利用自发荧光成像评估细胞代谢

ADH 和 FAD 是内源性分子，在不同的激发和发射波长下表现出自发荧光。由于它们作为代谢反应辅酶的用途，自发荧光显微镜可用于评估细胞代谢。对 NADH 和 FAD 的自发荧光成像无需外源性标记，是一种具有亚细胞分辨率的非破坏性方法。

自发荧光显微镜可用于活体样本及时间序列研究。自发荧光成像可广泛应用于任何活细胞或组织。该技术已用于神经元、癌细胞、肿瘤、活体、干细胞以及免疫细胞的成像。

本实验操作将由来自德克萨斯农工大学定量光学成像实验室的研究生Linghao Hu进行演示。首先启动多光子荧光寿命显微镜的所有组件，包括激光源和探测器。在放置样品前，打开明场光源，并确保光线进入目镜。

然后，选择用于细胞成像的物镜。如果使用非空气物镜，需在物镜顶部滴加一滴相应的浸没介质。将玻璃底培养皿放置在显微镜载物台上样品架的位置。

然后，使用X/Y轴载物台控制装置将样本在物镜下居中。确保样本已固定牢固，在成像过程中不会移动。完成后，通过目镜观察，并向上移动物镜以聚焦到细胞上。如果显微镜位于密闭罩内，请关闭光源箱的门。

接下来，打开图像采集软件，点击多光子成像选项卡，按照论文中所述设置多光子成像参数。将探测器的增益调节至荧光寿命成像（FILM）的最佳值。然后，将激光在样品每个像素上的停留时间调整至所需数值。

对于烟酰胺腺嘌呤磷酸二核苷酸（NADPH），将多光子激光器设置为750纳米。然后，确认激光器的功率控制已调至零，以确保在打开激光快门时细胞不会受损。设置发射滤光片为400至500纳米。

参数设置完成后，以聚焦或实时预览模式开始成像，以优化图像设置。将激光功率从3毫瓦缓慢增加至8毫瓦，同时确保细胞处于焦点位置。调整完成后，记录所使用的最大功率。

使用记录的最大功率设置对培养皿的其他区域进行成像。以60秒的图像积分时间采集一张NADPH-FILM图像，并检查图像是否具有足够数量的光子，例如在荧光寿命衰减曲线中，细胞质像素的光子数峰值达到100个。如果光子数量过低，可增加激光功率或图像采集时间。

对于黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）成像，将多光子激光器设置为890纳米，并等待激光器在新波长下实现锁模。初始时确保激光器的功率控制设置为零。设置发射滤光片为500至600纳米。

为了优化图像设置，以聚焦或实时预览模式开始成像，将激光功率增加至5至10毫瓦，并记录所使用的最大功率。后续视野的FAD成像应使用相同的功率设置。以60秒的图像积分时间采集FAD-FILM图像，并检查图像在荧光寿命衰减曲线内是否具有足够的光子数。

如果光子数量过低，可提高激光功率或延长图像采集时间，并额外采集四到五个视野（FOV），每个图像之间间隔两个视野。要配制80毫摩尔的氰化钠溶液，将130.24毫克氰化钠溶解于25毫升PBS中。从培养皿中吸出100微升培养基，加入100微升氰化钠溶液，使培养皿中氰化物的终浓度为4毫摩尔。

将细胞放入培养箱中孵育5分钟，使细胞与氰化物溶液反应。氰化物处理后，按照之前所述方法获取细胞的NADPH和FAD荧光图像。该研究利用从尿素测得的仪器响应函数（IRF）计算荧光寿命参数。

对用于分割的每个细胞的细胞质像素进行参数平均。通过识别并遮蔽单个细胞以消除背景噪声，随后识别细胞核并将其投影到细胞掩膜上。

此外，通过过滤去除不符合典型细胞大小的遮蔽区域。利用多光子荧光寿命成像技术对NADPH和FAD进行检测，可在氰化物处理前后观察细胞形态和代谢情况。观察发现，经氰化物处理后，NADPH的荧光寿命缩短，而FAD的荧光寿命则延长。

代表性箱线图显示，MCF7 细胞在氰化物处理后光学氧化还原比率下降。氰化物暴露降低了 MCF7 细胞中NADPH的幅度加权寿命。NADPH 的短寿命和长寿命均下降，而 NADPH alpha one 则增加。

对于FAD，MCF7细胞在氰化物暴露后，其振幅加权寿命增加。FAD的短寿命和长寿命均增加，而FAD alpha one则减少。向样品提供足够的激光功率非常重要，但需注意，过高的功率可能对细胞造成损伤。

由于自发荧光成像对细胞无损伤，因此可对同一样本进行后续的生化检测。