蓝藻中完整藻胆体的分离与表征

这是一个简单而快速的方案，允许不熟悉蓝藻的人轻松分离藻类动物。这种技术的优点是它适应了小规模，并且易于执行。它是分离模型和非模型性蓝霉菌完整藻属的简单、可靠和有效的方法。

首先将750纳米处0.8 OD的细胞培养物转移到一升烧瓶中，并将其稀释在500毫升B-HEPES培养基中，以达到750纳米处的OD为0.2。在30摄氏度下持续搅拌培养物，直到OD达到0.8比1，表明指数生长阶段较晚。在室温下以10， 000次g的速度离心培养物20分钟并弃去上清液。

悬浮细胞沉淀并用0.75摩尔磷酸钾缓冲液洗涤两次，pH值为7。通过在室温下离心将细胞沉淀在50毫升离心管中。弃去上清液并用0.75摩尔磷酸钾缓冲液重悬细胞。

通过电子天平测量沉淀的湿重，并将沉淀的一克湿重重在五毫升的缓冲液中。将一毫升细胞悬浮液和0.4至0.6克0.1毫米玻璃珠加入两毫升螺旋盖小瓶中。用珠子打浆机将细胞破碎30秒。

让管子在室温水浴中冷却两分钟。裂解后，在室温下以500倍g的速度离心小瓶10秒。用移液管将上清液收集到15毫升的离心管中。

用0.5毫升0.75摩尔的磷酸钾缓冲液洗涤珠子一次，然后转移到同一离心管中。将Triton X-100加入裂解的细胞悬浮液中，并在室温和40RPM下在摇摆振荡器上孵育20分钟或直到溶液变均质。将试管以17，210倍g离心20分钟，并将上清液在室温下储存没有上Triton胶束层长达一小时。

在pH值为7的0.75摩尔磷酸钾缓冲液中制备四种浓度的蔗糖。将2.8毫升两摩尔蔗糖缓冲液置于40毫升离心管的底部，并用三层蔗糖溶液覆盖。最后，加入三毫升含有上清液馏分的PBS，并离心所得梯度。

超离心后，在层之间凝结分馏的PBS和藻胆蛋白，并观察Syn6803和界面中的蓝色条带。通过反复浓缩并用0.75摩尔磷酸钾缓冲液稀释馏分并膜离心过滤单元来除去蔗糖。为了测量PBS荧光，用0.75摩尔磷酸钾缓冲液稀释浓缩的PBS样品，以构成高达500微升的体积。

将稀释的PBS样品加入透明玻璃管中，并将管子冷冻在液氮中直至完全冻结。将冷冻管移动到预先装满液氮的透明杜瓦瓶容器中。完全细胞裂解显示离心前的上清液和深蓝绿色。

分离的PBS的蔗糖密度梯度分离显示解离藻胆蛋白的几个部分，最低部分代表完整的PBS。JSC one和Syn6803的解离和完整PBS的吸收光谱在622纳米处具有相同的峰值，对应于藻蓝蛋白。此外，在JSC-1的解离和完整PBS中，藻红素吸收峰为571纳米。

解离PBS的发射光谱在Syn6803和JSC-1中具有约650纳米的强峰，代表藻蓝蛋白的发射。荧光发射最大峰值在651纳米和684纳米处表明，藻蓝蛋白收集的能量被有效地转移到核心中的别异胞菌蓝蛋白和末端发射器，即ApcD和ApcE。该图显示了紫外照射下的锌染色SDS-PAGE，其中藻胆蛋白亚基具有强烈的荧光，而ApceE显示出微弱的荧光，用箭头表示。

Kumasi蓝色染色显示上部部分含有其他非PBS水溶性蛋白，完整的PBS和Syn6803显示出突出的ApcE条带，用箭头表示，缺乏解离的PBS级分。超速离心表明，以1:3的比例制备的蔗糖梯度比以1:10的比例制备的蔗糖梯度显示出更宽的条带。重要的是裂解细胞并完全溶解上清液以获得更多的藻胆体。

其他方法，如冷冻电镜或混合光谱法，可用于研究藻糖体的蛋白质结构或蛋白质组成。