无RNase水溶解，则取适量上述步骤（步骤4.15）测得浓度的总RNA，转移至蒸馏水中。 
	&#8203;注意：若存在DNA污染，污染的DNA将在qRT-PCR过程中被共同扩增。</li>
	<li>重复执行上述步骤5.5–5.8中的相同操作。</li>
</ol>
7. miRNA 的 qRT-PCR
注意：采用嵌合剂法进行miRNA的qRT-PCR检测。所用引物针对以下RNA分子：U6核小RNA2（RNU6-2）、miRNA-223-3p、miRNA-423-5p、miRNA-7218-5p和miRNA-7219-5p。
<ol>
	<li>准备以下物品：涡旋混合器、实时PCR系统、用于qRT-PCR的96孔反应板、96孔反应板用粘性封膜、封膜压合器、96孔离心机转子、miRNA特异性引物、含2x PCR预混液和10x通用引物的绿色染料法PCR试剂盒（参见材料表）13,14，以及1.5 mL微量离心管。</li>
	<li>在1.5 mL微量离心管中混合以下组分后涡旋振荡：6.25 µL去离子水、各1.25 µL用无核酸酶水溶解的5 µM miRNA引物、12.5 µL 2x PCR预混液，以及2.5 µL 10x通用引物。</li>
	<li>取第5步（血清）或第6步（肾脏）中合成的cDNA，加热溶解。涡旋振荡并离心5秒。</li>
	<li>将上述第7.2步中配制的试剂取22.5 µL，分别加入96孔板的各个孔中。</li>
	<li>向每孔加入2.5 µL cDNA样品。</li>
	<li>使用封膜压合器将粘性封膜密封至反应板上。将反应板置于96孔离心机转子中，以1,000 × g 离心30秒，使反应液沉降至各孔底部。</li>
</ol>
8. 使用实时 PCR 系统和软件运行 PCR 扩增程序
<ol>
	<li>启动实时荧光定量 PCR 系统。将按照步骤 7.6 所制备的反应板放入实时荧光定量 PCR 系统中。修改设置；为实验命名，然后选择 96 孔 (0.2 mL) 作为系统实验类型，相对 CT 法 (ΔΔCT) 作为定量方法，标准 作为系统运行模式，SYBR Green 试剂 作为检测目标序列的试剂。</li>
	<li>为样本和目标 miRNA 命名，并为每个孔中的样本和目标 miRNA 指定名称。设置重复样本以获得可用于验证结果的数据，并选择参考样本和内参对照。对于用作被动参比的染料，选择 无。为避免试剂交叉污染，需设置无逆转录酶对照和无模板对照以检测 miRNA 表达。</li>
	<li>接下来，确保反应体系体积设定为 20 µL，PCR 扩增循环条件设定如下：95 °C 预变性 15 分钟，随后进行 40 个循环，每个循环包括 94 °C 变性 15 秒、55 °C 退火 30 秒，最后 70 °C 延伸 30 秒。</li>
	<li>待程序运行结束后，在系统软件中点击 分析 以分析 qRT-PCR 数据。确认软件自动选定的阈值线适用于每个孔的扩增曲线。</li>
	<li>检查每个样本中内参对照和目标 miRNA 的阈值循环（CT）值。通过扩增曲线与阈值线的交点确定 CT 值。 
	注：在本研究中，RNU6-2 和 miRNA-423-5p 被用作目标 miRNA 表达水平的内参对照，采用 ΔΔCT 法计算各目标 miRNA 的相对表达水平18。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在利益冲突。

采用上述qRT-PCR方法，成功检测了目标miRNA的表达水平。在获得有意义的qRT-PCR数据之前，对提取的miRNA进行评估是一个重要步骤。为确认qRT-PCR前miRNA的质量是否合格，应使用分光光度法测定260 nm与280 nm处吸光度的比值。如果qRT-PCR未产生预期长度和熔解温度的单一PCR扩增产物，或未呈现单峰型熔解曲线，则可能存在DNA污染和/或反应板每孔中出现引物二聚体。
除qRT-PCR外，还可通过多种方法检测miRNA表达水平，包括Northern印迹法、微阵列和核糖核酸酶保护实验。然而，qRT-PCR方法具有高灵敏度、准确性好、操作简便且可重复性强等优点，所需样本量也比Northern印迹法和核糖核酸酶保护实验更少19。由于微阵列可同时检测成千上万种miRNA的表达，因此可用于筛选候选的miRNA标志物。微阵列数据与qRT-PCR获得的结果总体上具有较高的相关性20。然而，目前对于如何比较不同研究中获得的微阵列数据，尚未形成统一的最佳方法共识21。
血清miRNA的评估具有以下特点。首先，血清易于采集，且血清miRNA对冻融、温度和酸性环境具有稳定性，因此miRNA可作为良好的生物标志物。其次，miRNA在不同物种间具有高度同源性，动物实验的结果可较容易地外推至人类。第三，血清miRNA已显示出作为治疗药物的潜力3。多项研究还表明，器官中miRNA的表达水平与血清中的miRNA水平相关22,23,24。在本研究中，miRNA-223-3p在SAMR1和SAMP1小鼠间的肾脏水平无显著差异，其血清水平亦未表现出显著的品系间差异。相反，miRNA-7218-5p和miRNA-7219-5p在SAMR1和SAMP1小鼠间的肾脏水平存在显著差异，其血清水平也表现出明显的品系间差异。
本方案存在以下局限性。首先，其在其他器官（如肝脏和肺脏）中的有效性尚未得到验证；其次，该方案尚未在其他实验动物（如大鼠、犬和猪）中进行测试。多个研究团队已采用本方案进行miRNA的纯化及通过qRT-PCR检测，并报告该方案能够从组织和血清中纯化出高质量的RNA13,14,22,23,24。研究表明，该方法在检测miRNA表达水平方面具有高准确性和高灵敏度13,14,22,23,24。本研究结果表明，该方案可成功检测小鼠血清和肾脏中的miRNA表达。因此，该方案可用于确定患有多种病理状态的小鼠血清和肾脏中miRNA的表达谱。由于该方案操作简便，可同时处理大量样本。因此，针对肾脏在不同病理条件下多种miRNA表达的分析可采用本文所述的方案。
在进行本实验方案时需注意以下几个方面。为了避免纯化后的miRNA在室温下发生降解，必须将miRNA保持在冰上。肾脏样品必须充分匀浆，直至完全溶解于裂解试剂中。小鼠肾脏含有大量在裂解试剂中不溶解的结缔组织，因此需要使用柱式研磨器进行进一步的匀浆处理。此外，在建立qRT-PCR实验体系的过程中，应验证合适的内参miRNA（在各样品中表达稳定的miRNA）。这是因为实验过程中各种物质的干扰可能改变内参miRNA的表达水平，从而影响实验结果的可靠性。综上所述，本文介绍了一种用于检测、纯化和评估年龄依赖性肾功能损伤小鼠血清和肾脏中miRNA表达水平的qRT-PCR实验方案。

已知多种在生理和疾病（如炎症、纤维化、代谢紊乱和癌症）中发挥重要作用的mRNA的表达受到miRNA的调控，miRNA是一类短链非编码RNA，可导致mRNA降解并抑制其转录1。因此，某些miRNA有可能成为多种疾病的新型候选生物标志物和/或治疗靶点2,3,4,5。研究人员已在多种小鼠器官和组织（包括脑6、心脏7、肺8、肝脏9和肾脏10）中开展了miRNA表达谱的研究。然而，目前尚无标准或公认的方法用于提取和评估伴有年龄依赖性肾功能损伤的小鼠肾脏或血清中的miRNA。
因此，我们建立了一种可用于可靠纯化并检测伴有年龄依赖性肾功能损伤的小鼠血清和肾脏中miRNA表达的实验方案。该方案包含六个主要步骤：（1）准备50周龄的SAMR1雄性小鼠和SAMP1雄性小鼠；（2）从小鼠下腔静脉采集两种品系小鼠的血液样本，使用含肝素的尖头管，随后经离心处理获得血清样本；（3）从小鼠中提取肾脏样本——使用硅基匀浆器分别匀浆肾脏组织，然后将样品转移至微型离心柱上的生物大分子裂解系统11；（4）利用基于二氧化硅膜的离心柱12从血清样本中提取总RNA（包含miRNA），并利用基于二氧化硅膜的离心柱11从肾脏样本中提取含miRNA的总RNA；（5）使用逆转录酶、多聚腺苷酸聚合酶和寡聚dT引物，以总RNA为模板合成互补DNA（cDNA）13,14；（6）最后，采用qRT-PCR结合嵌入染料法检测miRNA的表达水平13,14。
该新方案基于多项成功从多种组织中提取并评估miRNA的研究11,12,13。该方案的生物聚合物降解系统已被证明能够从组织中纯化出高质量的总RNA11。该方案中用于通过嵌入染料qRT-PCR评估miRNA表达的相关步骤的准确性与灵敏度已有验证13,14，例如，利用逆转录酶、poly(A)聚合酶及oligo-dT引物从提取的总RNA合成cDNA。该新方案具有多项优势：操作简便、节省时间且可减少技术误差。因此，该方案可用于需要精确且灵敏地鉴定肾脏和血清miRNA谱的研究。许多病理状态的研究也可应用该新方案。
可按照下述方法测定作为年龄依赖性肾功能损伤模型的 SAMP1 小鼠中 miRNA 的表达谱。在人类中，年龄依赖性肾功能损伤与肾功能衰竭的进展相关，其特征是肾间质纤维化区域增大以及肾小球硬化进展15,16。年龄依赖性肾功能损伤也是慢性肾病和终末期肾病的重要且常见的特征15,16。

<table><tbody><tr><td>1.0 mL 肝素抗凝尖底管</td><td>Greiner-bio-one</td><td>450534</td><td></td></tr><tr><td>Buffer RPE（含胍和乙醇比例为1:4的洗涤缓冲液2）</td><td>Qiagen</td><td>79216</td><td>洗涤缓冲液2</td></tr><tr><td>Buffer RWT（含胍和乙醇比例为1:2的洗涤缓冲液1）</td><td>Qiagen</td><td>1067933</td><td>洗涤缓冲液1</td></tr><tr><td>用于qRT-PCR的MicroAmp光学96孔反应板</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4316813</td><td>96孔反应板</td></tr><tr><td>MicroAmp光学粘性封膜</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4311971</td><td>96孔反应板用粘性封膜</td></tr><tr><td>miRNA-223-3p 引物</td><td>Qiagen</td><td>MS00003871</td><td>5'-CGUGUAUUUGACAAGCUGAGUU&lt;br/&gt; G-3'</td></tr><tr><td>miRNA-423-5p 引物</td><td>Qiagen</td><td>MS00012005</td><td>5'-UGAGGGGCAGAGAGCGAGACU&lt;br/&gt; UU-3'</td></tr><tr><td>miRNA-7218-5p 引物</td><td>Qiagen</td><td>MS00068067</td><td>5'-UGCAGGGUUUAGUGUAGAGGG&lt;br/&gt; -3'</td></tr><tr><td>miRNA-7219-5p 引物</td><td>Qiagen</td><td>MS00068081</td><td>5'-UGUGUUAGAGCUCAGGGUUGA&lt;br/&gt; GA-3'</td></tr><tr><td>miRNeasy Mini 试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td>固定于2.0 mL 收集管中的膜锚定离心柱</td></tr><tr><td>miRNeasy 血清/血浆试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>217184</td><td>固定于2.0 mL 收集管中的膜锚定离心柱</td></tr><tr><td>miScript II RT 试剂盒（逆转录缓冲液）</td><td>Qiagen</td><td>218161</td><td>逆转录酶试剂盒</td></tr><tr><td>miScript SYBR Green PCR 试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>218073</td><td>基于绿色染料的PCR试剂盒</td></tr><tr><td>QIA shredder</td><td>Qiagen</td><td>79654</td><td>固定于2.0 mL 收集管中的生物聚合物离心柱</td></tr><tr><td>QIAzol 裂解试剂（基于苯酚/胍的裂解试剂）</td><td>Qiagen</td><td>79306</td><td>基于苯酚/胍的裂解试剂</td></tr><tr><td>QuantStudio 12K Flex 实时荧光定量PCR系统</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4472380</td><td>实时荧光定量PCR仪器</td></tr><tr><td>QuantStudio 12K Flex 软件版本 1.2.1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4472380</td><td>实时荧光定量PCR仪器软件</td></tr><tr><td>无RNase水</td><td>Qiagen</td><td>129112</td><td></td></tr><tr><td>RNU6-2 引物</td><td>Qiagen</td><td>MS00033740</td><td>因保密原因未公开</td></tr><tr><td>SAMP1 雄性小鼠</td><td>Nippon SLC Corporation</td><td>未分配</td><td></td></tr><tr><td>SAMR1 雄性小鼠</td><td>Nippon SLC Corporation</td><td>未分配</td><td></td></tr><tr><td>Takara biomasher 标准型</td><td>Takara Bio</td><td>9790B</td><td>硅基匀浆器</td></tr></tbody></table>

基于年龄相关性肾功能损伤小鼠肾脏与血清中微小rna表达的定量实时聚合酶链式反应检测

Quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction Evaluation of MicroRNA Expression in Kidney and Serum of Mice with Age-Dependent Renal Impairment

microRNA（miRNA）是一类由21-25个碱基组成的小分子非编码RNA。它们不会被翻译成蛋白质，而是通过使靶标信使RNA（mRNA）不稳定并干扰其翻译过程，从而抑制其功能。尽管已有研究探讨了不同小鼠器官和组织中的miRNA表达谱，但目前尚无针对小鼠肾脏和血清miRNA纯化与定量的标准方法。我们建立了一种有效且可靠的方法，用于提取和评估伴有年龄依赖性肾功能损伤的小鼠血清和肾脏中miRNA的表达水平。
该方法采用定量反转录-聚合酶链式反应（qRT-PCR），实验流程包括六个步骤：（1）准备衰老加速小鼠抗性1型（SAMR1）小鼠和衰老加速小鼠易感型（SAMP1）小鼠；（2）从小鼠中提取血清样本；（3）从小鼠中分别取出肾脏组织样本；（4）从小鼠的肾脏和血清样本中提取总RNA（包括miRNA）；（5）以miRNA为模板，通过反转录合成互补DNA（cDNA）；（6）利用所获得的cDNA进行qRT-PCR检测。
本方案用于证实，在年龄依赖性肾功能损伤小鼠模型中，与对照组相比，miRNA-7218-5p 和 miRNA-7219-5p 在肾脏和血清中的表达水平发生显著变化。本方案还阐明了年龄依赖性肾功能损伤小鼠模型中肾脏与血清之间的关系。该方案可用于检测年龄依赖性肾功能损伤小鼠肾脏和血清中miRNA的表达水平。

对于年龄依赖性肾功能损伤小鼠模型，我们使用了50周龄的SAMP1雄性小鼠，体重为40–45 g。每只小鼠采集约0.8 mL血液，转移至含肝素的1.0 mL尖底离心管中，颠倒混匀后离心。每侧肾脏用PBS冲洗，解剖分离后保存于液氮中以备后续分析。50周龄的SAMR1小鼠作为对照组。基于利用该年龄依赖性肾功能损伤模型获得的miRNA qRT-PCR数据，我们观察到与对照组相比，SAMP1小鼠肾脏中miRNA-7219-5p水平显著升高，而miRNA-7218-5p水平明显降低图1）。与对照组相比，SAMP1小鼠血清中miRNA-7219-5p和miRNA-7218-5p的水平显著升高（图2）。miRNA-223-3p 的表达水平在两种菌株之间以及肾脏与血清之间均未发生变化（图1 和 图2).
<img alt="microRNA表达分析；柱状图；SAMR1与SAMP1之间的数据比较；生物学研究" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63258/63258fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1SAMP1小鼠肾脏中差异表达的微小RNA 在SAMR1小鼠（对照组，n = 4）和SAMP1小鼠（n = 4）中对miRNA-223-3p、miRNA-7218-5p和miRNA-7219-5p表达水平进行qRT-PCR分析。数据以均值±标准误（误差线）表示； t采用检验分析组间差异；p &lt; 0.05 被视为具有显著性（*p &lt; 0.05），n.s.：无显著性差异。缩写：miRNA = 微小RNA；SAMP1 = 衰老加速小鼠易感型；SAMR1 = 衰老加速小鼠抗性型1；qRT-PCR = 定量逆转录-聚合酶链式反应。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63258/63258fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="miRNA 表达分析；SAMR1 与 SAMP1 中相对表达量的图表；统计结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63258/63258fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 2"> 
图 2：SAMP1 小鼠血清中差异表达的 miRNA。 对 SAMR1 小鼠（对照组，n = 4）和 SAMP1 小鼠（n = 4）中 miRNA-223-3p、miRNA-7218-5p 和 miRNA-7219-5p 表达水平的 qRT-PCR 分析。数据以均值 ± 标准误（误差线）表示；采用 t 检验分析组间差异的显著性。*p &lt; 0.05，经 t 检验。缩写：miRNA = microRNA；SAMP1 = senescence-accelerated mouse prone；SAMR1 = senescence-accelerated mouse resistance 1；qRT-PCR = quantitative reverse-transcription-polymerase chain reaction <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63258/63258fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

我们介绍了一种通过定量反转录聚合酶链式反应来评估伴有年龄依赖性肾功能损伤的小鼠肾脏及血清中微小RNA表达水平的方法。

基于年龄相关性肾功能损伤小鼠肾脏与血清中微小RNA表达的定量实时聚合酶链式反应检测

微小RNA（miRNAs）是一类由21-25个碱基组成的小分子非编码RNA。它们不会被翻译成蛋白质，而是通过抑制靶基因的表达来发挥作用……

该qRT-PCR方法可用于研究小鼠在年龄依赖性肾功能损伤等条件下血清中microRNA表达谱的相关问题。该技术通过简单流程实现对microRNA表达的高准确度和高灵敏度检测，节省时间并避免技术误差。首先，使用镊子和手术剪切开腹部皮肤。从膀胱至肋骨左下缘切开腹膜上的肌肉。用镊子提起腹膜，使用手术剪在腹膜上缘做一侧向切口，然后沿肋骨最下缘继续延伸切口。使用两个经 PBS 润湿的棉签识别下腔静脉。将连接1毫升注射器的30 G针头插入下腔静脉，并回抽注射器。缓慢拔出针头，以避免溶血。将血液转移至含有肝素的1毫升尖底管中，通过倒置混匀。在室温下以3000 × g离心10分钟。将上清液转移至新的1.5毫升微量离心管中。取200 µL血清样本，加入1,000 µL基于苯酚/胍的裂解试剂。涡旋混合5秒，在室温下孵育5分钟。加入200 µL氯仿，通过倒置离心管15次进行混合。将样品在室温下孵育3分钟，随后进行离心。勿扰动沉淀，将上清液转移至新的1.5毫升微量离心管中。加入450 µL 100%乙醇，并涡旋振荡管子5秒。然后将700 µL样品加载到膜固定的离心柱上，并进行离心。弃去穿流液，加入700 µL试剂盒中提供的洗涤缓冲液1。再次离心，并弃去穿流液。用500微升洗涤缓冲液2重复洗涤，以去除痕量盐分。加入500微升80%乙醇，离心，并弃去收集管中的流穿液。再次离心吸附柱，然后将吸附柱转移至一个新的1.5毫升收集管中。然后加入14 µL无RNase的水，在室温下孵育5分钟。再次在室温下以15000 ×g离心柱子1分钟。制备主混合液，并在8孔联管中每孔加入8 µL。每个试管中加入12 µL提取的总RNA，在室温下以2000 × g离心15秒。将试管放入热循环仪中，开始孵育以合成cDNA。孵育结束后，将cDNA转移至新的微量离心管中。用蒸馏水将cDNA稀释十倍。然后涡旋混匀，再在室温下以2000 × g离心5秒。在微量离心管中，按照文本方案所述配制预混液，并涡旋混匀该溶液。向96孔板的每个孔中加入22.5 µL等分试样，随后加入2.5 µL cDNA。使用粘性封板膜密封反应板，并在1000 ×g 条件下离心30秒。将反应板放入实时PCR系统中。通过输入实验名称来修改实验设置。然后选择96孔0.2毫升作为实验类型，以比较CT法作为定量方法，标准模式作为系统运行模式，SYBR Green试剂作为检测目标序列的试剂。为每个孔中的样品和目标miRNA提供名称。设置重复样品，选择一个参考样品和内参对照，并在被动参考染料处选择“无”。为避免试剂交叉污染，需为miRNA表达设置无逆转录酶的阴性对照和无模板对照。接下来，确保反应体系为20微升，PCR扩增循环条件设置为：95°C预变性15分钟，随后进行40个循环，每个循环包括94°C变性15秒、55°C退火30秒和70°C延伸30秒。程序完成后，单击“分析”以分析qRT-PCR数据。确认程序自动选择的阈值线是否适用于每个孔。检查每个样本中内源性对照和目标miRNA的阈值循环值。通过扩增曲线与阈值线的交点确定CT值。在年龄依赖性肾功能损伤模型中，miRNA qRT-PCR 数据显示，与 SAMR1 对照小鼠相比，SAMP1 实验小鼠肾脏中 miRNA-7219-5p 的水平显著升高，而 miRNA-7218-5p 的肾脏水平则下降。miRNA-223-3p 在两种小鼠品系中的表达水平均无变化。SAMP1 小鼠血清中 miRNA-7219-5p 和 miRNA-7218-5p 的水平均明显升高，而 miRNA-223-3p 的水平保持不变。应将针头插入下腔静脉并抽取血液，同时避免穿透血管壁。该方法可用于解答多种病理条件下小鼠血清中微小RNA表达谱研究中的关键问题。

quantitative-real-time-polymerase-chain-reaction-evaluation-microrna

Research

科研

JoVE Journal

Genetics

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了解如何使用qRT-PCR技术定量评估年龄依赖性肾损伤小鼠肾脏和血清中的microRNA表达水平。该方法具有高灵敏度和准确性，可用于研究肾脏疾病中的基因调控机制。

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