使用 体内 抑制、免疫荧光和流式细胞术对精子细胞中驱动蛋白-7 CENP-E 进行功能评估

减数分裂是真核生物的进化保守事件，对配子发生和有性繁殖至关重要。我们的协议为减数分裂和精子发生研究提供了一种有效的方法。我们已经描述了一系列用于分析精子细胞的方案。

该技术可用于观察精子细胞中的减数分裂纺锤体、同源染色体和亚细胞器。该方法可用于减数分裂的分析、基因编辑动物模型的生成以及组织或器官中的基因转染。实验者在腹部手术期间应保持无菌环境，并注意该方案的温度，时间和关键实验条件。

演示该程序的将是我实验室的研究生徐孟菲小姐。通过将麻醉的小鼠四肢绑起来并将它们固定在蜡盘上，开始构建GSK923295介导的着丝粒蛋白E或CENP-E抑制小鼠模型。对手术区域进行消毒后，使用无菌手术刀在小鼠的腹腔中开一个五毫米的开口，然后将无菌手术夹放在皮肤上。

然后用无菌解剖钳拉附睾脂肪垫，在无菌镊子的帮助下定位睾丸。在立体镜下用无菌镊子固定睾丸后，使用10微升Riodine以10微摩尔的终浓度缓慢将10微升GSK923295注入生精小管。完成后，将睾丸推回腹腔并缝合手术部位，如文本手稿中所述。

对于收集的小鼠睾丸的梯度脱水，如手稿中所述，在各种培养基中依次孵育样品。连续孵育后，将组织放在包埋盒的底部，然后将熔化的石蜡加入盒子中。为了使石蜡完全凝固，请将样品在四摄氏度下冷却六小时。

之后，将样品固定在超薄切片机的支架上，同时将样品与刀表面之间的角度保持在 5 到 10 度。将切片厚度调整到五微米，以使用超薄切片机制备五微米厚的切片。制备后，将样品载玻片铺在40摄氏度的水浴中，然后在载玻片干燥器中以37摄氏度干燥切片12小时。

12小时后，如前所述对载玻片进行顺序孵育。接下来，在蒸馏水中冲洗载玻片五分钟，然后在室温下用Mayer苏木精溶液染色六分钟。然后在流水中冲洗染色的载玻片五分钟，并用蒸馏水孵育两分钟。

将载玻片在1%乙醇盐酸盐中孵育三秒钟，然后冲洗和流水两分钟。用1%伊红染色样品15秒，然后连续孵育。完成后，使用 15 微升中性口香糖和 24 x 50 毫米的盖玻片密封载玻片。

对于免疫荧光，将载玻片放入抗原修复溶液中，在高压锅中高压沸腾四分钟以进行抗原修复。然后将载玻片自然冷却至室温，然后用蒸馏水冲洗两次五分钟，用PBS冲洗五分钟。为了透化细胞，将载玻片在PBS中的500微升0.25%Triton X-100中孵育10分钟，然后用PBS冲洗载玻片5分钟三次。

对于抗原阻断，将样品与 300 μL 3% 牛血清白蛋白或 BSA 一起孵育 1 小时，并将一抗在 3% BSA 中在 PBST 中孵育 16 小时，温度为 4 摄氏度。孵育后，将载玻片放入加湿的盒子中，以防止组织变干。将载玻片自然重新加热至室温 30 分钟。

丢弃一抗，然后在PBST中冲洗载玻片五分钟三次。用 3% BSA 和 PBST 稀释二抗。然后将样品与稀释的二抗在 37 摄氏度下孵育一到两个小时。

在PBST中冲洗样品五分钟五次后，在室温下用50微升DAPI染色细胞核五分钟。用防褪色安装介质安装盖玻片，并用指甲油密封盖玻片。对于流式细胞术，将小鼠睾丸收集在六厘米培养皿中，并使用手术剪刀将睾丸切成一立方毫米的碎片。

然后在1.5毫升离心管中将睾丸在1.5毫升离心管中消化10分钟，温度为37。为了沉淀生精细胞，将样品以1， 000G离心5分钟并弃去上清液，然后在37摄氏度下在样品中加入一毫升0.25%胰蛋白酶EDTA溶液20分钟。之后，将样品以 1， 000 G 离心五分钟。

弃去上清液，将沉淀的细胞与一毫升70%冷乙醇在4摄氏度下孵育8小时以上。在1， 000G离心5分钟后，收集细胞沉淀物并用500微升碘化丙啶或PI染色溶液在37摄氏度下染色生精细胞30分钟。孵育后，使用300目筛过滤样品以消除细胞碎片，并将细胞收集在流管中以将细胞储存在4摄氏度下。

使用流式细胞仪检测488纳米激发波长处的荧光信号和光散射。使用 ModFit MF LT 32 软件分析样品中的 DNA 含量和光散射。睾丸注射GSK923295后，由于CENP-E抑制，生精波在生精小管中发生改变。

然而，生精小管中的生精波在对照组中是规则的和有组织的。观察到在CENP-E抑制后，几条同源染色体在赤道板上未对齐。此外，CENP-E抑制导致生精小管中期I期精精子细胞的增加。

免疫荧光分析表明，CENP-E抑制后，每个生精小管的抗突触复合蛋白三或SYCP3阳性细胞数量减少。另一方面，GSK92395组中每个中期细胞的SYP3点和每个细胞的SYP3拉伸不受影响。由于CENP-E抑制，中期I期精精子细胞的纺锤形极距离增加。

代表性分析表明，与对照组相比，CENP-E抑制导致GSK 923295组中单倍体细胞减少。CENP-E抑制后二倍体细胞和非整倍体细胞的比例无显著影响。相反，GSK923295组的四倍体细胞比例比对照组增加。

生精细胞的透射电子显微镜分析显示GSK923295组中生精细胞的组织被破坏。实验者在腹部手术和睾丸注射时应注意注射位置、药物剂量、注射方法和缝合方法。该技术与专注于靶向蛋白质的体内电穿孔和基因编辑工具一起可用于瞳孔分裂和精子发生领域。