Name: 内源性 果蝇 瞬时受体电位通道的纯化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: 学习利用改良亲和纯化策略从果蝇头部提取内源性TRP通道的方法。该技术基于INAD蛋白复合物机制，使用高容量镍珠实现全长TRP通道的高效纯化，为研究其电生理特性和结构信息提供基础。

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本工作得到国家自然科学基金（No. 31870746）、深圳市基础研究计划（JCYJ20200109140414636）和中国广东省自然科学基金（No. 2021A1515010796）对 W. L. 的资助。我们感谢 LetPub（www.letpub.com）在本论文撰写过程中提供的语言学协助。

1. GST标签TRP和His标签NORPA片段的纯化
<ol>
	<li>纯化带有 GST 标签的 TRP 1261-1275 片段
	<ol>
		<li>转化 pGEX 4T-1 TRP 1261-1275 质粒10 进入 大肠杆菌（Escherichia coli） BL21 (DE3) 细胞采用 CaCl₂2 热激转化法21. 挑取单菌落接种于10 mL Luria Bertani（LB）培养基中，37℃过夜培养 &#176;C. 然后，在37℃下将10 mL种子培养物扩增至1 L LB培养基中 &#176;C.</li>
		<li>在光密度（OD600) 细胞密度达到 0.5 时，将细胞冷却至 16 &#176;C，并加入 0.1 mM 异丙基-β-硫代半乳糖苷 &#946;-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG；终浓度）以诱导目标蛋白的过表达，并于16℃培养 &#176;4 ℃孵育 18 小时。</li>
		<li>过表达后，通过在 3,993 × g 离心收集 1 L 培养细胞菌体&#160;&#215; g&#160;孵育20分钟，然后重悬于40 mL磷酸盐缓冲液（PBS）中。</li>
		<li>将重悬的细胞加入预冷至4℃的高压均质机中 &#176;C. 缓慢将匀浆器压力升至 800 bar。打开入口旋塞，使重悬的细胞循环通过具有极窄狭缝的阀门。 
		注意：细胞通过由大压降和空化作用引起的高度剪切力进行匀浆。</li>
		<li>将5 mL谷胱甘肽琼脂糖珠装入重力流层析柱中，用50 mL PBS缓冲液洗涤琼脂糖珠，共洗涤三次。</li>
		<li>将来自高压均质机的细胞裂解液在 48,384 x g将离心后的细胞裂解液上清液（40 mL）加入重力流层析柱中已平衡的谷胱甘肽琼脂糖珠，4 ℃孵育30分钟 &#176;C. 每10分钟重悬一次谷胱甘肽珠。</li>
		<li>孵育30分钟后，打开柱出口活塞，分离珠子与流出组分。弃去流出组分。用50 mL PBS缓冲液将剩余的谷胱甘肽珠子洗涤两次。</li>
		<li>向谷胱甘肽琼脂糖珠中加入15 mL洗脱缓冲液，孵育30分钟，每10分钟重悬一次珠子。</li>
		<li>孵育30分钟后，将GST标签的TRP 1261-1275片段洗脱至50 mL锥形管中，并上样至尺寸排阻层析柱（制备级），该层析柱已用50 mM Tris缓冲液（pH 7.5，100 mM NaCl，1 mM EDTA，1 mM DTT）平衡。</li>
		<li>将凝胶过滤柱的洗脱流速保持在3 mL/min，以每管5 mL的速率收集洗脱出的蛋白质。</li>
		<li>通过分析尺寸排阻柱在280 nm处的紫外吸收信号确定目标蛋白的峰，并通过SDS-PAGE凝胶电泳验证（电泳参数：浓缩胶150 V，分离胶200 V）。使用考马斯亮蓝R250染色凝胶。</li>
		<li>使用 15 mL 超滤离心管，在 3,000 x g 条件下离心，将从凝胶过滤柱中纯化的 GST 标签 TRP 1261-1275 片段浓缩至 1 mL g 在4℃下 &#176;在台式制冷离心机中离心。</li>
		<li>使用比尔-朗伯定律测定浓缩蛋白的浓度。利用分光光度计在280 nm处测定GST标签的TRP 1261-1275片段的紫外吸收值。</li>
		<li>通过将蛋白质序列导入 Protparam 程序（https://web.expasy.org/protparam/）获取在 280 nm 处的消光系数。通常，1 L 表达 GST 标签 TRP 1261-1275 的培养液可获得 1 mL 浓度为 600 &#956;M 的蛋白质（6 × 10）-7 摩尔）。参见 表1 所需材料。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>His标签NORPA 863-1095片段的纯化
	<ol>
		<li>转化 pETM.3C NORPA 863-1095 质粒20 进入 大肠杆菌 BL21 (DE3) 细胞采用 CaCl₂2 热激转化法21. 挑取单菌落接种于10 mL LB培养基中，37℃过夜培养 &#176;C. 然后，在37℃下，将10 mL种子培养物扩增于1 L LB培养基中 &#176;C.</li>
		<li>OD测定后600 当细胞密度达到0.5时，将细胞冷却至16 &#176;C，加入0.1 mM IPTG（终浓度）以诱导目标蛋白的过表达，并于16℃继续培养 &#176;4 ℃孵育 18 小时。</li>
		<li>过表达后，通过在 3,993 × g 离心收集 1 L 培养细胞菌体&#160;x g&#160;孵育20分钟，然后在40 mL结合缓冲液中重悬。接着，在4 ℃下使用高压均质机裂解重悬的细胞 &#176;C，如步骤 1.1.4 中所述。</li>
		<li>将5 mL Ni-琼脂糖珠装入重力流层析柱，用50 mL结合缓冲液洗涤三次。</li>
		<li>将来自高压均质器的细胞裂解液在 48,384 x g将离心后的细胞裂解液上清液加入重力流层析柱中已平衡的 Ni-琼脂糖微珠，4 ℃孵育 30 分钟 &#176;C. 每10分钟重悬一次Ni-琼脂糖珠。</li>
		<li>孵育30分钟后，打开柱出口活塞，分离珠子与流出组分。弃去流出组分，并用50 mL洗涤缓冲液将剩余的Ni-珠子洗涤两次。</li>
		<li>向 Ni-beads 中加入 15 mL 洗脱缓冲液，孵育 30 分钟。每 10 分钟重悬 Ni-beads 一次。</li>
		<li>孵育30分钟后，收集洗脱的His标签NORPA 863-1095片段至50 mL锥形管中，并上样至已用50 mM Tris（pH 7.5，100 mM NaCl，1 mM EDTA，1 mM DTT）平衡的尺寸排阻层析柱（制备级）。</li>
		<li>将凝胶过滤柱的洗脱流速保持在3 mL/min，以每管5 mL收集洗脱蛋白。</li>
		<li>通过分析尺寸排阻柱在280 nm处的紫外吸收信号确定目标蛋白的峰，并通过SDS-PAGE凝胶电泳验证（电泳参数：浓缩胶150 V，分离胶200 V）。使用考马斯亮蓝R250染色凝胶。</li>
		<li>使用 15 mL 超滤离心管，在 3,000 x g 条件下离心，将从凝胶过滤柱中纯化的 His 标签 NORPA 863-1095 片段浓缩至 1 mL g 4 ℃时 &#176;在台式制冷离心机中离心。</li>
		<li>使用比尔-朗伯定律测定浓缩蛋白的浓度。利用分光光度计在280 nm处测定His标签NORPA 863-1095片段的紫外吸收值。</li>
		<li>通过将蛋白质序列导入 Protparam 程序（https://web.expasy.org/protparam/）获取在 280 nm 处的消光系数。通常，1 L 培养的 His 标签 NORPA 863-1095 片段可获得 1 mL 浓度为 600 &#956;M 的蛋白质（6 × 10）-7 摩尔）。参见 表 2 所需材料。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 准备 果蝇 头部
<ol>
	<li>使用 CO2 麻醉法将成年果蝇收集到 50 mL 圆锥形离心管中22,23；立即在液氮中冷冻 10 分钟，并储存于 -80°C 冰箱中。</li>
	<li>收集足够数量的果蝇后，手动剧烈振荡冷冻的 50 mL 圆锥形管，以分离果蝇的腿部、头部、翅膀和身体。将混合物转移至三个依次叠放的预冷不锈钢筛网（筛网目数分别为 20、30 和 40）中，并振荡筛网。</li>
	<li>随后，由于头部无法通过 40 目筛网，使用刷子将果蝇头部从 40 目筛网上扫下，转移至 50 mL 圆锥形管中，并在 −80 °C 下保存。</li>
	<li>持续收集果蝇及其头部，并储存在 -80 °C 冰箱中，直至达到实验所需的数量（0.5 g）。通常，收集 0.5 g 头部需要 50 mL 圆锥形管中的果蝇约 35 mL。所需材料见表 3。</li>
</ol>
3. Drosophila TRP 通道纯化
<ol>
	<li>称取总计 0.5 g 头部组织，使用预冷的研钵和研杵在液氮中彻底匀浆。将匀浆后的头部组织溶于 10 倍体积/重量的裂解缓冲液（5 mL）中，4 °C 条件下在摇床中孵育 &#176;C 下 20 分钟，然后在 20,817 x g 4℃下持续20分钟 &#176;C.</li>
	<li>收集离心后的上清液（&#34;20817 g S&#34;, 图4) 并在 100,000 x g 在4℃下持续60分钟 &#176;C. 使用离心后的上清液（&#34;100,000 g S&#34;, 图4用于以下的下拉实验。</li>
	<li>将1 mL Ni-琼脂糖珠加入重力流层析柱中，用10 mL双蒸水洗涤琼脂糖珠2O (ddH₂O)24 ℃下 &#176;C，共三次。用10个柱体积的裂解缓冲液在4℃下平衡珠子三次 &#176;C.</li>
	<li>加入500 &#181;600 L &#181;M 纯化的 His 标签 NORPA 863-1095 蛋白（3 × 10-7 将 mol) 加入 Ni 柱中，在 4 °C 下孵育 30 分钟 &#176;C. 每10分钟重悬一次珠子。</li>
	<li>打开柱出口活塞，分离珠子与流出组分。取流出组分进行SDS-PAGE分析（NORPA F， 图4在此部分，将诱饵蛋白固定于镍珠上。</li>
	<li>用 10 柱体积（10 mL）裂解缓冲液在 4 ℃ 下洗涤 Ni-琼脂糖珠 &#176;C，并将洗涤组分保留用于SDS-PAGE分析（洗涤1， 图4A）。重复上述步骤，并将样品保留用于SDS-PAGE分析（洗涤2， 图4A在此步骤中，去除Ni-琼脂糖珠上过量的诱饵蛋白。</li>
	<li>加入上清液 果蝇 100,000 × g 离心后的头部匀浆 g 在4℃下通过离心将样品加入Ni柱中 &#176;C，其中His标签的NORPA 863-1095片段已被固定。</li>
	<li>将上清液与 Ni-beads 在 4 °C 下孵育 &#176;在30分钟内每10分钟重悬一次珠子。然后打开柱出口活塞，分离珠子与流出组分。</li>
	<li>收集上清液用于SDS-PAGE分析（Dro head lysis F， 图4A在此部分，通过固定在Ni-琼脂糖珠上的NORPA 863-1095片段捕获头部匀浆中的INAD蛋白复合物（INAD/TRP/ePKC）。</li>
	<li>用 10 倍柱体积的裂解缓冲液（10 mL）在 4 ℃ 下洗涤 Ni-琼脂糖珠 &#176;C，将重力沉淀后的上清液保留用于SDS-PAGE分析（洗涤3， 图4A）。重复上述步骤，并收集上清液用于SDS-PAGE分析（洗涤4， 图4A在此步骤中，去除Ni-琼脂糖珠上未结合的蛋白质。</li>
	<li>加入500 &#181;600 L &#181;M 的 GST 标签 TRP 1261-1275 蛋白（3 × 10-7 将 mol 加入 Ni-珠中，在 4 °C 下孵育 20 分钟 &#176;C. 每10分钟重悬一次珠子。</li>
	<li>从重力柱中收集洗脱组分（TRP E1， 图4B），其中含有内源性的 果蝇 TRP 通道。重复上述步骤，收集洗脱组分（TRP E2， 图4B在此步骤中，利用GST标签的TRP 1261-1275片段作为竞争剂，将TRP通道从Ni-琼脂糖珠上捕获的INAD蛋白复合物（INAD/TRP/ePKC）中洗脱下来。</li>
	<li>用 10 倍柱体积的结合缓冲液（10 mL）洗涤 Ni-琼脂糖珠 表1) 在 4 &#176;C，收集洗涤组分用于 SDS-PAGE 分析（洗涤 5， 图4B).</li>
	<li>加入500 &#181;洗脱缓冲液 L（表1)加入Ni-琼脂糖珠中，4℃孵育20分钟 &#176;C. 收集重力流柱的洗脱组分（NORPA E1， 图4B）。重复上述步骤，收集洗脱组分（NORPA E2， 图4B).</li>
	<li>使用洗脱缓冲液洗脱伴随 INAD/ePKC 蛋白复合物的 His 标签 NORPA 863-1095 片段。接着，将 Ni 珠重悬于 500 &#181;L 结合缓冲液。</li>
	<li>将重悬的Ni-琼脂糖珠取样进行SDS-PAGE（考马斯亮蓝R250染色），以分析洗脱效率并评估洗脱缓冲液是否有效（琼脂糖珠， 图4B）。参见 表 4 所需材料。</li>
</ol>
4. 凝胶过滤层析纯化 果蝇 TRP通道
<ol>
	<li>在蛋白纯化系统上安装尺寸排阻色谱柱（分析级），并用色谱柱缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 7.5，150 mM NaCl，2 mM DTT，0.75 mM DDM）平衡色谱柱，缓冲液需经0.45 µm滤膜过滤。</li>
	<li>使用4 mL超滤离心管，在4 °C下以3,000 x g离心，浓缩第3.14步获得的TRP E1和E2组分。</li>
	<li>用色谱柱缓冲液冲洗进样环，将样品加入进样环中，然后将样品注入尺寸排阻色谱柱，并以适当的流速（0.5 mL/min）洗脱蛋白。</li>
	<li>通过280 nm处的吸光度确定目标蛋白的峰，并运行SDS-PAGE凝胶以检测纯化的内源性Drosophila TRP通道（图5）。所需材料见表5。</li>
</ol>

<ol><li>Tsunoda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multivalent+PDZ-domain+protein+assembles+signalling+complexes+in+a+G-protein-coupled+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A multivalent PDZ-domain protein assembles signalling complexes in a G-protein-coupled cascade.</a> Nature. 388 (6639), 243-249 (1997).</li>
<li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+TRP+channels+by+protons+and+phosphoinositide+depletion+in+Drosophila+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%3A+CB%22%5BJournal%5D)">Activation of TRP channels by protons and phosphoinositide depletion in Drosophila photoreceptors.</a> Current Biology: CB. 20 (3), 189-197 (2010).</li>
<li>Chyb, S., Raghu, P., Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyunsaturated+fatty+acids+activate+the+Drosophila+light-sensitive+channels+TRP+and+TRPL%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Polyunsaturated fatty acids activate the Drosophila light-sensitive channels TRP and TRPL.</a> Nature. 397 (6716), 255-259 (1999).</li>
<li>Hardie, R. C., Franze, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photomechanical+responses+in+Drosophila+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Photomechanical responses in Drosophila photoreceptors.</a> Science. 338 (6104), 260-263 (2012).</li>
<li>Chen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calmodulin+binds+to+Drosophila+TRP+with+an+unexpected+mode%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Calmodulin binds to Drosophila TRP with an unexpected mode.</a> Structure. 29 (4), 330-344 (2021).</li>
<li>Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+intracellular+Ca2%2B+chelation+on+the+light+response+in+Drosophila+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Physiology.+A%2C+Sensory%2C+Neural%2C+and+Behavioral+Physiology%22%5BJournal%5D)">Effects of intracellular Ca2+ chelation on the light response in Drosophila photoreceptors.</a> Journal of Comparative Physiology. A, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 177 (6), 707-721 (1995).</li>
<li>Scott, K., Sun, Y., Beckingham, K., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calmodulin+regulation+of+Drosophila+light-activated+channels+and+receptor+function+mediates+termination+of+the+light+response+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Calmodulin regulation of Drosophila light-activated channels and receptor function mediates termination of the light response in vivo.</a> Cell. 91 (3), 375-383 (1997).</li>
<li>Hardie, R. C., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoinositide-mediated+phototransduction+in+Drosophila+photoreceptors%3A+the+role+of+Ca2%2B+and+trp%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Phosphoinositide-mediated phototransduction in Drosophila photoreceptors: the role of Ca2+ and trp.</a> Cell Calcium. 18 (4), 256-274 (1995).</li>
<li>Delgado, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+opening+of+the+TRP+channel+in+isolated+membrane+patches+excised+from+photosensitive+microvilli+from+Drosophila+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Light-induced opening of the TRP channel in isolated membrane patches excised from photosensitive microvilli from Drosophila photoreceptors.</a> Neuroscience. 396, 66-72 (2019).</li>
<li>Lev, S., Katz, B., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+activity+of+the+TRP-like+channel+depends+on+its+expression+system%5BTitle%5D)+AND+%22Channels+%28Austin%29%22%5BJournal%5D)">The activity of the TRP-like channel depends on its expression system.</a> Channels (Austin). 6 (2), 86-93 (2012).</li>
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<li>Rahimzadeh, M., Sadeghizadeh, M., Najafi, F., Arab, S., Mobasheri, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+heat+shock+step+on+bacterial+transformation+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Impact of heat shock step on bacterial transformation efficiency.</a> Molecular Biology Research Communications. 5 (4), 257-261 (2016).</li>
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<li>Arachea, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detergent+selection+for+enhanced+extraction+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">Detergent selection for enhanced extraction of membrane proteins.</a> Protein Expression and Purification. 86 (1), 12-20 (2012).</li>
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INAD 含有五个 PDZ 结构域，是 Drosophila 光传导机制的核心组织者。先前的研究表明，INAD 的 PDZ3 结构域以极高的特异性结合 TRP 通道的 C 末端尾部（KD = 0.3 µM）18。INAD 的 PDZ45 串联结构域与 NORPA 的 863-1095 片段具有极强的结合亲和力（KD = 30 nM）。这些发现为设计亲和纯化结合竞争策略提供了坚实的生物化学基础，使得 NORPA 的 CC-PBM 片段可作为拉下实验的诱饵，而 TRP 的 C 末端尾部（片段 1261-1275）则作为竞争性试剂发挥作用。因此，该方法的第一个关键点在于理解 INAD 复合物的组装机制，并获得足量的 NORPA 和 TRP 片段。同时，由于 TRP 通道是一种膜蛋白，需要从膜中提取并在溶液中保持稳定，因此去垢剂的使用是该方法的第二个关键点。作为一种常用于 TRP 通道结构与功能研究的去垢剂24,25，正...

光转导是一个将吸收的光子转化为神经元电信号的过程。该过程在脊椎动物和无脊椎动物中均特异性地依赖视蛋白及其下游的G蛋白偶联信号级联反应。在 果蝇， 通过其五个PDZ结构域，支架蛋白inactivation-no-after-potential D（INAD）组织形成一个包含瞬时受体电位（TRP）通道、磷脂酶Cβ/无受体电位A（PLCβ/NORPA）以及眼特异性蛋白激酶C（ePKC）的超分子信号复合物1该超分子信号复合物的形成确保了其正确的亚细胞定位、高效性及特异性 黑腹果蝇 光转导机制。在此复合物中，光敏感的TRP通道作为NORPA的下游效应器，介导钙离子内流和感光细胞的去极化。先前的研究表明，TRP通道的开放 黑腹果蝇 TRP通道由质子、局部脂质环境的破坏或机械力介导2,3,4。该 果蝇 TRP 通道也与钙调蛋白相互作用5 并通过正反馈和负反馈受钙的调节6,7,8.
迄今为止，关于门控机制的电生理学研究 果蝇 TRP 和 TRP 样（TRPL）通道基于分离的野生型细胞的膜片钳记录和全细胞记录 黑腹果蝇 光感受器，以及在S2、SF9或HEK细胞中异源表达的通道2,9,10,11,12,13，但不作用于纯化的通道。全长蛋白的结构信息 黑腹果蝇 TRP 通道的机制仍不明确。为了在重建的膜环境中研究纯化蛋白的电生理特性，并获得全长蛋白的结构信息 果蝇 TRP通道，获得纯化的全长TRP通道是必要的第一步，类似于哺乳动物TRP通道研究中所采用的方法14,15,16,17.
最近，基于INAD蛋白复合物的组装机制18,19,20，研究人员首次开发了一种亲和纯化结合竞争策略，利用链霉亲和素磁珠从黑腹果蝇（Drosophila）头部匀浆中纯化TRP通道蛋白5。鉴于链霉亲和素磁珠容量较低且成本较高，本文介绍了一种改进的纯化方案，该方案采用带有His标签的诱饵蛋白及相应低成本的镍柱磁珠（Ni-beads），后者具有更高的结合容量。该方法将有助于从结构角度研究TRP通道的门控机制，并利用纯化的蛋白测量TRP通道的电生理特性。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;细菌菌株&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;BL21(DE3) 感受态细胞&lt;/em&gt;</td><td>Novagen</td><td>69450</td><td>蛋白过表达</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;实验模型&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>D.melanogaster: W&lt;sup&gt;1118&lt;/sup&gt; 品系</td><td>布卢明顿果蝇资源中心</td><td>BDSC:3605</td><td>&lt;em&gt;果蝇&lt;/em&gt;头部制备</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20/30/40 目不锈钢筛网</td><td>九丰金属网公司</td><td>GB/T6003.1</td><td>&lt;em&gt;果蝇&lt;/em&gt;头部制备</td></tr><tr><td>30% 丙烯酰胺-N,N&amp;prime;-亚甲基双丙烯酰胺（29:1）</td><td>Lablead</td><td>A3291</td><td>SDS-PAGE 凝胶制备</td></tr><tr><td>过硫酸铵</td><td>Invitrogen</td><td>HC2005</td><td>SDS-PAGE 凝胶制备</td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合物</td><td>Roche</td><td>05892953001</td><td>蛋白酶抑制</td></tr><tr><td>考马斯亮蓝 R-250</td><td>生工生物</td><td>A100472-0025</td><td>SDS-PAGE 凝胶染色</td></tr><tr><td>DL-二硫苏糖醇（DTT）</td><td>生工生物</td><td>A620058-0100</td><td>凝胶过滤层析缓冲液制备</td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸二钠盐（EDTA）</td><td>生工生物</td><td>A500838-0500</td><td>凝胶过滤层析缓冲液制备</td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>生工生物</td><td>A610235-0005</td><td>SDS-PAGE 缓冲液制备</td></tr><tr><td>谷胱甘肽 Sepharose 4 快流速珠</td><td>Cytiva</td><td>17513202</td><td>亲和层析</td></tr><tr><td>咪唑</td><td>生工生物</td><td>A500529-0001</td><td>Ni柱洗脱缓冲液制备</td></tr><tr><td>异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）</td><td>生工生物</td><td>A600168-0025</td><td>蛋白过表达诱导</td></tr><tr><td>LB 培养基粉末</td><td>生工生物</td><td>A507002-0250</td><td>&lt;em&gt;大肠杆菌&lt;/em&gt;细胞培养</td></tr><tr><td>还原型 L-谷胱甘肽（GSH）</td><td>Sigma-aldrich</td><td>G4251-100G</td><td>谷胱甘肽珠洗脱缓冲液制备</td></tr><tr><td>Ni-Sepharose excel 珠</td><td>Cytiva</td><td>17371202</td><td>亲和层析</td></tr><tr><td>N-十二烷基-β-D-麦芽糖苷（DDM）</td><td>生工生物</td><td>A610424-001</td><td>蛋白纯化用去垢剂</td></tr><tr><td>N,N,N',N'-四甲基乙二胺（TEMED）</td><td>Sigma-aldrich</td><td>T9281-100ML</td><td>SDS-PAGE 凝胶制备</td></tr><tr><td>PBS</td><td>生工生物</td><td>E607008-0500</td><td>&lt;em&gt;大肠杆菌&lt;/em&gt;细胞匀浆缓冲液</td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Lablead</td><td>P0754-25G</td><td>蛋白酶抑制</td></tr><tr><td>预染蛋白 Marker</td><td>Thermo Scientific</td><td>26619/26616</td><td>预染蛋白 ladder</td></tr><tr><td>凝胶过滤层析柱（制备级）</td><td>Cytiva</td><td>28989336</td><td>HiLoad 26/60 Superdex 200 PG 柱</td></tr><tr><td>凝胶过滤层析柱（分析级）</td><td>Cytiva</td><td>29091596</td><td>Superose 6 Increase 10/300 GL 柱</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>生工生物</td><td>A501218-0001</td><td>蛋白纯化缓冲液制备</td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠（SDS）</td><td>生工生物</td><td>A500228-0001</td><td>SDS-PAGE 凝胶/缓冲液制备</td></tr><tr><td>Tris 碱</td><td>Sigma-aldrich</td><td>T1503-10KG</td><td>蛋白纯化缓冲液制备</td></tr><tr><td>超滤离心管</td><td>Millipore</td><td>UFC901096/801096</td><td>蛋白浓缩</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>分析天平</td><td>DENVER</td><td>APX-60</td><td>&lt;em&gt;果蝇&lt;/em&gt;头部称重</td></tr><tr><td>适用于 15 mL 和 50 mL 锥形离心管的台式高速冷冻离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td>蛋白浓缩</td></tr><tr><td>适用于 1.5 mL 离心管的台式高速冷冻离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td>匀浆后&lt;em&gt;果蝇&lt;/em&gt;头部裂解液离心</td></tr><tr><td>空重力流层析柱（内径=1.0 cm）</td><td>Bio-Rad</td><td>738-0015</td><td>TRP 蛋白纯化</td></tr><tr><td>空重力流层析柱（内径=2.5 cm）</td><td>Bio-Rad</td><td>738-0017</td><td>从&lt;em&gt;大肠杆菌&lt;/em&gt;中纯化诱饵蛋白和竞争蛋白</td></tr><tr><td>凝胶成像系统</td><td>Bio-Rad</td><td>Universal Hood II Gel Doc XR 系统</td><td>SDS-PAGE 成像</td></tr><tr><td>高速冷冻离心机</td><td>Beckman coulter</td><td>Avanti J-26 XP</td><td>&lt;em&gt;大肠杆菌&lt;/em&gt;细胞/细胞裂解液离心</td></tr><tr><td>高压均质机</td><td>UNION-BIOTECH</td><td>UH-05</td><td>&lt;em&gt;大肠杆菌&lt;/em&gt;细胞匀浆</td></tr><tr><td>液氮罐</td><td>Taylor-Wharton</td><td>CX-100</td><td>&lt;em&gt;果蝇&lt;/em&gt;头部制备</td></tr><tr><td>蛋白纯化系统</td><td>Cytiva</td><td>AKTA purifier</td><td>蛋白纯化</td></tr><tr><td>冰箱（-80&amp;deg;C）</td><td>Thermo</td><td>900GP</td><td>&lt;em&gt;果蝇&lt;/em&gt;头部制备</td></tr><tr><td>分光光度计</td><td>MAPADA</td><td>UV-1200</td><td>&lt;em&gt;大肠杆菌&lt;/em&gt;细胞 OD600 测定</td></tr><tr><td>分光光度计</td><td>Thermo Scientific</td><td>NanoDrop 2000c</td><td>蛋白浓度测定</td></tr><tr><td>超速离心机</td><td>Beckman coulter</td><td>Optima XPN-100 超速离心机</td><td>超速离心</td></tr></tbody></table>

内源性drosophila瞬时受体电位通道的纯化

Purification of Endogenous Drosophila Transient Receptor Potential Channels

Drosophila 光转导是目前已知最快的G蛋白偶联信号通路之一。为了确保该信号级联的特异性和高效性，钙离子（Ca2+）可通透的阳离子通道——瞬态感受器电位（TRP）通道——与支架蛋白无后电位D（INAD）紧密结合，并与眼组织特异性的蛋白激酶C（ePKC）以及磷脂酶Cβ/无感受器电位A（PLCβ/NORPA）共同形成一个大型信号蛋白复合物。然而，Drosophila TRP通道的生化特性仍不明确。基于INAD蛋白复合物的组装机制，本研究建立了一种改进的亲和纯化结合竞争策略，用于纯化内源性TRP通道。首先，将纯化的带有组氨酸（His）标签的NORPA 863-1095片段结合至镍柱（Ni-beads），作为诱饵从Drosophila 头部匀浆中捕获内源性INAD蛋白复合物。随后，向镍柱中加入过量的纯化谷胱甘肽S-转移酶（GST）标签TRP 1261-1275片段，以竞争性置换TRP通道。最后，通过尺寸排阻色谱法将上清液中的TRP通道与过量的TRP 1261-1275肽段分离。该方法使得从生物化学和结构角度研究Drosophila TRP通道的门控机制成为可能。未来还可进一步检测纯化后的Drosophila TRP通道的电生理特性。

本文展示了一种蛋白质纯化方法，用于纯化内源性的Drosophila TRP通道（图1）。
首先，通过重组蛋白表达与纯化方法获得诱饵蛋白和竞争蛋白。随后，在LB培养基中于E. coli BL21 (DE3)细胞中表达带有GST标签的TRP 1261-1275片段，并利用谷胱甘肽磁珠及尺寸排阻柱进行纯化（图2）。样品通过考马斯亮蓝R250染色的SDS-PAGE分析进行验证。在SDS-PAGE样品制备过程中，将30 µL蛋白样品与10 µL 4x上样缓冲液混合，在100 °C下煮沸10分钟，然后将15 µL煮沸后的样品分别加入各加样孔中。带有His标签的NORPA 863-1095片段同样在LB培养基中的E. coli BL21 (DE3)细胞中表达，并通过Ni磁珠和尺寸排阻柱进行纯化（图3）。纯化后的GST标签TRP 1261-1275和His标签NORP...

根据INAD蛋白复合物的组装机制，本方案采用改良的亲和纯化结合竞争策略，以纯化内源性的Drosophila TRP通道。

内源性Drosophila瞬时受体电位通道的纯化

果蝇光转导是目前已知最快的G蛋白偶联信号通路之一。为确保该级联反应的特异性和高效性，……

在本实验方案中，我们展示了纯化全长TRP通道的方法，这是研究果蝇全长TRP通道电生理特性并获取其结构信息所必需的第一步。基于INAD蛋白复合物的取样机制，并采用低成本但载量更高的镍珠，可从果蝇头部纯化出足量的TRP通道蛋白。本实验操作将由本实验室技术员Yuyang Liu演示。首先，使用氯化钙热激转化法将 pGEX 4T-1 TRP 1261-1265 质粒转化至大肠杆菌 BL21 细胞中。挑取单菌落接种于 10 毫升 LB（Luria Bertani）培养基中，于 37°C 过夜培养。将 10 毫升种子培养物接种至 1 升 LB 培养基中，并在 37°C 下培养。当细胞的光密度达到0.5后，将细胞冷却至16摄氏度，并加入0.1毫摩尔的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷。过表达完成后，通过离心收集一升培养细胞，再用40毫升磷酸盐缓冲液重悬。将重悬的细胞加入预冷至4摄氏度的高压均质器中。缓慢将均质机压力升至 800 bar。打开入口阀，使重悬的细胞通过带有狭缝的阀门循环流动。将 5 毫升谷胱甘肽珠装入重力流层析柱中，用 50 毫升磷酸盐缓冲液洗涤珠子，共洗涤三次。将来自高压均质机的细胞裂解液在48,384 ×g下离心。取约40毫升离心后裂解液的上清液，加入重力流层析柱中已平衡的谷胱甘肽珠，于4°C孵育30分钟，每10分钟重悬谷胱甘肽珠一次。孵育30分钟后，打开层析柱出口阀，分离珠子与流出组分。弃去穿流部分，用 50 毫升磷酸盐缓冲液将剩余的谷胱甘肽珠清洗两次。向谷胱甘肽珠中加入 15 毫升洗脱缓冲液，每 10 分钟重悬一次珠子。将 GST 标签的 TRP 1261-1275 片段洗脱至一个 50 mL 锥形管中，然后上样至尺寸排阻色谱柱中。每管收集五毫升洗脱的蛋白质，并在低温离心机中使用超滤离心柱通过离心将纯化的蛋白片段浓缩至一毫升。为纯化带有 His 标签的 NORPA 863-1095 片段，采用先前已展示的方法，使用镍珠进行纯化。将成年果蝇收集至 50 毫升锥形离心管中，并在液氮中冷冻 10 分钟。用手剧烈振荡冷冻的离心管，将混合物转移至三个依次叠放的预冷不锈钢筛网中。振荡筛网，然后用刷子将40目筛网上的果蝇头部扫下。将其转移至5 mL离心管中，并于-80 °C保存。使用预冷的研钵和研杵在液氮中匀浆0.5克头部组织。将匀浆后的头部组织溶于5毫升10倍裂解缓冲液中，随后在4摄氏度下以20,817 ×g离心20分钟。将上清液进一步在4摄氏度下以100,000 ×g离心60分钟。将1毫升镍珠加入重力流层析柱中，用10毫升4摄氏度的双蒸水洗涤镍珠三次。用10倍柱体积的裂解缓冲液在4摄氏度下平衡镍珠三次。将500微升浓度为600微摩尔的纯化His标签NORPA 863-1095蛋白加入镍柱中，并孵育该层析柱。每10分钟重悬珠子一次。打开柱子出口活塞，分离珠子与流出组分，用10毫升冷裂解缓冲液洗涤镍珠。随后，将果蝇头部匀浆的冷上清液加入镍柱中。孵育后，用10毫升裂解缓冲液洗涤珠子，并向珠子中加入500微升600微摩尔的GST标签TRP 1261-1275蛋白。从重力柱中收集洗脱组分。用10毫升结合缓冲液洗涤镍珠。然后，加入洗脱缓冲液，并从重力流层析柱中收集洗脱组分。使用4 mL超滤离心柱浓缩从黑腹果蝇TRP通道纯化中洗脱的各组分。将样品注入尺寸排阻层析柱，并以适当的流速洗脱蛋白质。在大肠杆菌细胞中表达GST标签的TRP 1261-1275片段，并使用谷胱甘肽磁珠和尺寸排阻柱进行纯化。类似地，表达His标签的NORPA 863-1095片段，并使用镍磁珠和尺寸排阻柱进行纯化。通过尺寸排阻色谱法将洗脱的TRP通道与过量的GST标签TRP 1261-1275肽分离。作为副产物，在TRP 1261-1275肽竞争后可获得INAD、ePKC和NORPA 863-1095复合物。进行该实验方案时最重要的一点是，需在液氮中匀浆果蝇头部，并将匀浆物溶解于含有去污剂DDM的缓冲液中。通过此方法，我们还可纯化完整的INAD蛋白复合物，用于研究其组装及调控机制。该方法未来可能的应用之一是利用冷冻电镜技术研究内源性果蝇TRP通道的结构信息。此外，在人工双层脂膜中测量纯化的内源性果蝇TRP通道的电生理特性也是可行的。

purification-endogenous-drosophila-transient-receptor-potential

Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

内源性 果蝇 瞬时受体电位通道的纯化

该实验利用蓝光激活的藻类通道蛋白和细胞特异性基因表达工具，在果蝇（Drosophila）幼虫的神经肌肉接头（NMJ）处通过光脉冲诱导突触电位。该技术为科研和教学实验室中的突触生理学研究提供了一种成本低廉且易于使用的替代方法，可取代传统的吸吮电极刺激。...

光遗传刺激突触电位的通道视紫红质2介导方法 果蝇 神经肌肉接头

原位 膜片钳记录用于对完整神经环路中神经元的电生理特性进行表征。在完整的 果蝇...

制备 果蝇 中枢神经元 原位 膜片钳技术

本视频展示了一种用于研究白眼Drosophila中持续性去极化后电位（PDA）的实验方案。通过将果蝇的眼睛暴露于强烈的蓝光脉冲下，使感光色素视紫红质转化为高视紫红质，从而启动信号级联反应，打开阳离子通道并引起膜去极化。由于蓝光会阻止高视紫红质重新转化为视紫红质，阳离子持续内流导致去极化状态长期维持，这种现象称为持续性去极化后电位（PDA）。...

研究延长性去极化后电位（PDA）在 果蝇 光感受器

来源：Wagner, K. 等，利用eGFP标记蛋白研究果蝇感光细胞中的膜蛋白转运。J. Vis. Exp.

研究膜蛋白转运在 果蝇 光感受器细胞

Drosophila melanogaster 光感受器的全细胞记录可用于测量在不同条件下产生的自发性暗脉冲、量子脉冲、对光的宏观反应以及电流-电压关系。结合 D. melanogaster 的遗传操作工具，该方法可用于研究普遍存在的肌醇脂质信号通路及其靶标——TRP...

全细胞电压钳记录的电生理学方法 果蝇 光感受器

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中等规模制备 果蝇 用于蛋白质组学实验的胚胎提取物

本文介绍了一种利用河豚毒素和河豚毒素抗性钠通道NaChBac来检测神经元之间单突触连接的方法。...

检测单突触连接 果蝇 利用河豚毒素抗性钠通道

本文描述了获取去垢剂溶解的TRPV1生化量以进行光谱分析的具体方法。这些联合方案提供了生物化学和生物物理工具，可经适当调整后用于在膜环境可控条件下开展哺乳动物离子通道的结构与功能研究。...

用于光谱分析的TRPV1纯化与重组

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Drosophila Melanogaster 三龄幼虫中枢神经系统活动的电生理记录

本文介绍了利用eGFP荧光在黑腹果蝇（Drosophila）复眼中对光感受器膜蛋白进行定位以及评估视网膜变性的非侵入性方法。...

使用 eGFP 标记蛋白在 Drosophila 感光细胞中研究膜蛋白转运

我们提出了一种电生理学方法，用于表征双稳态光敏色素：（i）利用光敏色素分子在吸收光子后发生的电荷位移及其在感光细胞中的大量存在，以及（ii）利用视紫红质与高视紫红质这两种光敏色素状态之间的吸收光谱差异。这些方法可用于筛选影响双稳态光敏色素系统的突变。...

用于测量感光色素水平的电生理学方法 果蝇 光感受器

学习利用改良亲和纯化策略从果蝇头部提取内源性TRP通道的方法。该技术基于INAD蛋白复合物机制，使用高容量镍珠实现全长TRP通道的高效纯化，为研究其电生理特性和结构信息提供基础。

内源性Drosophila瞬时受体电位通道的纯化

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