内源性Drosophila瞬时受体电位通道的纯化

在本实验方案中，我们展示了纯化全长TRP通道的方法，这是研究果蝇全长TRP通道电生理特性并获取其结构信息所必需的第一步。基于INAD蛋白复合物的取样机制，并采用低成本但载量更高的镍珠，可从果蝇头部纯化出足量的TRP通道蛋白。本实验操作将由本实验室技术员Yuyang Liu演示。

首先，使用氯化钙热激转化法将 pGEX 4T-1 TRP 1261-1265 质粒转化至大肠杆菌 BL21 细胞中。挑取单菌落接种于 10 毫升 LB（Luria Bertani）培养基中，于 37°C 过夜培养。将 10 毫升种子培养物接种至 1 升 LB 培养基中，并在 37°C 下培养。

当细胞的光密度达到0.5后，将细胞冷却至16摄氏度，并加入0.1毫摩尔的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷。过表达完成后，通过离心收集一升培养细胞，再用40毫升磷酸盐缓冲液重悬。将重悬的细胞加入预冷至4摄氏度的高压均质器中。

缓慢将均质机压力升至 800 bar。打开入口阀，使重悬的细胞通过带有狭缝的阀门循环流动。将 5 毫升谷胱甘肽珠装入重力流层析柱中，用 50 毫升磷酸盐缓冲液洗涤珠子，共洗涤三次。

将来自高压均质机的细胞裂解液在48,384 ×g下离心。取约40毫升离心后裂解液的上清液，加入重力流层析柱中已平衡的谷胱甘肽珠，于4°C孵育30分钟，每10分钟重悬谷胱甘肽珠一次。孵育30分钟后，打开层析柱出口阀，分离珠子与流出组分。

弃去穿流部分，用 50 毫升磷酸盐缓冲液将剩余的谷胱甘肽珠清洗两次。向谷胱甘肽珠中加入 15 毫升洗脱缓冲液，每 10 分钟重悬一次珠子。将 GST 标签的 TRP 1261-1275 片段洗脱至一个 50 mL 锥形管中，然后上样至尺寸排阻色谱柱中。

每管收集五毫升洗脱的蛋白质，并在低温离心机中使用超滤离心柱通过离心将纯化的蛋白片段浓缩至一毫升。为纯化带有 His 标签的 NORPA 863-1095 片段，采用先前已展示的方法，使用镍珠进行纯化。将成年果蝇收集至 50 毫升锥形离心管中，并在液氮中冷冻 10 分钟。

用手剧烈振荡冷冻的离心管，将混合物转移至三个依次叠放的预冷不锈钢筛网中。振荡筛网，然后用刷子将40目筛网上的果蝇头部扫下。将其转移至5 mL离心管中，并于-80 °C保存。

使用预冷的研钵和研杵在液氮中匀浆0.5克头部组织。将匀浆后的头部组织溶于5毫升10倍裂解缓冲液中，随后在4摄氏度下以20,817 ×g离心20分钟。将上清液进一步在4摄氏度下以100,000 ×g离心60分钟。

将1毫升镍珠加入重力流层析柱中，用10毫升4摄氏度的双蒸水洗涤镍珠三次。用10倍柱体积的裂解缓冲液在4摄氏度下平衡镍珠三次。将500微升浓度为600微摩尔的纯化His标签NORPA 863-1095蛋白加入镍柱中，并孵育该层析柱。

每10分钟重悬珠子一次。打开柱子出口活塞，分离珠子与流出组分，用10毫升冷裂解缓冲液洗涤镍珠。随后，将果蝇头部匀浆的冷上清液加入镍柱中。

孵育后，用10毫升裂解缓冲液洗涤珠子，并向珠子中加入500微升600微摩尔的GST标签TRP 1261-1275蛋白。从重力柱中收集洗脱组分。用10毫升结合缓冲液洗涤镍珠。

然后，加入洗脱缓冲液，并从重力流层析柱中收集洗脱组分。使用4 mL超滤离心柱浓缩从黑腹果蝇TRP通道纯化中洗脱的各组分。将样品注入尺寸排阻层析柱，并以适当的流速洗脱蛋白质。

在大肠杆菌细胞中表达GST标签的TRP 1261-1275片段，并使用谷胱甘肽磁珠和尺寸排阻柱进行纯化。类似地，表达His标签的NORPA 863-1095片段，并使用镍磁珠和尺寸排阻柱进行纯化。通过尺寸排阻色谱法将洗脱的TRP通道与过量的GST标签TRP 1261-1275肽分离。

作为副产物，在TRP 1261-1275肽竞争后可获得INAD、ePKC和NORPA 863-1095复合物。进行该实验方案时最重要的一点是，需在液氮中匀浆果蝇头部，并将匀浆物溶解于含有去污剂DDM的缓冲液中。通过此方法，我们还可纯化完整的INAD蛋白复合物，用于研究其组装及调控机制。

该方法未来可能的应用之一是利用冷冻电镜技术研究内源性果蝇TRP通道的结构信息。此外，在人工双层脂膜中测量纯化的内源性果蝇TRP通道的电生理特性也是可行的。