Name: 使用相干拉曼散射成像对皮肤内的药物化合物进行可视化和定量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 7 s
Description: 了解相干拉曼散射成像技术，用于皮肤内药物化合物的可视化和定量分析。该方法可追踪药物渗透路径，为局部给药产品的靶向设计提供关键药代动力学数据。

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作者感谢 Evans 研究组的 Fotis Iliopoulos 博士和 Daniel Greenfield 对本文手稿的讨论与校对。此外，作者感谢 LEO Pharma 提供的支持。图 2 使用 BioRender.com 制作。

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<li>Begley, R., Harvey, A., Byer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L.Coherent+anti-Stokes+Raman+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Physics+Letters%22%5BJournal%5D)">L.Coherent anti-Stokes Raman spectroscopy.</a> Applied Physics Letters. 25 (7), 387-390 (1974).</li>
<li>Evans, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+imaging+of+tissue+in+vivo+with+video-rate+coherent+anti-Stokes+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Chemical imaging of tissue in vivo with video-rate coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (46), 16807-16812 (2005).</li>
<li>Hill, A. H., Manifold, B., Fu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+imaging+depth+limit+of+stimulated+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Tissue imaging depth limit of stimulated Raman scattering microscopy.</a> Biomedical Optics Express. 11 (2), 762-774 (2020).</li>
<li>Feizpour, A., Marstrand, T., Bastholm, L., Eirefelt, S., Evans, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+quantification+of+pharmacokinetics+in+skin+with+stimulated+Raman+scattering+microscopy+and+deep+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Label-free quantification of pharmacokinetics in skin with stimulated Raman scattering microscopy and deep learning.</a> Journal of Investigative Dermatology. 141 (2), 395-403 (2021).</li>
<li>Ghosh, B., Reddy, L. H., Kulkarni, R. V., Khanam, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+skin+permeability+of+drugs+in+mice+and+human+cadaver+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Comparison of skin permeability of drugs in mice and human cadaver skin.</a> Indian Journal of Experimental Biology. 38 (1), 42-45 (2000).</li>
<li>Nielsen, J. B., Plasencia, I., Sørensen, J. A., Bagatolli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Storage+conditions+of+skin+affect+tissue+structure+and+subsequent+in+vitro+percutaneous+penetration%5BTitle%5D)+AND+%22Skin+Pharmacology+and+Physiology%22%5BJournal%5D)">Storage conditions of skin affect tissue structure and subsequent in vitro percutaneous penetration.</a> Skin Pharmacology and Physiology. 24 (2), 93-102 (2011).</li>
<li>Barbero, A. M., Frasch, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+frozen+human+epidermis+storage+duration+and+cryoprotectant+on+barrier+function+using+two+model+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Skin+Pharmacology+and+Physiology%22%5BJournal%5D)">Effect of frozen human epidermis storage duration and cryoprotectant on barrier function using two model compounds.</a> Skin Pharmacology and Physiology. 29 (1), 31-40 (2016).</li>
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<li>Herkenne, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+methods+for+the+assessment+of+topical+drug+bioavailability%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Research%22%5BJournal%5D)">In vivo methods for the assessment of topical drug bioavailability.</a> Pharmaceutical Research. 25 (1), 87-103 (2008).</li>
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<li>Osseiran, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+monitoring+of+cancer+cell+subpopulations+in+monolayers%2C+3D+spheroids%2C+and+xenografts+using+the+photoconvertible+dye+DiR%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Longitudinal monitoring of cancer cell subpopulations in monolayers, 3D spheroids, and xenografts using the photoconvertible dye DiR.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1-10 (2019).</li>
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<li>Kim, H., Han, S., Cho, Y. S., Yoon, S. K., Bae, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+R+packages%3A%27Non-Compart%27+and+%27ncar%27+for+noncompartmental+analysis+%28NCA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+and+Clinical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Development of R packages:'Non-Compart' and 'ncar' for noncompartmental analysis (NCA).</a> Translational and Clinical Pharmacology. 26 (1), 10-15 (2018).</li>
</ol>

CLE 是已授权给多家显微镜制造商的 CARS 显微技术相关专利的发明人。其余所有作者均无利益冲突需要披露。

局部生物利用度/生物等效性（BA/BE）的评估是一个需要多维度方法的研究领域，因为单一技术无法全面表征 在体 cPK。本方案介绍了一种基于相干拉曼成像评估局部药物产品生物利用度（BA）/生物等效性（BE）的方法学。其中，一个容易被忽视的关键点是皮肤样本必须足够薄，尤其是对于定量透射式SRS成像而言。若皮肤过厚（即， 由于光线难以穿透，受激拉曼散射（SRS）探测器测得的信号极弱或几乎没有，因此将无法提供可靠的浓度数据。必须谨慎妥善地制备这些组织样本，因为样本制备的质量可能直接决定实验的成败。对于裸鼠耳部组织，除用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗并轻轻拍干以去除耳部残留污物外，基本无需其他预处理步骤。
小鼠耳朵的厚度通常为几百微米（µm），适合透射式SRS检测。人皮肤样本通常包含皮下脂肪，厚度可达几毫米（mm），但具体厚度因皮肤组织的解剖来源及供体年龄而有显著差异。因此，必须尽可能去除多余的组织，以准确量化随时间变化的表皮和真皮中脂质结构及活性药物成分（API）的浓度。若忽略组织制备步骤，则后续实验设置的大部分操作将因起始条件非最优而变得极不适用。...

在局部药物制剂应用后，评估局部药代动力学（cPK）的方法已从传统的体外透皮试验（IVPT）1,2,3,4,5和胶带剥离法6,7,8，扩展到其他方法，如开放流动微透析或皮肤微透析9,10,11,12,13,14。根据所关注疾病的差异，治疗作用的局部靶点可能各不相同。因此，可能需要相应数量的不同方法来评估活性药物成分（API）到达预期局部作用部位的速率和程度。尽管上述每种方法都有其优势，但主要缺点是缺乏微尺度cPK信息（即无法可视化API的分布路径及其渗透方式）。
一种用于估算局部生物利用度（BA）和生物等效性（BE）的非侵入性方法是相干拉曼成像（CRI），该方法可分为两种成像模式：受激拉曼散射（CARS）和同步拉曼散射（SRS）显微技术。这些相干拉曼方法通过非线性拉曼效应，实现对分子的化学特异性成像。在CRI中，两束激光脉冲序列被聚焦并扫描样品内部，激光频率之间的能量差被设定为针对目标化学结构特有的振动模式。由于CRI过程具有非线性特性，信号仅在显微镜焦点处产生，从而实现组织三维药代动力学断层成像。在体外药代动力学（cPK）研究中，CARS已被用于获取组织结构信息，例如富含脂质的皮肤结构的位置15。相比之下，SRS因其信号与分子浓度呈线性关系，已被用于定量分析分子浓度。对于离体（ex vivo）皮肤样本，通常建议在反射方向（epi-direction）进行CARS成像16，而在透射模式下进行SRS成像17。因此，较薄的组织样本更有利于SRS信号的检测与定量。
作为一种模型组织，裸鼠耳朵具有多种优势且缺点较少。其优势之一在于组织本身厚度已约为 200–300 µm，无需进一步的样品制备。此外，通过轴向聚焦单个视野即可观察到多种皮肤分层结构（例如，角质层、皮脂腺（SGs）、脂肪细胞和皮下脂肪）16,18。这使得在转向人皮肤样本之前，可对经皮渗透途径和局部生物利用度（BA）进行初步的临床前评估。然而，裸鼠模型也存在局限性，例如由于皮肤结构的差异，难以外推至体内实际情况19。尽管裸鼠耳朵是获取初步结果的优良模型，人皮肤模型仍是金标准。尽管目前已有多种关于冷冻人皮肤是否适合准确重现体内渗透动力学的讨论20,21,22，使用冷冻人皮肤已被广泛接受为评估体外&#160;活性药物成分（API）渗透动力学的方法23,24,25。本方案在可视化小鼠和人皮肤中多种皮肤层的同时，定量分析脂质富集和脂质贫乏结构中的 API 浓度。
尽管化学成像（CRI）已广泛应用于多个领域，以特异性可视化组织中的化合物，但针对外用药物产品的局部药代动力学（cPK）研究仍较为有限。若要利用CRI评估外用制剂的局部生物利用度（BA）和生物等效性（BE），首先必须建立标准化的操作流程，以实现准确比较。以往使用CRI研究药物经皮递送的研究中，数据存在一定的变异性。由于CRI在该领域的应用相对较新，建立统一的实验方案对于获得可靠结果至关重要18,26,27。该方法仅针对拉曼光谱中生物静默区（silent region）的某一特定波数进行检测。然而，大多数活性药物成分（API）和非活性辅料的拉曼位移均位于指纹区（fingerprint region）。此前，由于组织在指纹区本身会产生固有的拉曼信号，这给检测带来了挑战。近年来激光技术与计算方法的进步已克服了这一障碍，且这些技术可与本文所述方法结合使用28。本文提出的方法能够对外部药物中拉曼位移位于静默区（2,000–2,300 cm-1）的活性成分进行定量分析。该方法不受药物理化性质的限制，而某些先前报道的cPK监测方法可能存在此类限制29。
该方案必须降低不同制备样品间皮肤厚度的差异性，因为较厚的人类皮肤样品在施用药物产品后会因样品本身对光的散射而产生微弱信号。本文的目标之一是介绍一种组织制备方法，以确保成像标准的可重复性。此外，CRI 系统的设置如文中所述，旨在减少潜在的误差来源，并最大限度地提高信噪比。&#160;然而，本文将不讨论 CRI 显微镜的设计原理与技术优势，相关内容此前已有阐述30。最后，本文将探讨详尽的数据分析流程，以便解读实验结果，判断实验的成功与否。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;组织制备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>可高压灭菌的生物危害袋</td><td>FisherBrand</td><td>22-044562</td><td>文中提及：生物危害袋&lt;br/&gt; https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-polyethylene-biohazard-autoclave-bags-without-sterilization-indicator-8/22044562?searchHijack=true&amp;amp;searchTerm= 22044562&amp;amp;searchType=RAPID&amp;amp; matchedCatNo=22044562</td></tr><tr><td>细胞培养缓冲液：杜氏磷酸盐缓冲盐溶液 1x</td><td>Corning</td><td>MT21030CV</td><td>文中提及：PBS&lt;br/&gt; https://www.fishersci.com/shop/products/corning-cellgro-cell-culture-buffers-dulbecco-s-phosphate-buffered-salt-solution-1x-8/MT21030CV?searchHijack=true&amp;amp;searchTerm= 21-030-cv&amp;amp;searchType= RAPID&amp;amp;matchedCatNo=21-030-cv</td></tr><tr><td>一次性手术刀</td><td>Exel International</td><td>14-840-00</td><td>文中提及：手术刀&lt;br/&gt; https://www.fishersci.com/shop/products/exel-international-disposable-scalpels-3/1484000?keyword=true</td></tr><tr><td>高精度 45&amp;deg; 角宽头镊子/持针钳</td><td>Fisherbrand</td><td>12-000-132</td><td>文中提及：持针钳&lt;br/&gt; https://www.fishersci.com/shop/products/high-precision-45-angle-broad-point-tweezers-forceps/12000132#?keyword=</td></tr><tr><td>Kimwipes 精细任务擦拭纸，单层</td><td>Kimberly-Clark Professional Kimtech Science</td><td>06-666</td><td>文中提及：任务擦拭纸&lt;br/&gt; https://www.fishersci.com/shop/products/kimberly-clark-kimtech-science-kimwipes-delicate-task-wipers-7/06666</td></tr><tr><td>Parafilm M 实验室包裹膜</td><td>Bemis</td><td>13-374-12</td><td>文中提及：Parafilm&lt;br/&gt; https://www.fishersci.com/shop/products/curwood-parafilm-m-laboratory-wrapping-film-4/1337412</td></tr><tr><td>培养皿（35 mm × 10 mm）</td><td>Fisherbrand</td><td>FB0875711YZ</td><td>文中提及：小型培养皿&lt;br/&gt; https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-specialty-6/FB0875711YZ?keyword=true</td></tr><tr><td>培养皿（60 mm × 15 mm）</td><td>Fisherbrand</td><td>FB0875713A</td><td>文中提及：大型培养皿&lt;br/&gt; https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/FB0875713A?keyword=true</td></tr><tr><td>手术剪</td><td>Roboz</td><td>NC9411473</td><td>文中提及：剪刀&lt;br/&gt; https://www.fishersci.com/shop/products/scissors-327/NC9411473?searchHijack=true&amp;amp;searchTerm= RS-5915SC&amp;amp;searchType=RAPID&amp;amp; matchedCatNo=RS-5915SC</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;激光器/显微镜&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>650/60 nm BrightLine 单通带带通滤光片</td><td>Semrock</td><td></td><td>文中提及：CARS 滤光片 - CH2 振动（645 nm/60 nm 滤光片）</td></tr><tr><td>控制箱 IX2-UCB</td><td>Olympus</td><td></td><td>文中提及：控制箱</td></tr><tr><td>D700/30m</td><td>Chroma</td><td></td><td>文中提及：CARS 滤光片 - 氘化带&lt;br/&gt; https://www.chroma.com/products/parts/d700-30m</td></tr><tr><td>DeepSee Insight</td><td>Spectra-Physics</td><td></td><td>文中提及：激光器&lt;br/&gt; https://www.spectra-physics.com/f/insight-x3-tunable-laser</td></tr><tr><td>数字手持式光学功率和能量计主机</td><td>ThorLabs</td><td>PM100D</td><td>文中提及：功率计&lt;br/&gt; https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=3341</td></tr><tr><td>Fluoview 软件</td><td>Olympus</td><td></td><td>文中提及：显微镜控制软件</td></tr><tr><td>磨砂显微镜载玻片</td><td>FisherBrand</td><td></td><td>文中提及：显微镜载玻片&lt;br/&gt; https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-frosted-microscope-slides-4/22265446</td></tr><tr><td>FV1000</td><td>Olympus</td><td></td><td>文中提及：显微镜</td></tr><tr><td>孵育腔</td><td>Tokai Hit</td><td>GM-800</td><td>文中提及：孵育腔</td></tr><tr><td>积分球光电二极管功率传感器</td><td>ThorLabs</td><td>S142C</td><td>文中提及：光电二极管&lt;br/&gt; https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=3341</td></tr><tr><td>电源 FV31-PSU</td><td>Olympus</td><td></td><td>文中提及：电源</td></tr><tr><td>Precision 4063，80 MHz 双通道函数发生器</td><td>BK Precision</td><td></td><td>文中提及：函数发生器</td></tr><tr><td>ProScan &amp;ndash; 精密显微镜自动化系统</td><td>Prior Scientific Instruments</td><td></td><td>文中提及：载物台控制器&lt;br/&gt; https://www.prior.com/microscope-automation/inverted-microscope-systems/proscan-linear-stage-highest-precision-microscope-automation</td></tr><tr><td>SecureSeal 成像间隔垫</td><td>Grace Biolabs</td><td>654004</td><td>文中提及：间隔垫&lt;br/&gt; https://gracebio.com/product/secureseal-imaging-spacers-654004/</td></tr><tr><td>SRS 检测套件</td><td>APE</td><td></td><td>文中提及：SRS 检测器</td></tr><tr><td>UPLSAPO 20X NA:0.75</td><td>Olympus</td><td></td><td>文中提及：20X 物镜&lt;br/&gt; https://www.olympus-lifescience.com/en/objectives/uplsapo/</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;脂质/药物成像&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;35 mm 培养皿，未包被盖玻片，14 mm 玻璃直径</td><td>MatTek Corporation</td><td>NC9711297</td><td>文中提及：玻璃底培养皿&lt;br/&gt; https://www.fishersci.com/shop/products/glass-bottom-mircrowell-dish/nc9711297</td></tr><tr><td>棉签</td><td>FisherBrand</td><td></td><td>文中提及：棉签</td></tr><tr><td>Distriman 正向置换移液器</td><td>Gilson</td><td></td><td>文中提及：正向置换移液器&lt;br/&gt; https://www.fishersci.com/shop/products/gilson-distriman-positive-displacement-repetitive-pipette/F164001G#?keyword=</td></tr><tr><td>Distriman 正向置换移液器吸头</td><td>Gilson</td><td></td><td>文中提及：移液器吸头&lt;br/&gt; https://www.fishersci.com/shop/products/gilson-distritip-syringes-6/f164100g?keyword=true</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;数据分析&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FIJI</td><td>开源</td><td></td><td>文中提及：FIJI/ImageJ&lt;br/&gt; https://imagej.net/software/fiji/</td></tr><tr><td>Jupyter-Lab</td><td>开源</td><td></td><td>文中提及：JupyterLab&lt;br/&gt; https://jupyter.org/</td></tr><tr><td>Rstudio</td><td>开源</td><td></td><td>文中提及：Rstudio&lt;br/&gt; https://www.rstudio.com/</td></tr></tbody></table>

利用相干拉曼散射成像技术对皮肤内药物化合物进行可视化与定量分析

Visualizing and Quantifying Pharmaceutical Compounds within Skin using Coherent Raman Scattering Imaging

局部用药后皮肤药代动力学（cPK）一直是监管和药物研发科学家特别关注的研究领域，旨在从机制上理解局部生物利用度（BA）。半侵入性技术如胶带剥离法、皮肤微透析或皮肤开放流动微灌注，均可定量测定宏观尺度的cPK。尽管这些技术已提供了大量cPK知识，但学界仍缺乏对活性药物成分（API）在细胞水平上渗透与透过过程的机制性理解。
一种用于研究微尺度化学成分分布（cPK）的非侵入性方法是相干拉曼散射成像（CRI），该方法可选择性地靶向内源性分子振动，无需使用外源性标记物或化学修饰。CRI主要有两种技术——相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）和受激拉曼散射（SRS），可用于对活性药物成分（APIs）或非活性辅料进行高灵敏度和选择性的定量分析。CARS通常用于获取皮肤结构信息或可视化化学对比。相比之下，SRS信号与分子浓度呈线性关系，因此可用于定量分析皮肤各层中的活性药物成分或非活性辅料。
尽管小鼠组织已常用于通过CRI进行cPK研究，但在获得监管批准之前，局部BA和生物等效性（BE）最终必须在人体组织中进行评估。本文介绍了一种制备和成像人体组织样本的方法学 离体 用于定量药代动力学CRI研究，以评估局部用药的生物利用度（BA）和生物等效性（BE）。该方法可实现对人和小鼠皮肤中活性药物成分（API）随时间变化的可靠且可重复的定量。可分别量化脂质富集区和脂质贫乏区中的API浓度，以及随时间变化的总API浓度；这些数据可用于估算微观和宏观尺度的BA，并可能用于BE评估。

如果实验结束时组织在轴向（&lt;10 μm）或横向方向上未发生显著移动，则认为成像成功（图4）。这可以立即提示所测得的目标活性药物成分（API）的受激拉曼散射（SRS）信号是否能代表初始深度处的情况，因为定量分析是分层特异性的。为缓解此问题，可对每个感兴趣的XY位置采集z轴层扫图像，但代价是时间分辨率降低。若在研究中使用冷冻皮肤，其API的渗透和透过速度相比新鲜皮肤更快，因此制剂施加后应尽快开始成像。另一个需考虑的因素是实验所用物镜。若使用60倍物镜，在单个视野（FOV）内选择一个平坦区域相对容易；然而，若使用20倍物镜，其视野范围更大，因此组织制备中的关键步骤是确保皮肤与玻璃底成像皿之间接触均匀。获得平坦的视野以及视野内各点的深度与原始深度相近，是获得理想结果的两个关键因素。
激光的准直以及图像的动态范围必须得到极为细致的处理。若激光脉冲序列在显微镜中的准直不良，可能导致一系列问题，包括信号水平过低或视野（FOV）激发不均，从而产生对比度低的图像。另一个需要考虑的因素是在采集图像时应充分利用整个强度值的动态范围；否则，...

本文介绍了一种相干拉曼散射成像方法，用于可视化并定量皮肤中的药物化合物。文中描述了皮肤组织（人和小鼠）的制备及外用制剂的应用，图像采集以定量分析药物在空间和时间上的浓度分布，以及初步的药代动力学分析，以评估外用药物的递送效果。

外用制剂给药后的皮肤药代动力学（cPK）一直是监管和药物研发领域特别关注的研究方向……

该方法学的意义在于，它能够利用相干拉曼成像技术对局部应用的药物产品进行可重复且准确的定量分析。其他方法仅能提供整体的皮肤药代动力学信息，而该方法不仅能提供整体水平的皮肤药代动力学数据，还可获得微尺度层面的信息，例如药物的渗透途径。对渗透路径的可视化与定量分析将有助于开发针对特定途径设计、以更有效地到达靶部位的药物产品。组织制备将是本方法学中最具挑战性的部分。组织应足够薄，以便能够透过皮肤读取文字。开始制备裸鼠耳部皮肤组织时，获取已实施安乐死的裸鼠，并使用镊子和显微外科剪刀切除鼠耳。然后将一只耳朵放入一个60毫米×15毫米的大培养皿中。接着用PBS冲洗小鼠耳朵两次，每次用擦拭纸将耳朵吸干。如果在24小时内使用，将耳朵置于盛有PBS的小培养皿（35毫米×10毫米）中，并在2至8摄氏度保存。收获后若需在24小时后使用，将耳组织置于不含PBS的培养皿中，用封口膜覆盖培养皿后于-20摄氏度冰箱中保存。在生物安全柜内操作时，将人皮肤组织放入较大的培养皿中，使角质层朝下，以便暴露皮下脂肪组织。随后使用镊子和显微外科剪去除皮下脂肪。当无法再用剪刀去除皮下脂肪时，使用10号一次性解剖刀，以45度角紧贴皮肤表面，在用镊子固定皮肤的同时切除剩余的皮下脂肪。脂肪去除后，将人皮肤切成每块1厘米×1厘米的组织片。进行脂质成像时，将小鼠耳部的前侧朝下，贴向35毫米、0号玻璃底培养皿的底部放置。对于人皮肤样本，应将皮肤的角质层朝下放置，以便从表层到深层进行药物定量分析。将组织置于玻璃底培养皿中央后，使用棉签轻轻按压，确保皮肤平整并与玻璃底表面完全接触。为防止成像过程中发生移动，将一个垫圈置于皮肤上方，并确保组织可通过垫圈中央的孔洞进行受激拉曼散射（SRS）透射检测。用移液器将预定剂量的制剂滴加到皮肤上，然后用戴手套的手指顺时针揉搓30秒。待制剂渗透时间结束后，去除多余的制剂，再将制剂面朝向玻璃底培养皿放置皮肤。接着，启动显微镜控制（Microscope Control或MC）软件，进行实验设置。通过目镜观察，使用调节旋钮调整轴向焦距，确保组织处于焦点范围内。完成后，解除泵浦光束和斯托克斯光束的阻断，并确认已启用ALG1和ALG2通道。确保SRS光电二极管位于聚光镜上方的正确位置，然后在MC软件中点击“Focus x2”，以在CARS和SRS通道中观察皮肤图像。在多区域时间延时（Multi-Area Time Lapse，MATL）模块中，进入“视图”选项卡，点击“已注册点列表”，以显示成像列表。确定角质层后，通过滚动轴向焦平面（Z轴焦平面）来识别特定的组织分层。可根据脂质调谐对比度实时成像过程中所确定的结果，在皮肤内添加特定深度，如角质层、皮脂腺、脂肪细胞或皮下脂肪。然而，如果需要获取完整的深度序列图像，则可以添加XY位置，而忽略相对Z位置。在针对每层皮肤结构成像特定深度的情况下，选择“注册点”以将其添加到MATL队列中。对于全深度序列图像，在“采集参数”窗口中点击“为每个带深度选择的XY位置注册点”。接下来，在 MATL 模块中将重复次数设置为 1，然后点击就绪。当播放箭头从灰色变为黑色时，点击播放以开始对初步脂质层进行成像。成像循环完成后，阻断泵浦光束和斯托克斯光束，并根据目标波数或拉曼振动，在激光器图形用户界面中将波长调整至所需波长。调整手动时间延迟阶段，同时确保用于成像脂质和活性药物成分（API）的功率与预先确定的功率相同。选定总循环重复次数后，解除泵浦光束的遮挡，并在按下“Play”开始自动成像设定点之前，使用光电二极管检查功率是否达到目标功率。接下来，通过将皮脂腺脂质图像导入 Fiji 并勾选标记为“Split channels”的复选框，将文件拆分为 CARS 和 SRS 通道，从而对每种皮肤分层进行数据分析。要打开感兴趣区域（Region of Interest，ROI）管理器，请点击分析（Analyze）、工具（Tools），然后选择 ROI 管理器（ROI Manager）。使用 SRS 通道并将 C 设置为 1，取消图像中皮脂腺的选区标记，然后在 ROI 管理器中点击“添加 T”（Add T）将标记添加至 ROI 管理器。对图像中的每个皮脂腺重复此操作。为了屏蔽富含脂质的区域，依次选择每个 ROI，然后点击 More（更多）、OR Combine（或组合）和 Add（添加）选项卡。为了屏蔽贫脂质区域，使用 Fiji 菜单中的矩形工具，在整幅图像周围绘制一个方形区域，并将该区域添加到 ROI Manager（ROI 管理器）中。在 ROI 管理器中，单击新添加的方形 ROI，以及用于选择所有富含脂质区域的 ROI。在“更多”选项下，选择“异或”（XOR）以生成贫脂区域的掩膜，并将其添加到 ROI 管理器中。依次转到图像、堆栈、工具，然后按数值顺序连接图像。或者，通过在Fiji中加载一幅图像，然后在设置页面选择名为“将文件名相似的文件分组”的选项来导入图像。在拼接图像处于激活状态时，进入ROI管理器以选择富含脂质的区域，点击“更多”选项卡，然后选择“多测量”，等待结果窗口出现。从结果窗口中将数据导出至电子表格，并添加一列标题为“区域”的列，用于为每一行数据标注对应的富含脂质的区域。将脂质贫乏区域添加至脂质之外的区域。为可视化数据，将电子表格保存并导入 R 软件包 ggplot2 中，然后以图像编号为横坐标、平均强度为纵坐标绘制数据，以估算浓度-时间关系数据。在 RStudio 中对从电子表格导入的强度-时间数据调用单层模型进行非房室分析（NCA）。完成后，绘制 Jmax 和 AUCflux-all 指标的图表并进行可视化比较。此外，对不同实验条件之间进行统计学比较。代表性分析显示了来自裸鼠耳部皮肤的角质层、皮脂腺、脂肪细胞和皮下脂肪，以及来自人皮肤的角质层、乳头层真皮和一个皮脂腺。在裸鼠耳部皮肤中，观察到皮脂腺的组织移动有限，在给药时和给药后120分钟时，腺体处于相同的组织深度。而在皮肤中出现显著组织移动的情况下，给药120分钟后皮脂腺几乎不可见，表明原始方案效率低下。在多项研究中，强度随时间变化的曲线显示初始浓度较高，随后浓度逐渐降低，表明药物未再进一步被组织吸收。另一方面，部分研究显示强度先升高，之后在实验过程中逐渐下降，表明在成像前药物向组织内的渗透通量尚未达到最大值。对同一活性药物成分（API）两种剂型的浓度-时间曲线进行非房室分析（NCA）表明，无论皮肤层次如何，相较于凝胶剂型，乙氧基-乙氧基乙醇剂型可实现更持久的API渗透。相同配方之间的总暴露量分析在皮肤深层显示出相似的结果。在药物应用后，人皮肤的制备以及将其正确放置于玻璃底培养皿上，对实验成功至关重要。此处的澄清溶液证明了该方法的适用性。后续研究将涉及市售剂型（如乳膏），以了解制剂对活性药物成分（API）渗透和透过的影响。

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医学

使用相干拉曼散射成像对皮肤内的药物化合物进行可视化和定量

采用三种单波长短脉冲激光的组合来产生相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）和双共振CARS（DR-CARS）。这两种信号的差异可显著增强原本难以检测的相干拉曼信号的灵敏度，从而实现对弱拉曼散射体的成像。...

双共振相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）对生物结构的差异成像

相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）显微镜与内置流通式溶出装置相结合，以实现 原位...

相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）显微镜在药物片剂溶出过程中实现可视化观察

基于分子键固有振动的相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）显微技术，能够实现无需标记的化学选择性活细胞成像。本文介绍了在基于飞秒钛宝石激光器和OPO激光器的标准多光子激光扫描显微镜上，实现一种互补显微技术的方法。...

在基于钛宝石和光参量振荡器激光器的标准激光扫描显微镜上实现相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）系统

本文描述了一种通过将受激拉曼散射（SRS）实验装置与激光扫描显微镜集成而实现的受激拉曼散射显微镜。该SRS显微镜基于两束飞秒（fs）激光光源，分别为钛宝石（Ti:Sa）激光器和同步的光学参量振荡器（OPO）。...

基于受激拉曼散射的非线性显微镜的实现

本文介绍了一种在临床研究中从人体受试者采集共聚焦拉曼光谱的实验方案，并结合化学计量学方法去除光谱异常值，进而提取关键特征。...

通过化学计量学方法解析皮肤角质层活体共聚焦拉曼光谱中的水、蛋白质和脂质

受激拉曼散射（SRS）显微技术能够实现对特定化学基团的选择性、无标记成像，已被有效用于体内脂质分子的成像。本文简要介绍SRS显微技术的原理，并描述其在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis...

无需标记的脂质储存动态成像：利用受激拉曼散射显微镜对秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）的研究

本文直接比较了集成在同一显微镜平台上的受激拉曼散射（SRS）和相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）在分辨率、灵敏度和成像对比度方面的性能。结果表明，CARS 具有更高的空间分辨率，SRS...

高光谱受激拉曼散射与相干反斯托克斯拉曼散射显微成像在化学成像中的直接比较

我们提出了一种利用宽带受激拉曼散射（SRS）显微技术获取化学图像的实验方案。该方案基于采用多通道差分锁相检测的SRS显微镜，详细描述了样品制备、SRS仪器调节以及化学计量学方法，用于解析化学非均质样品中不同组分的成分信息。...

基于宽带受激拉曼散射显微技术的多重化学成像

本研究提出了一种利用非线性光学光谱与质谱成像技术对软组织中药物进行关联成像的方法。将高分辨率皮肤成像与高灵敏度药物检测相结合，为研究药物在皮肤中的分布提供了有力手段，这对于开发更优的局部外用产品至关重要。...

相关光学光谱与质谱成像方法用于可视化软组织切片中的药物分布

利用结合无标记光学成像模式的多模态平台，我们开发了一种用于可视化和定量分析细胞动态与代谢的方案。通过多光子荧光、二次谐波生成和受激拉曼散射显微成像，我们能够获得细胞和分子环境的整体概览。...

用于研究细胞代谢的多模态光学成像平台

了解相干拉曼散射成像技术，用于皮肤内药物化合物的可视化和定量分析。该方法可追踪药物渗透路径，为局部给药产品的靶向设计提供关键药代动力学数据。

利用相干拉曼散射成像技术对皮肤内药物化合物进行可视化与定量分析

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