Name: 使用 体内 抑制、免疫荧光和流式细胞术对精子细胞中驱动蛋白-7 CENP-E 进行功能评估 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: 学习使用体内抑制、免疫荧光和流式细胞术评估小鼠精母细胞中CENP-E驱动蛋白功能的方法。该技术可揭示染色体排列与基因组稳定性机制，为研究生殖生物学提供可靠模型。

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感谢福建医科大学细胞骨架实验室所有成员的有益讨论。感谢福建医科大学公共技术服务中⼼流式细胞术平台林俊进的技术支持。感谢福建医科大学公共技术服务中⼼电子显微镜实验室吴明霞和周林英在电子显微镜技术方面的协助。感谢福建医科大学基础医学实验教学中心郑思怡、林颖、柯琪和宋俊的技术支持。本研究得到以下基金资助：国家自然科学基金（项目编号 82001608）、福建省自然科学基金（项目编号 2019J05071）、福建省卫生科技项目（项目编号 2018-1-69）、福建医科大学科研启动基金（项目编号 2017XQ1001）、福建医科大学高层次人才科研启动资助项目（项目编号 XRCZX2017025）以及中医研究生在线教育教学研究项目（项目编号 B-YXC20200202-06）。

所有动物实验均经福建医科大学动物护理与使用委员会审查并批准（协议编号 SYXK 2016-0007）。所有小鼠实验均严格遵循美国国立卫生研究院（NIH）《实验动物护理与使用指南》的相关规定（NIH 出版物编号 8023，1978 年修订版）。
1. GSK923295介导的CENP-E抑制小鼠模型的构建
<ol>
	<li>将手术器械在&#160;121 °C 下灭菌 30 分钟。使用紫外线-C（UVC）照射手术用超净工作台&#160;2 小时。称量用于实验的3周龄雄性ICR（Institute of Cancer Research）小鼠，并计算所需麻醉剂剂量。</li>
	<li>通过腹腔注射给予氯胺酮（100 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）的组合对小鼠进行麻醉。通过角膜反射、伤害性刺激反射、呼吸频率及肌张力等多项指标综合评估小鼠的麻醉深度。确认小鼠已处于深度麻醉状态。 
	注意：手术期间将动物置于加热垫上以提供体温支持&#160;。</li>
	<li>将小鼠四肢固定并绑在蜡盘上。在小鼠眼睛上涂抹兽用眼膏，防止麻醉期间角膜干燥。使用实验动物专用剃毛器，剃除从小鼠下腹部至阴囊区域的体毛&#160;。用无菌手术巾覆盖并固定手术区域。</li>
	<li>用聚维酮碘溶液擦拭腹部腹侧区域，随后用75%乙醇重复处理三次&#160;。使用无菌手术刀切开腹腔，切口长度小于&#60;5 mm。</li>
	<li>用无菌手术钳夹住皮肤，用无菌解剖镊轻轻牵拉附睾脂肪垫，借助无菌镊子定位睾丸。在体视显微镜下用无菌镊子固定睾丸，缓慢向曲细精管内注射10 µL GSK923295，终浓度为10 µM，使用10 µL rheodyne30完成注射。对照组小鼠注射10 µL含1% DMSO（二甲基亚砜）的PBS（磷酸盐缓冲液）溶液。 
	注意：将GSK923295溶液以10 mM浓度储存于-80 °C。取0.1 µL的10 mM GSK923295溶液溶于100 µL PBS溶液中，配制10 µM的GSK923295工作液。</li>
	<li>用无菌手术镊轻轻将睾丸推回腹腔内。使用直径为0.1 mm的缝合线分别对腹膜和皮肤进行缝合，每处缝合2至4针。</li>
	<li>腹部手术后，用永久性标记笔在动物背部标记一个3 × 3 mm的区域，将小鼠放回饲养笼中，并确保环境清洁无病原体，且提供充足的食物和饮水。</li>
	<li>通过过滤空气、灭菌的食物和水维持环境的无菌状态。密切观察动物状态，直至其恢复足够的意识以维持胸卧位。术后镇痛处理：每12小时皮下注射一次布托啡诺（0.1 mg/kg），连续给药3天。确保小鼠完全恢复前不得与其他动物合笼饲养。 
	注意：术后对小鼠进行适当护理，必要时可局部使用0.5%利多卡因进行伤口局部麻醉，以减轻术后疼痛。</li>
</ol>
2. 苏木精-伊红（HE）染色与组织病理学
<ol>
	<li>腹部手术四天后，处死小鼠&#160;CO2 以2 L/min的流速在CO中2 腔室。通过颈椎脱位法确认安乐死，作为安乐死的确认方法。使用手术剪切开阴囊，用镊子取出睾丸。在GSK923295注射后第4天收集小鼠睾丸，并将其置于30 mL 10%甲醛溶液中，室温固定12 h。</li>
	<li>进行梯度脱水时，依次将样品在40 mL 70%乙醇中孵育1 h，再在40 mL 85%乙醇中孵育1 h，随后在40 mL 95%乙醇中孵育1 h，最后在40 mL 100%乙醇中孵育1 h。</li>
	<li>将样本在40 mL二甲苯中孵育40分钟，随后在40 mL石蜡中于65 °C孵育1小时。将组织置于包埋盒底部，加入熔化的石蜡。于4 °C冷却6小时，使组织完全凝固。</li>
	<li>将样品固定在超薄切片机的样品 holder 上，保持样品与刀片表面之间的角度为 5–10°，调节切片厚度至 5 µm。使用超薄切片机制备 5 µm 厚的切片，将切片在 40 °C 的水浴中展平，然后在 37 °C 下于载玻片烘干机中干燥 12 h。</li>
	<li>将切片分别在200 mL二甲苯中孵育40分钟，在200 mL 100%乙醇中孵育6分钟，在200 mL 95%乙醇中孵育2分钟，在200 mL 90%乙醇中孵育2分钟，在200 mL 80%乙醇中孵育2分钟，以及在200 mL 70%乙醇中孵育2分钟。</li>
	<li>将载玻片在蒸馏水中冲洗5分钟，然后在室温下用 Mayer 苏木精溶液染色6分钟。 
	注意：Mayer 苏木精溶液：0.011 mol/L 苏木精，6.7% 无水乙醇，0.646 mol/L 硫酸铝钾，0.003 mol/L 碘酸钠。</li>
	<li>将载玻片在流动水中冲洗5分钟，然后在蒸馏水中孵育2分钟。</li>
	<li>将载玻片在1%乙醇盐酸溶液中孵育3秒，然后用流水冲洗2分钟。</li>
	<li>用1%伊红染色15秒，然后依次用95%乙醇处理5秒、100%乙醇处理2分钟，最后在二甲苯中孵育40分钟。</li>
	<li>使用15 µL中性树胶和24 × 50 mm盖玻片封片。</li>
</ol>
3. 免疫荧光与共聚焦显微镜
<ol>
	<li>收集小鼠睾丸的5 µm厚石蜡切片用于免疫荧光染色。将切片依次置于二甲苯中孵育40分钟，100%乙醇中6分钟，95%乙醇中2分钟，90%乙醇中2分钟，80%乙醇中2分钟，70%乙醇中2分钟。用蒸馏水冲洗切片5分钟，并用0.01 M PBS冲洗5分钟。</li>
	<li>将切片放入抗原修复液（0.01 M柠檬酸盐缓冲液）中，使用高压锅在高压力下煮沸4分钟以进行抗原修复。自然冷却至室温。用蒸馏水冲洗两次，每次5分钟，再用PBS冲洗5分钟。 
	&#8203;注意：0.01 M柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0）：含2.1 mmol/L柠檬酸，11.6 mmol/L二水合柠檬酸三钠。</li>
	<li>将切片在500 µL的0.25% TritonX-100/PBS溶液中孵育10分钟以通透细胞。用PBS冲洗切片，每次5分钟，共冲洗三次。</li>
	<li>进行抗原封闭时，将样本与300 µL的3%牛血清白蛋白（BSA）/PBST（含0.1% Tween-20的PBS）在室温下孵育1小时。随后在4 °C下，用3% BSA/PBST稀释的一抗溶液孵育样本16小时。将切片置于湿盒中，防止组织干燥。孵育结束后，将切片自然复温至室温，约30分钟。</li>
	<li>弃去一抗溶液，用PBST冲洗切片，每次5分钟，共冲洗三次。将二抗用3% BSA/PBST稀释后，加入样本中，在37 °C孵育1–2小时。再用PBST冲洗样本，每次5分钟，共冲洗五次。</li>
	<li>在室温下用50 µL的4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色细胞核5分钟。用抗荧光淬灭封片剂封片，并用指甲油密封盖玻片边缘。</li>
	<li>使用配备NA 40x/0.75物镜的荧光显微镜观察并记录切片中的荧光信号。</li>
</ol>
4. 流式细胞术
<ol>
	<li>在6 cm培养皿中收集小鼠睾丸，使用手术剪将睾丸剪成1 mm3大小的组织块。</li>
	<li>在1.5 mL离心管中加入1 mL 1%胶原酶溶液，于37 °C消化10分钟，随后在1,000 × g条件下离心5分钟，沉淀生精细胞。</li>
	<li>弃去上清液，加入1 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA（乙二胺四乙酸）溶液，于37 °C孵育20分钟，然后在1,000 × g条件下离心5分钟。</li>
	<li>弃去上清液，将沉淀的细胞与1 mL预冷的70%乙醇在4 °C孵育超过8小时。</li>
	<li>在1,000 × g条件下离心5分钟，收集细胞沉淀。加入500 µL碘化丙啶（PI）染色液（含50 µg/mL PI、100 µg/mL RNase A和0.2% Triton X-100的PBS溶液），于37 °C避光染色30分钟。 
	注意：每隔5分钟轻轻振荡离心管，以防止细胞聚集。</li>
	<li>使用300目筛网过滤样品，去除细胞碎片；将细胞收集至流式管中，并于4 °C保存。</li>
	<li>使用流式细胞仪在488 nm激发波长下检测荧光信号和光散射信号，利用Modfit MFLT32软件分析DNA含量和光散射特性。</li>
</ol>
5. 透射电子显微镜
<ol>
	<li>使用锋利的解剖刀将睾丸组织切成 1 mm3 大小的组织块，并迅速将样品置于含 3% 戊二醛和 1.5% 多聚甲醛的 0.1 M PBS 缓冲液（pH 7.2）中，于 4 °C 固定 4 小时，以防止超微结构发生改变。随后用 0.1 M PBS 缓冲液漂洗样品，每次 5 分钟，共漂洗三次。 
	注意：解剖刀和剪刀必须保持锋利，操作时应尽量避免人为挤压或牵拉。样品处理应在固定液中进行。</li>
	<li>将样品置于 1% 锇酸-1.5% 亚铁氰化钾溶液中，于 4 °C 固定 1.5 小时。用滤纸吸去多余液体后，用 0.1 M PBS 缓冲液漂洗样品，每次 5 分钟，共漂洗三次。</li>
	<li>于 4 °C 条件下，用 40 mL 的 50% 乙醇对样品脱水 10 分钟。随后将样品置于 40 mL 的 70% 乙醇饱和醋酸铀染液中，于 4 °C 染色 12 小时；再依次用 40 mL 的 90% 乙醇（4 °C，10 分钟）、40 mL 的 90% 乙醇-丙酮（室温，10 分钟）以及 40 mL 无水丙酮（室温，每次 10 分钟，共三次）进行脱水处理。</li>
	<li>将样品置于无水丙酮与环氧树脂 618 包埋剂按体积比 1:1 混合的溶液中，于 35 °C 浸透 1.5 小时，然后将样品转移至纯环氧树脂 618 包埋剂中，于 35 °C 浸透 3 小时。</li>
	<li>为实现树脂聚合，将样品在环氧树脂 618 包埋剂中依次于 35 °C 孵育 12 小时、45 °C 孵育 12 小时，最后于 60 °C 孵育 24 小时。</li>
	<li>安装样品与玻璃刀，并调节样品与刀刃之间的距离。使用超薄切片机制备厚度为 90 nm 的超薄切片，以恒定速度切片后，将切片转移至镍网载网上，并将载网置于培养皿中，于室温下存放。</li>
	<li>先用 2% 醋酸铀对载网切片染色 10 分钟，再用 2% 柠檬酸铅染色 10 分钟。染色后用蒸馏水漂洗切片，并于室温下干燥 24 小时。</li>
	<li>使用透射电子显微镜在 70–100 kV 条件下观察切片并记录电子显微图像。</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本研究通过腹腔手术和显微注射 GSK923295，建立了小鼠睾丸中 CENP-E 抑制的体内模型。本研究所采用的腹腔手术与睾丸注射方法具有以下优势：第一，不受小鼠年龄限制，实验人员可在早期阶段（例如3周龄或更小）进行睾丸注射；第二，GSK923295 对 CENP-E 具有特异且优异的抑制效果；第三，该方法操作简便，重复性高；此外，睾丸组织的完整性得以保持，适用于在器官背景下对完整组织进行研究。
本方案中有多个关键步骤。例如，在腹部手术过程中维持无菌环境对于预防术后感染至关重要31。此外，对于不同年龄的小鼠或不同的实验动物，应根据睾丸大小及药物有效性适当调整注射剂量19,32。同时，在流式细胞术中，需掌握适当的消化时间并进行显微镜观察，以确定单细胞状态及后续的细胞群体检测。然而，本方案也存在一些局限性。当小鼠年龄小于2周时，难以通过腹部手术建立小鼠模型，主要原因在于小鼠年龄过小、术后饮食困难且存活率较...

减数分裂是真核生物中最重要的、高度保守的进化事件之一，对配子发生、有性生殖、基因组完整性以及遗传多样性至关重要1,2,3。在哺乳动物中，生殖细胞在经历一次DNA复制后，连续进行两次细胞分裂，即减数分裂I和减数分裂II。与有丝分裂中的姐妹染色单体不同，同源染色体在减数分裂I中配对并分离到两个子细胞中4,5。在减数分裂II中，姐妹染色单体分离，且不经过DNA复制，最终形成单倍体配子6。减数分裂的任一分裂阶段若出现错误，包括纺锤体组装缺陷或染色体错误分离，均可能导致配子丢失、不育或非整倍体综合征7,8,9。
越来越多的研究表明，驱动蛋白家族马达在有丝分裂和减数分裂细胞中对染色体排列与分离、纺锤体组装、胞质分裂以及细胞周期进程的调控中发挥着关键作用10,11,12。驱动蛋白-7 CENP-E（着丝粒蛋白E）是一种朝向正端的动粒马达蛋白，在有丝分裂过程中对染色体定向排列、染色体运输与对齐以及纺锤体组装检查点的调控至关重要13,14,15,16,17,18。在减数分裂过程中，使用特异性抑制剂GSK923295抑制CENP-E会导致精母细胞发生细胞周期阻滞、染色体排列紊乱、纺锤体结构异常以及基因组不稳定19。分裂期精母细胞着丝粒上CENP-E的定位模式和动态变化表明，CENP-E在减数第一次分裂期间与动粒蛋白相互作用，参与着丝粒的有序组装20,21。在卵母细胞中，CENP-E对于染色体对齐和完成减数第一次分裂是必需的13,22,23。对小鼠和Drosophila卵母细胞注射CENP-E抗体或吗啉代寡核苷酸会导致染色体错位、动粒方向异常以及减数第一次分裂阻滞23。相较于CENP-E在有丝分裂中的重要作用，其在减数分裂中的功能与作用机制仍知之甚少。CENP-E在雄性减数分裂细胞中参与染色体定向排列和维持基因组稳定性的详细机制仍有待阐明。
精子发生是一个复杂且持久的生理过程，涉及精原细胞的有序增殖、减数分裂以及精子形成。因此，整个过程极难被重现 体外 在哺乳动物和其他物种中24,25无法诱导粗线期之后的精母细胞分化 体外对雄性减数分裂的研究通常局限于对减数分裂前期早期的实验分析25,26尽管进行了许多技术尝试，包括精母细胞的短期培养27,28 以及器官培养方法25，目前研究雄性减数分裂的有效方法较少。此外，关键基因的遗传缺失通常会导致发育停滞和胚胎致死。例如，缺乏特定基因的小鼠胚胎 CENP-E 无法着床且不能发育至着床后阶段29这在CENP-E的减数分裂机制研究中构成了障碍。综上所述，建立一个实用且可行的系统来研究雄性减数分裂，将极大推动减数分裂研究领域的发展。
小分子通透性抑制剂是研究驱动蛋白在细胞分裂和发育过程中作用的有力工具。变构抑制剂GSK923295可特异性结合CENP-E的马达结构域，阻断ADP（二磷酸腺苷）的释放，最终稳定CENP-E与微管之间的相互作用30在本研究中，一个 体内 通过腹腔手术和向睾丸注射GSK923295建立抑制小鼠模型。CENP-E抑制导致初级精母细胞减数分裂I中期染色体排列紊乱。此外，CENP-E抑制引起精母细胞减数分裂阻滞，并破坏精子发生过程。本文描述了一系列精母细胞分析方案，可用于观察精母细胞中的减数分裂纺锤体微管、同源染色体以及亚细胞器。我们的 体内 抑制法是研究减数分裂和精子发生的一种有效方法。

<table><tbody><tr><td>0.25% 胰蛋白酶-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>1 ml 注射器</td><td>多个商业品牌可选</td><td></td><td>无菌。</td></tr><tr><td>1.5 mL 离心管</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 离心管</td><td>Corning</td><td>430828</td><td></td></tr><tr><td>6 cm 培养皿</td><td>Corning</td><td>430166</td><td></td></tr><tr><td>95% 乙醇</td><td>国药集团化学试剂有限公司</td><td>10009164</td><td></td></tr><tr><td>微管蛋白兔多克隆抗体</td><td>Beyotime</td><td>AF0001</td><td>用于免疫荧光检测。使用稀释比例为 1:100。</td></tr><tr><td>兔抗组蛋白 H3（磷酸化 S10）单克隆抗体</td><td>Abcam</td><td>ab267372</td><td>用于免疫荧光检测。使用稀释比例为 1:100。</td></tr><tr><td>兔抗 TUBA4A 多克隆抗体</td><td>生工生物</td><td>D110022</td><td>用于免疫荧光检测。使用稀释比例为 1:100。</td></tr><tr><td>抗 SYCP3 兔单克隆抗体</td><td>Abcam</td><td>ab175191</td><td>用于免疫荧光检测。使用稀释比例为 1:100。</td></tr><tr><td>粘附性显微镜载玻片</td><td>CITOTEST</td><td>188105</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 标记的山羊抗兔抗体</td><td>Beyotime</td><td>A0423</td><td>二抗。使用稀释比例为 1:500。</td></tr><tr><td>硫酸铝钾</td><td>国药集团化学试剂有限公司</td><td>10001060</td><td></td></tr><tr><td>无水乙醇</td><td>国药集团化学试剂有限公司</td><td>100092690</td><td></td></tr><tr><td>抗荧光淬灭封片剂</td><td>Beyotime</td><td>P0131</td><td>防止荧光信号光漂白。</td></tr><tr><td>BD FACS Canto II</td><td>BD Biosciences</td><td>FACS Canto II</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>国药集团化学试剂有限公司</td><td>69003435</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5424BK745380</td><td></td></tr><tr><td>水合氯醛</td><td>国药集团化学试剂有限公司</td><td>80037516</td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸</td><td>上海试剂有限公司</td><td>122670</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶</td><td>生工生物</td><td>A004194-0100</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>CITOTEST</td><td>10212020C</td><td>20 &amp;times; 20 mm。厚度 0.13–0.16 mm。</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Beyotime</td><td>C1006</td><td></td></tr><tr><td>染色缸</td><td>多个商业品牌可选</td><td>91347802</td><td></td></tr><tr><td>伊红 Y，醇溶性</td><td>国药集团化学试剂有限公司</td><td>71014460</td><td></td></tr><tr><td>乙醚</td><td>国药集团化学试剂有限公司</td><td>10009318</td><td></td></tr><tr><td>甲醛水溶液</td><td>国药集团化学试剂有限公司</td><td>10010018</td><td></td></tr><tr><td>GSK923295</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-10299</td><td></td></tr><tr><td>苏木精，无水</td><td>国药集团化学试剂有限公司</td><td>71020784</td><td></td></tr><tr><td>ICR 小鼠</td><td>上海斯莱克实验动物有限公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image J 软件</td><td>美国国立卫生研究院</td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td><td>荧光图像分析。</td></tr><tr><td>Leica 超薄切片机</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica EM UC-7 超薄切片机</td><td>Leica</td><td>EM UC7</td><td></td></tr><tr><td>Modfit MFLT32</td><td>Verity Software House</td><td></td><td>用于流式细胞术结果分析。</td></tr><tr><td>指甲油</td><td>多个商业品牌可选</td><td></td><td></td></tr><tr><td>中性树胶</td><td>国药集团化学试剂有限公司</td><td>10004160</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Ti-S2 显微镜</td><td>Nikon</td><td>Ti-S2</td><td></td></tr><tr><td>苦味酸</td><td>国药集团化学试剂有限公司</td><td>J60807</td><td></td></tr><tr><td>Rheodyne</td><td>生工生物</td><td>F519160-0001</td><td>10 &amp;mu;l Rheodyne</td></tr><tr><td>切片石蜡</td><td>国药集团化学试剂有限公司</td><td>69019461</td><td></td></tr><tr><td>碘酸钠</td><td>国药集团化学试剂有限公司</td><td>80117214</td><td></td></tr><tr><td>手术器械</td><td>多个商业品牌可选</td><td></td><td>用于腹部手术。在 121 &amp;deg;C 下灭菌 20 分钟。</td></tr><tr><td>透射电子显微镜</td><td>FEI</td><td>Tecnai G2</td><td></td></tr><tr><td>二水合柠檬酸三钠</td><td>上海试剂有限公司</td><td>173970</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>国药集团化学试剂有限公司</td><td>30188928</td><td>用无菌 PBS 稀释，配制成 0.25% 工作液。</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>国药集团化学试剂有限公司</td><td>30189328</td><td>用无菌 PBS 稀释，配制成 0.1% 工作液。</td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>国药集团化学试剂有限公司</td><td>80096618</td><td></td></tr><tr><td>二甲苯</td><td>国药集团化学试剂有限公司</td><td>10023418</td><td></td></tr></tbody></table>

利用精子细胞对驱动蛋白-7 cenp-e 的功能评估 体内 抑制、免疫荧光与流式细胞术

Functional Assessment of Kinesin-7 CENP-E in Spermatocytes Using In Vivo Inhibition, Immunofluorescence and Flow Cytometry

在真核生物中，减数分裂对有性生殖过程中的基因组稳定性和遗传多样性至关重要。对睾丸中精母细胞的实验分析，是研究雄性减数分裂过程中纺锤体组装和染色体分离的关键。小鼠精母细胞是减数分裂机制研究的理想模型，然而目前仍缺乏高效分析精母细胞的有效方法。本文介绍了一种实用且高效的 体内 报道了小鼠精母细胞中驱动蛋白-7 CENP-E 的抑制作用。本文详细介绍了通过腹腔手术向3周龄小鼠睾丸注射特异性抑制剂GSK923295的操作步骤。此外，还描述了一系列组织取材与固定、苏木精-伊红染色、免疫荧光、流式细胞术和透射电子显微镜检查的实验方案。本文展示了 体内 抑制模型 通过 腹部手术与睾丸注射，这可能是一种研究雄性减数分裂的有力技术。我们还证明，在减数分裂Ⅰ期的初级精母细胞中，CENP-E 抑制会导致染色体排列紊乱和中期停滞。我们的 体内 抑制方法将有助于减数分裂的机制研究，为雄性生殖系的遗传修饰提供一种有效手段，并为未来的临床应用提供启示。

我们已成功构建了一个 体内 通过腹腔手术和睾丸注射GSK923295建立小鼠睾丸中CENP-E抑制模型19该方法的关键技术步骤如图所示 图1注射GSK923295四天后，取睾丸组织进行进一步分析。在对照组中，生精小管内的生精波规律且有序（图2A）。然而，在GSK923295组中，生精小管内的生精波发生改变，且在抑制CENP-E后，停滞于中期的初级精母细胞显著增加（图2B-D）。重要的是，在抑制CENP-E后，若干同源染色体未能在赤道板上排列整齐图2B-D）。此外，CENP-E 抑制还导致生精小管中第一次减数分裂中期的精母细胞增加（图2E<str...

本文报道了一种 体内 通过腹腔手术和睾丸注射 CENP-E 抑制剂 GSK923295，建立了一种研究雄性减数分裂的有价值模型。利用免疫荧光、流式细胞术和透射电子显微镜检测，我们发现 CENP-E 抑制会导致小鼠初级精母细胞中染色体排列紊乱和基因组不稳定。

利用精子细胞对驱动蛋白-7 CENP-E 的功能评估 体内 抑制、免疫荧光与流式细胞术

在真核生物中，减数分裂对有性生殖过程中的基因组稳定性和遗传多样性至关重要。对睾丸中精母细胞的实验分析……

减数分裂是真核生物中一种进化上保守的事件，对配子发生和有性生殖至关重要。本方案提供了一种研究减数分裂和精子发生的有效方法。我们已描述了一系列用于分析精母细胞的实验方案。该技术可用于观察减数分裂纺锤体、同源染色体以及精母细胞中的亚细胞器。该方法适用于减数分裂分析、基因编辑动物模型的构建以及组织或器官中的基因转染。实验人员在进行腹腔手术时应保持无菌环境，并注意本实验方案中的温度、时间及其他关键实验条件。本实验操作将由我实验室的研究生许梦菲（Miss Meng-Fei Xu）进行示范。首先，将麻醉后的小鼠四肢固定并绑扎，置于蜡盘上。消毒手术区域后，使用无菌手术刀在小鼠腹腔处切开一个5毫米的开口，随后在皮肤上放置无菌手术钳。然后用无菌解剖镊夹住附睾脂肪垫，借助无菌镊子找到睾丸。在体视显微镜下用无菌镊子固定睾丸后，使用10 µL Riodine将10 µL的GSK923295缓慢注入曲细精管，终浓度为10 µmol。操作完成后，将睾丸推回腹腔，并按照文稿中所述方法缝合手术部位。对采集的小鼠睾丸进行梯度脱水时，按照文中的描述，将样品依次浸入不同的介质中。经过系列浸润后，将组织置于包埋盒底部，并向盒中加入熔化的石蜡。为使石蜡完全凝固，将样品在4°C条件下冷却六小时。随后，将样品固定在超薄切片机的样品台上，同时保持样品与刀片表面之间的角度为5至10度。调节切片厚度为5 µm，使用超薄切片机制备5 µm厚的切片。切片制备完成后，将样品载玻片置于40 °C的水浴中展片，然后在37 °C的载玻片烘干机中干燥12小时。12小时后，按照前述方法对玻片进行依次孵育。随后，将玻片在蒸馏水中冲洗5分钟，再于室温下用迈氏苏木精溶液染色6分钟。然后，在流水下冲洗染色后的玻片5分钟，接着在蒸馏水中孵育2分钟。将切片在1%乙醇盐酸溶液中孵育3秒，然后用流水冲洗2分钟。用1%伊红染色15秒，随后进行逐级孵育。完成后，取15微升中性树胶和24×50毫米的盖玻片封片。进行免疫荧光实验时，将切片放入抗原修复液中，在高压锅内高温高压下煮沸4分钟以进行抗原修复。随后自然冷却至室温，用蒸馏水冲洗两次，每次5分钟，再用PBS缓冲液冲洗5分钟。为通透细胞，将切片在含有0.25% Triton X-100的500微升PBS溶液中孵育10分钟，然后用PBS缓冲液冲洗三次，每次5分钟。进行抗原封闭时，将样本与300微升含3%牛血清白蛋白（BSA）的溶液在室温下孵育一小时，随后在4°C条件下，用含3% BSA的PBST缓冲液与一抗共同孵育16小时。孵育结束后，将载玻片置于湿盒中，防止组织干燥。随后将载玻片在室温下自然复温30分钟。弃去一抗，随后用PBST缓冲液漂洗切片，每次五分钟，共三次。用3% BSA和PBST缓冲液稀释二抗，然后将样品在37摄氏度下与稀释后的二抗孵育一至两小时。用PBST冲洗样本，每次5分钟，共5次，然后在室温下用50微升DAPI染色5分钟。用抗荧光淬灭封片剂封片，并用指甲油封固盖玻片。对于流式细胞术，将小鼠睾丸收集至6厘米的培养皿中，用手术剪将睾丸剪切成1立方毫米大小的组织块。然后在37摄氏度下，将睾丸组织置于含有1毫升1%胶原酶的1.5毫升离心管中消化10分钟。为沉淀生精细胞，以1,000 ×g离心5分钟，弃去上清液，随后向样品中加入1毫升0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液，在37摄氏度下作用20分钟。之后，再次以1,000 ×g离心5分钟。弃去上清液，将沉淀的细胞与一毫升 70% 冷乙醇在 4°C 下孵育超过八小时。在 1,000 G 下离心五分钟，收集细胞沉淀，并用 500 微升碘化丙啶（propidium iodide）或 PI 染色液在 37°C 下对生殖细胞染色 30 分钟。孵育后，使用 300 目滤网过滤样品，以去除细胞碎片，并将细胞收集至流式管中，在 4°C 下保存细胞。使用流式细胞仪在488纳米激发波长下检测荧光信号和光散射。利用ModFit MF LT 32软件分析样品中的DNA含量和光散射情况。在睾丸内注射GSK923295后，由于CENP-E被抑制，生精小管中的生精波发生改变。然而，对照组中曲细精管内的生精波是规则且有序的。观察发现，CENP-E 抑制后，多条同源染色体未能在赤道板上对齐。此外，CENP-E 抑制导致曲细精管中处于第一次减数分裂中期的精母细胞数量增加。免疫荧光分析显示，在抑制CENP-E后，每条生精小管中抗联会复合体蛋白3（SYCP3）阳性细胞的数量减少。另一方面，在GSK92395处理组中，每个中期细胞的SYCP3点状信号数量以及每个细胞的SYCP3条状结构均未受到影响。由于CENP-E的抑制，第一次减数分裂中期精母细胞中纺锤体两极之间的距离增加。代表性分析表明，与对照组相比，GSK923295组中CENP-E抑制导致单倍体细胞比例下降。二倍体细胞和非整倍体细胞的比例在CENP-E抑制后未发生显著变化。相反，GSK923295组中四倍体细胞的比例较对照组升高。对生精细胞进行的透射电子显微镜分析显示，GSK923295组中生精细胞的排列结构出现紊乱。实验人员在进行腹腔手术和睾丸注射时，应注意注射部位、药物剂量、注射方法以及缝合方法。该技术结合体内电穿孔，针对特定蛋白质和基因编辑工具，可用于有丝分裂和精子发生领域的研究。

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