基于年龄相关性肾功能损伤小鼠肾脏与血清中微小RNA表达的定量实时聚合酶链式反应检测

该qRT-PCR方法可用于研究小鼠在年龄依赖性肾功能损伤等条件下血清中microRNA表达谱的相关问题。该技术通过简单流程实现对microRNA表达的高准确度和高灵敏度检测，节省时间并避免技术误差。首先，使用镊子和手术剪切开腹部皮肤。

从膀胱至肋骨左下缘切开腹膜上的肌肉。用镊子提起腹膜，使用手术剪在腹膜上缘做一侧向切口，然后沿肋骨最下缘继续延伸切口。

使用两个经 PBS 润湿的棉签识别下腔静脉。将连接1毫升注射器的30 G针头插入下腔静脉，并回抽注射器。缓慢拔出针头，以避免溶血。

将血液转移至含有肝素的1毫升尖底管中，通过倒置混匀。在室温下以3000 × g离心10分钟。将上清液转移至新的1.5毫升微量离心管中。

取200 µL血清样本，加入1,000 µL基于苯酚/胍的裂解试剂。涡旋混合5秒，在室温下孵育5分钟。加入200 µL氯仿，通过倒置离心管15次进行混合。

将样品在室温下孵育3分钟，随后进行离心。勿扰动沉淀，将上清液转移至新的1.5毫升微量离心管中。加入450 µL 100%乙醇，并涡旋振荡管子5秒。

然后将700 µL样品加载到膜固定的离心柱上，并进行离心。弃去穿流液，加入700 µL试剂盒中提供的洗涤缓冲液1。再次离心，并弃去穿流液。

用500微升洗涤缓冲液2重复洗涤，以去除痕量盐分。加入500微升80%乙醇，离心，并弃去收集管中的流穿液。再次离心吸附柱，然后将吸附柱转移至一个新的1.5毫升收集管中。

然后加入14 µL无RNase的水，在室温下孵育5分钟。再次在室温下以15000 ×g离心柱子1分钟。制备主混合液，并在8孔联管中每孔加入8 µL。

每个试管中加入12 µL提取的总RNA，在室温下以2000 × g离心15秒。将试管放入热循环仪中，开始孵育以合成cDNA。孵育结束后，将cDNA转移至新的微量离心管中。

用蒸馏水将cDNA稀释十倍。然后涡旋混匀，再在室温下以2000 × g离心5秒。在微量离心管中，按照文本方案所述配制预混液，并涡旋混匀该溶液。

向96孔板的每个孔中加入22.5 µL等分试样，随后加入2.5 µL cDNA。使用粘性封板膜密封反应板，并在1000 ×g 条件下离心30秒。将反应板放入实时PCR系统中。通过输入实验名称来修改实验设置。

然后选择96孔0.2毫升作为实验类型，以比较CT法作为定量方法，标准模式作为系统运行模式，SYBR Green试剂作为检测目标序列的试剂。为每个孔中的样品和目标miRNA提供名称。设置重复样品，选择一个参考样品和内参对照，并在被动参考染料处选择“无”。

为避免试剂交叉污染，需为miRNA表达设置无逆转录酶的阴性对照和无模板对照。接下来，确保反应体系为20微升，PCR扩增循环条件设置为：95°C预变性15分钟，随后进行40个循环，每个循环包括94°C变性15秒、55°C退火30秒和70°C延伸30秒。程序完成后，单击“分析”以分析qRT-PCR数据。

确认程序自动选择的阈值线是否适用于每个孔。检查每个样本中内源性对照和目标miRNA的阈值循环值。通过扩增曲线与阈值线的交点确定CT值。

在年龄依赖性肾功能损伤模型中，miRNA qRT-PCR 数据显示，与 SAMR1 对照小鼠相比，SAMP1 实验小鼠肾脏中 miRNA-7219-5p 的水平显著升高，而 miRNA-7218-5p 的肾脏水平则下降。miRNA-223-3p 在两种小鼠品系中的表达水平均无变化。SAMP1 小鼠血清中 miRNA-7219-5p 和 miRNA-7218-5p 的水平均明显升高，而 miRNA-223-3p 的水平保持不变。

应将针头插入下腔静脉并抽取血液，同时避免穿透血管壁。该方法可用于解答多种病理条件下小鼠血清中微小RNA表达谱研究中的关键问题。