利用精子细胞对驱动蛋白-7 CENP-E 的功能评估 体内 抑制、免疫荧光与流式细胞术

减数分裂是真核生物中一种进化上保守的事件，对配子发生和有性生殖至关重要。本方案提供了一种研究减数分裂和精子发生的有效方法。我们已描述了一系列用于分析精母细胞的实验方案。

该技术可用于观察减数分裂纺锤体、同源染色体以及精母细胞中的亚细胞器。该方法适用于减数分裂分析、基因编辑动物模型的构建以及组织或器官中的基因转染。实验人员在进行腹腔手术时应保持无菌环境，并注意本实验方案中的温度、时间及其他关键实验条件。

本实验操作将由我实验室的研究生许梦菲（Miss Meng-Fei Xu）进行示范。首先，将麻醉后的小鼠四肢固定并绑扎，置于蜡盘上。消毒手术区域后，使用无菌手术刀在小鼠腹腔处切开一个5毫米的开口，随后在皮肤上放置无菌手术钳。

然后用无菌解剖镊夹住附睾脂肪垫，借助无菌镊子找到睾丸。在体视显微镜下用无菌镊子固定睾丸后，使用10 µL Riodine将10 µL的GSK923295缓慢注入曲细精管，终浓度为10 µmol。操作完成后，将睾丸推回腹腔，并按照文稿中所述方法缝合手术部位。

对采集的小鼠睾丸进行梯度脱水时，按照文中的描述，将样品依次浸入不同的介质中。经过系列浸润后，将组织置于包埋盒底部，并向盒中加入熔化的石蜡。为使石蜡完全凝固，将样品在4°C条件下冷却六小时。

随后，将样品固定在超薄切片机的样品台上，同时保持样品与刀片表面之间的角度为5至10度。调节切片厚度为5 µm，使用超薄切片机制备5 µm厚的切片。切片制备完成后，将样品载玻片置于40 °C的水浴中展片，然后在37 °C的载玻片烘干机中干燥12小时。

12小时后，按照前述方法对玻片进行依次孵育。随后，将玻片在蒸馏水中冲洗5分钟，再于室温下用迈氏苏木精溶液染色6分钟。然后，在流水下冲洗染色后的玻片5分钟，接着在蒸馏水中孵育2分钟。

将切片在1%乙醇盐酸溶液中孵育3秒，然后用流水冲洗2分钟。用1%伊红染色15秒，随后进行逐级孵育。完成后，取15微升中性树胶和24×50毫米的盖玻片封片。

进行免疫荧光实验时，将切片放入抗原修复液中，在高压锅内高温高压下煮沸4分钟以进行抗原修复。随后自然冷却至室温，用蒸馏水冲洗两次，每次5分钟，再用PBS缓冲液冲洗5分钟。为通透细胞，将切片在含有0.25% Triton X-100的500微升PBS溶液中孵育10分钟，然后用PBS缓冲液冲洗三次，每次5分钟。

进行抗原封闭时，将样本与300微升含3%牛血清白蛋白（BSA）的溶液在室温下孵育一小时，随后在4°C条件下，用含3% BSA的PBST缓冲液与一抗共同孵育16小时。孵育结束后，将载玻片置于湿盒中，防止组织干燥。随后将载玻片在室温下自然复温30分钟。

弃去一抗，随后用PBST缓冲液漂洗切片，每次五分钟，共三次。用3% BSA和PBST缓冲液稀释二抗，然后将样品在37摄氏度下与稀释后的二抗孵育一至两小时。

用PBST冲洗样本，每次5分钟，共5次，然后在室温下用50微升DAPI染色5分钟。用抗荧光淬灭封片剂封片，并用指甲油封固盖玻片。对于流式细胞术，将小鼠睾丸收集至6厘米的培养皿中，用手术剪将睾丸剪切成1立方毫米大小的组织块。

然后在37摄氏度下，将睾丸组织置于含有1毫升1%胶原酶的1.5毫升离心管中消化10分钟。为沉淀生精细胞，以1,000 ×g离心5分钟，弃去上清液，随后向样品中加入1毫升0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液，在37摄氏度下作用20分钟。之后，再次以1,000 ×g离心5分钟。

弃去上清液，将沉淀的细胞与一毫升 70% 冷乙醇在 4°C 下孵育超过八小时。在 1,000 G 下离心五分钟，收集细胞沉淀，并用 500 微升碘化丙啶（propidium iodide）或 PI 染色液在 37°C 下对生殖细胞染色 30 分钟。孵育后，使用 300 目滤网过滤样品，以去除细胞碎片，并将细胞收集至流式管中，在 4°C 下保存细胞。

使用流式细胞仪在488纳米激发波长下检测荧光信号和光散射。利用ModFit MF LT 32软件分析样品中的DNA含量和光散射情况。在睾丸内注射GSK923295后，由于CENP-E被抑制，生精小管中的生精波发生改变。

然而，对照组中曲细精管内的生精波是规则且有序的。观察发现，CENP-E 抑制后，多条同源染色体未能在赤道板上对齐。此外，CENP-E 抑制导致曲细精管中处于第一次减数分裂中期的精母细胞数量增加。

免疫荧光分析显示，在抑制CENP-E后，每条生精小管中抗联会复合体蛋白3（SYCP3）阳性细胞的数量减少。另一方面，在GSK92395处理组中，每个中期细胞的SYCP3点状信号数量以及每个细胞的SYCP3条状结构均未受到影响。由于CENP-E的抑制，第一次减数分裂中期精母细胞中纺锤体两极之间的距离增加。

代表性分析表明，与对照组相比，GSK923295组中CENP-E抑制导致单倍体细胞比例下降。二倍体细胞和非整倍体细胞的比例在CENP-E抑制后未发生显著变化。相反，GSK923295组中四倍体细胞的比例较对照组升高。

对生精细胞进行的透射电子显微镜分析显示，GSK923295组中生精细胞的排列结构出现紊乱。实验人员在进行腹腔手术和睾丸注射时，应注意注射部位、药物剂量、注射方法以及缝合方法。该技术结合体内电穿孔，针对特定蛋白质和基因编辑工具，可用于有丝分裂和精子发生领域的研究。