Name: 小鼠后肢坏死模型中脚垫脉管系统的高分辨率三维成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: 学习利用DiI灌注技术对小鼠后肢坏死模型进行高分辨率三维成像，以研究外周动脉疾病和肢体缺血。该方法为临床前药物测试和血管新生评估提供了有效的实验平台。

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本研究得到了美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）向 Z-J L 和 OC V 提供的资助 [R01HL149452 和 VITA (NHLBl-CSB-HV-2017-01-JS)]。我们还感谢迈阿密大学医学院迈阿密项目（Miami Project to Cure Paralysis）的显微镜与影像设施，提供了图像分析与处理软件的使用权限。

本方案中描述的所有动物实验均经迈阿密大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。研究使用了8至12周龄的FVB小鼠，包括雄性和雌性。
1. L-NAME 溶液的配制
<ol>
	<li>在超净工作台的无菌条件下，将 1 g L-NAME 粉末（见材料表）溶于 20 mL 无菌水中，配制 L-NAME 储存液，终浓度为 50 mg/mL。将储存液分装为 300–500 µL 每份，于 -20 °C 保存，最长可保存 3 个月。</li>
	<li>配制 L-NAME 工作液时，在无菌条件下将一份 L-NAME 储存液解冻，并用 PBS 按 1:4 比例稀释，得到终浓度为 10 mg/mL 的工作液。</li>
	<li>配制 PBS（pH 7.4）：将 8 g NaCl、0.2 g KCl、1.44 g Na2HPO4 和 0.23 g NaH2PO4 溶于 800 mL 蒸馏水中，用 HCl 调节 pH 至 7.4，加水定容至 1,000 mL，经 0.22 µm 瓶顶滤器过滤。 
	&#8203;注意：每克体重腹腔注射 4 µL L-NAME 工作液&#160;相当于给予 40 mg/kg 的 L-NAME 剂量。使用过程中 L-NAME 工作液应置于冰上，且每日需使用新解冻的储存液分装物配制新鲜稀释液。</li>
</ol>
2. 化学与手术诱导后肢坏疽
<ol>
	<li>获取8至12周龄的FVB小鼠，可从供应商处购买或在实验室内自行繁育（参见材料表）。术前2小时，腹腔注射40 mg/kg&#160;剂量的L-NAME。</li>
	<li>通过腹腔注射100 mg/kg氯胺酮和10 mg/kg赛拉嗪（参见材料表，用PBS稀释）对小鼠进行麻醉。通过夹捏脚趾无反射确认麻醉充分，并在手术过程中持续监测呼吸频率。
	<ol>
		<li>使用剪刀和/或脱毛膏去除双侧后肢及腹股沟区域的毛发。将动物仰卧位置于手术显微镜下，伸展四肢并用胶带固定。围绕手术区域环形涂抹聚维酮碘溶液，对术区进行消毒。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在10-20倍放大下，使用剪刀或手术刀沿腹股沟皱褶、腹股沟韧带稍下方做1 cm长的切口。使用精细镊子和无菌棉签钝性分离腹股沟脂肪垫，使其向侧方移位，暴露下方的股鞘，从而清晰辨认股动脉、股静脉和股神经（图1）。</li>
	<li>使用精细镊子刺破股鞘，小心将股神经从股动脉上推开。在股神经深面识别股动脉发出的旋股外侧分支（LCFA）（图1）。
	<ol>
		<li>启动电凝设备（参见材料表），在LCFA近端稍上方对股动脉和股静脉进行电凝，操作时以侧向移动方式轻触血管，确保股神经被充分隔离并免受热损伤。使用剪刀切断已凝固的血管段。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过将腹股沟脂肪垫向内侧牵拉，进一步暴露远端股动脉和股静脉。更远端处识别表浅腹壁上动脉和隐腘静脉汇合部。
	<ol>
		<li>在上述两个结构之间刺破股鞘，小心将股神经从股血管上分离。按照步骤2.4.1所述方法对股动脉和股静脉进行电凝和横断。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用装有无菌PBS的注射器冲洗手术区域。对任何出血部位，用棉签施加轻柔压力3-5分钟，以实现止血。
	<ol>
		<li>采用可吸收5-0缝线，以连续简单缝合方式关闭切口。皮下注射1 mg/kg缓释布托啡诺（参见材料表），用于术后镇痛。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用激光多普勒血流成像仪（LDPI）确认结扎侧后肢足垫灌注丧失（参见材料表）。在动物仍处于麻醉状态下，将其俯卧于深色泡沫垫上，置于LDPI仪器下方，并用电工胶带环形固定足部。
	<ol>
		<li>对双侧足部进行LDPI扫描。扫描完成后，在每个足垫周围绘制&#160;感兴趣区域（ROI），获取平均血流值。</li>
		<li>计算灌注指数，即结扎侧与未结扎侧足垫平均血流值的比值。确保灌注指数小于0.1。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将动物转移至清洁笼盒中，放置加热垫或使用上方加热灯以维持核心体温。在将小鼠送回动物房前，确保其完全从麻醉中恢复。</li>
</ol>
3. 术后给予L-NAME及后肢坏疽的监测
<ol>
	<li>术后第1-3天，对每只动物额外给予40 mg/kg剂量的L-NAME腹腔注射。同时，仔细评估缺血肢体的足部情况。</li>
	<li>采用Faber后肢缺血评分法9量化后肢缺血和坏疽程度。评分1-5分：缺血趾甲数量；6-10分：1-5个缺血足趾；11和12分：足部部分及完全萎缩。记录术后第1-3天的Faber评分，之后每周记录一次。</li>
</ol>
4. 动物灌注用DiI及工作溶液的制备
<ol>
	<li>配制DiI储存液：将100 mg DiI晶体（参见材料表）溶于16.7 mL 100%乙醇中。用铝箔包裹，于室温避光条件下在摇床上孵育过夜。</li>
	<li>配制稀释液：将50 g葡萄糖溶于1,000 mL蒸馏水中，配制成5%葡萄糖溶液。使用0.22 µm瓶顶滤器过滤。按1:4比例混合PBS与5%葡萄糖溶液，制备工作用稀释液。</li>
</ol>
5. 仪器设置与 DiI 灌注
<ol>
	<li>使用前，立即将200 µL DiI储备液加入10 mL工作稀释液（步骤4.2中配制）中，配制DiI工作液。用手振荡充分混匀。</li>
	<li>连接两个或三个三通旋塞阀和一个25 G蝶形针头，串联在一起。准备含有4 mL PBS、10 mL DiI溶液和10 mL 10%中性缓冲甲醛的10 mL注射器（参见 材料表).</li>
	<li>将装有福尔马林的注射器连接至近端进液口，注入溶液以排出管路中的空气；旋转旋塞关闭该端口。依次重复相同操作，分别将装有DiI和PBS的注射器连接至中间和远端进液口，注意通过旋塞组件彻底排出所有气泡。 
	注意：确保旋塞组件或管路的任何部分均无气泡。气泡可能在灌注过程中阻塞小动脉，导致血管内DiI分布不均，影响成像结果。</li>
	<li>实验装置完成后，通过 CO2 在诱导室中过量</li>
	<li>将待灌注的动物仰卧置于吸水垫上，并用针固定腋部和下肢。</li>
	<li>使用剪刀做一横切口以打开腹腔。暴露并切断左侧和右侧膈肌，以进入胸腔。
	<ol>
		<li>从下部肋骨向上至第一或第二肋骨处，沿胸骨两侧切开胸壁，注意避开内侧的胸廓内（乳房）动脉。使用止血钳（参见 材料表用镊子夹住胸骨下端，并将其向动物头部方向翻折，以暴露胸腔。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>辨认左心室，其颜色较右心室更浅。用钝头镊子轻轻夹住心脏，将蝶形针插入左心室。
	<ol>
		<li>用剪刀或18 G针头刺穿右心房，使血液和灌注液能够回流至心脏并排出。用一只手或两只手固定针头，注意避免意外刺穿右心室，导致灌注进入肺循环而非体循环。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>打开端口&#160;用PBS注射器以1-2 mL/min的速度手动注入2-4 mL PBS，持续1-2分钟，以冲洗血管系统中的血液。通过观察右心房是否出血来确认灌注成功。注射完成后，关闭PBS注射器的接口。</li>
	<li>打开端口&#160;用装有DiI的注射器以每分钟1-2 mL的速度注射5-10 mL，持续5分钟。注射DiI溶液时，观察耳朵、鼻子和手掌部位，这些区域应略微变粉红。注射完成后，关闭DiI注射器的端口，静置2分钟，以使染料充分掺入，然后再注入固定剂。</li>
	<li>打开通向福尔马林注射器的端口，以1-2 mL/min的速度注入5-10 mL，持续5分钟。注射完成后，从左心室拔出针头，随后采集目标组织。</li>
	<li>使用重型剪刀在踝关节处脱位胫骨，将左脚和右脚完全从下肢分离。将采集的足部组织放入含1-2 mL 10%福尔马林溶液的6孔或12孔板中。用铝箔包裹培养板，于4 °C过夜保存。</li>
</ol>
6. 足垫组织共聚焦激光扫描显微镜样品的制备
<ol>
	<li>第二天，将6孔或12孔板中的固定液更换为每孔1-2 mL的PBS。</li>
	<li>为了剥离足部皮肤，首先用手术刀在足底面和背侧做纵向切口。然后使用有齿镊子和小型止血钳，仔细去除足部及脚趾上的全部皮肤，注意不要损伤下方的软组织。</li>
	<li>随后进行组织的封片与成像，最好在灌注和取材后1-2天内完成。或者，可将足垫放回6孔或12孔板中，每孔加入1-2 mL PBS，用铝箔覆盖后置于4 °C保存，以维持荧光信号长达1个月。</li>
	<li>进行组织封片时，将每只足置于两片玻璃载玻片之间，并在两端各放置一片对折一次或两次（根据组织厚度决定）的泡沫活检垫（参见材料表）。在两端各使用两个小型文件夹夹子将玻璃载玻片夹紧（最终厚度约1 mm）。 
	&#8203;注意：较厚的组织将需要更长的扫描时间。去皮后的足垫可在成像前一天用玻璃载玻片夹压，以减小组织厚度。</li>
</ol>
7. 共聚焦激光扫描显微镜
<ol>
	<li>准备成像实验：打开成像系统并启动采集软件（参见材料表）。使用低倍率/低数值孔径物镜（例如 x5/0.15）进行成像，因为低倍物镜通常具有本实验所需的较长工作距离。</li>
	<li>在“激活载物台”对话框中点击是。在“配置”选项卡中激活561 nm激光器。在主界面中，通过点击可见光按钮启用可见光光路。通过点击相应的激活复选框，将探测器设置为570–600 nm波长范围。</li>
	<li>在采集 &#62; 采集选项卡中选择拼图扫描图标，并设置所需的分辨率（512 × 512 或 1024 × 1024）。</li>
	<li>将夹在玻璃载玻片之间、未加水或PBS的干燥组织样本置于显微镜载物台上，并调节焦距使组织清晰成像。</li>
	<li>为设定扫描区域边界，先移动至样本的左上或右上角。在“采集”选项卡的“拼图扫描”菜单下，点击标记位置按钮。再移动至对角（分别为右下或左下角），再次点击标记位置按钮。</li>
	<li>为设定Z轴堆栈的深度，点击屏幕左下角的实时按钮，并移动至样本中心。使用Z轴调节旋钮逐层扫描至样本底部。</li>
	<li>在“采集”选项卡的Z轴堆栈菜单下，点击开始按钮，逐层扫描至样本顶部，然后点击结束按钮。点击Z步长并设置为所需数值（例如，50 µm）。</li>
	<li>在屏幕右下角点击开始按钮，启动图像采集。</li>
</ol>
8. 足垫血管化的定量分析与三维重建
<ol>
	<li>下载并安装最新版本的 Fiji（ImageJ）以及血管分析插件20。在 Fiji 中打开显微镜图像文件，软件会将单独的 Z 系列图像合并为 Z 轴堆栈，可通过图像底部的滑块沿 z 轴进行浏览。</li>
	<li>选择复合的 Z 轴堆栈图像，然后在菜单“图像”下选择 堆栈 &#62; Z 投影，以生成二维投影图像。接着，在 处理 &#62; 二值化 &#62; 转为二值图像 中将 Z 投影图像转换为二值图像。</li>
	<li>在 插件 &#62; 血管密度 下运行血管密度插件。当提示时，使用光标沿足垫和脚趾的边缘描绘一个&#160;感兴趣区域（ROI）。记录插件报告的血管密度值，该值以 ROI 内血管面积占比的百分比形式表示。</li>
	<li>要在 Fiji 中创建三维重建图像，请选择 堆栈 &#62; 3D 投影，并在“图像”菜单下设置所需的旋转轴、角度和速度。或者，在 插件 菜单下选择 体积查看器，以切片形式查看图像，或在指定轴向上对重建图像进行操作。</li>
	<li>对于更复杂的三维渲染，可使用其他图像分析和处理软件（参见 材料表）。将文件转换为目标软件支持的格式，并使用拼接功能将各个图块扫描图像拼接成完整图像。</li>
	<li>将各个图块扫描图像拼接完成后，打开合并后的文件并进行体积表面渲染。点击 添加新表面 以启动表面创建向导，使用箭头在菜单中切换，特别是设置感兴趣区域（ROI）和阈值强度。当对表面渲染结果满意后，使用动画功能生成处理后图像的视频。</li>
</ol>

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作者声明无利益冲突。

尽管小鼠后肢缺血是研究外周动脉疾病（PAD）和慢性肢体威胁性缺血（CLTI）中新血管生成最常用的临床前模型，但缺血的严重程度和恢复情况在不同小鼠品系之间存在显著差异，且受动脉阻断的具体部位、数量及方法的影响。股动脉结扎联合腹腔注射L-NAME可稳定地在FVB小鼠中诱导后肢坏疽11。相同处理在C57BL/6小鼠中仅导致后肢缺血而无组织丢失，而在BALB/c小鼠中，仅通过股动脉结扎即可诱导足部或腿部的自截。因此，在对缺血损伤反应介于中间水平的FVB小鼠中，采用上述股动脉凝固联合术后给予L-NAME的技术，提供了一种独特且可重复的足垫坏疽模型，类似于导致CLTI最严重表现的疾病所呈现的病理状态。该模型所观察到的组织丢失程度可从少数缺血性趾甲至多个坏疽性足趾不等，但极少进展至足部或腿部的自截，从而允许对肢体再灌注和功能进行纵向评估。与BALB/c小鼠中坏疽迅速发生、肢体自截通常在一周内完成不同，该FVB小鼠坏疽模型的组织丢失发生较迟。股动脉凝固可急性限制后肢血流，而术后第0至3天给予L-NAME所导致的氧化应激累积则较为缓慢，萎缩性改变的峰值出现在术后7至14天之间。因此，该模型提供了更优的治疗时...

外周动脉疾病（PAD）是由动脉粥样硬化导致四肢血流减少的一种疾病，在美国影响约650万人，在全球影响约2亿人1。PAD患者会出现肢体功能下降和生活质量降低，而患有CLTI（PAD最严重形式）的患者截肢和死亡风险显著增加，5年死亡率接近50%2。在临床实践中，踝肱指数（ABI）&#60;0.9的患者被认为患有PAD，而ABI &#60;0.4且伴有静息痛或组织缺损的患者则被诊断为CLTI3。症状表现因人而异，即使ABI相似，症状也可能受到日常活动水平、肌肉对缺血的耐受性、解剖结构差异以及侧支循环发育程度不同的影响4。指端和肢体坏疽是所有导致CLTI的血管闭塞性疾病中最严重的表现形式，属于干性坏死，可使软组织呈木乃伊样改变。除动脉粥样硬化性PAD外，该情况也可出现在糖尿病患者、患有血栓闭塞性脉管炎（Buerger病）或雷诺现象（Raynaud现象）等血管炎性疾病患者，以及终末期肾病背景下发生钙化防御（calciphylaxis）的患者中5,6。
已开发出多种临床前模型用于研究外周动脉疾病/慢性肢体威胁性缺血（PAD/CLTI）的发病机制，并评估潜在治疗方法的有效性，其中最常用的是小鼠后肢缺血模型。通常通过结扎、电凝或其他方式阻断髂动脉或股动脉的血流，从而在小鼠中诱导后肢缺血7。这些技术可显著减少后肢的灌注，并刺激大腿和小腿肌肉中的新生血管形成。然而，不同小鼠品系对缺血损伤的敏感性存在重要差异，部分原因在于侧支循环分布的解剖学差异8,9。例如，C57BL/6小鼠对后肢缺血相对耐受，仅表现出肢体功能下降，但通常不会出现足垫坏疽的迹象。相比之下，BALB/c小鼠本身恢复缺血的能力较差，仅通过股动脉结扎通常就会导致足部或下肢的自体截肢。这种对缺血的严重反应缩小了治疗时间窗，并可能妨碍对肢体再灌注和功能进行纵向评估。有趣的是，位于小鼠7号染色体上的一个数量性状位点的遗传差异已被证实与C57BL/6和BALB/c小鼠在组织坏死及肢体再灌注方面的不同易感性相关10。
与C57BL/6和BALB/c品系相比，FVB小鼠在接受单纯股动脉结扎后表现出中等但不一致的反应。部分动物出现足垫坏疽，表现为缺血性黑色趾甲或干性坏死的脚趾，而另一些动物则无明显缺血迹象11。同时给予盐酸Nω-硝基-L-精氨酸甲酯（L-NAME）——一种一氧化氮合酶（NOS）抑制剂12，可阻断代偿性血管舒张机制，并进一步增加后肢组织的氧化应激。该方法联合股动脉结扎或凝固术，可在FVB小鼠中稳定诱导出类似慢性肢体威胁性缺血（CLTI）的足垫组织缺失，但极少进展至肢体自体截肢11。氧化应激是外周动脉疾病（PAD）/CLTI的特征之一，由内皮功能障碍和一氧化氮（NO）生物利用度降低所驱动13,14。NO是一种多功能分子，通常对动脉和毛细血管血流、血小板黏附与聚集以及白细胞募集和活化发挥有益作用13。已有研究表明，NOS水平降低还可激活血管紧张素转换酶，从而诱导氧化应激并加速动脉粥样硬化进展15。
建立后肢缺血模型后，还需监测后续肢体再灌注情况以及任何潜在治疗措施的疗效。在 proposed 小鼠坏疽模型中，可首先采用 Faber 评分对足部外观进行评估，以量化组织缺损程度（0：正常；1-5：指甲缺失，评分代表受累指甲数量；6-10：足趾萎缩，评分代表受累足趾数量；11-12：分别为部分和完全足部萎缩）。9随后通常使用激光多普勒灌注成像（LDPI）对后肢灌注进行定量测量，该技术依赖于激光光与红细胞之间的多普勒相互作用，以反映感兴趣区域（ROI）内像素水平的灌注情况16虽然该技术具有定量、无创且适用于重复测量的优点，但它无法提供后肢血管系统的精细解剖细节16其他成像方式，如显微计算机断层扫描（micro-CT）、磁共振血管造影（MRA）和X射线显微血管造影，或因成本高昂、需要复杂仪器，或在技术上存在较大挑战162008年，Li 等人描述了一种使用亲脂性羰花青染料DiI对视网膜内血管进行标记的技术17DiI 可进入内皮细胞，并通过直接扩散染色血管膜结构，如血管生成芽和伪足样结构17,18由于染料可直接递送至内皮细胞且具有强荧光特性，该方法可实现血管的强烈且持久的标记。2012年，Boden等将DiI灌注技术应用于小鼠后肢缺血模型。 通过 股动脉结扎后收获的大腿内收肌全组织成像19.
目前的方法为评估后肢缺血以及基因或细胞治疗所引发的新生血管形成提供了一种相对经济且技术上可行的手段。在进一步的改进中，本方案描述了在小鼠后肢坏疽模型中应用DiI灌注以高分辨率和三维方式成像足垫血管系统的方法。

<table><tbody><tr><td>小型长尾夹</td><td>办公用品商店</td><td></td><td></td></tr><tr><td>布托啡诺（缓释型）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>蝶形针（25 G，带鲁尔锁）</td><td>VWR</td><td>10148-584</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦激光扫描显微镜</td><td>Leica</td><td>TCS SP5</td><td></td></tr><tr><td>DiI（1,1'-二十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐）</td><td>Invitrogen</td><td>D282</td><td></td></tr><tr><td>电灼设备</td><td>Gemini Cautery System</td><td>5917</td><td></td></tr><tr><td>乙醇（100%）</td><td>VWR</td><td>89370-084</td><td></td></tr><tr><td>Fiji（ImageJ）软件</td><td>NIH</td><td></td><td>使用版本 2.1.0。可免费下载，无需许可证。</td></tr><tr><td>泡沫活检垫</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-038-221</td><td></td></tr><tr><td>福尔马林（中性缓冲，10%）</td><td>VWR</td><td>89370-094</td><td></td></tr><tr><td>FVB 小鼠</td><td>Jackson Laboratory</td><td>001800</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>HCl（1 M）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>13-1700</td><td></td></tr><tr><td>Imaris 软件</td><td>Oxford Instruments</td><td></td><td>使用版本 9.6.0。</td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Pivetal</td><td>NDC 46066-755-04</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>氯胺酮</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-NAME（N&amp;omega;-硝基-L-精氨酸甲酯盐酸盐）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N5751</td><td></td></tr><tr><td>激光多普勒血流成像仪</td><td>MoorLDI</td><td>moorLDI2-HIR</td><td>使用 moorLDI V5 软件。</td></tr><tr><td>显微镜载玻片（25 × 75 × 1 mm）</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8282</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8263</td><td></td></tr><tr><td>针头（27 G）</td><td>BD</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>聚维酮碘棉签（10%）</td><td>Medline</td><td>MDS093901ZZ</td><td></td></tr><tr><td>外科手术器械</td><td>Roboz Surgical</td><td></td><td>推荐使用精细镊子、持针器、弹簧剪和止血钳。</td></tr><tr><td>缝线（5-0 可吸收）</td><td>DemeTECH</td><td>G275017B0P</td><td></td></tr><tr><td>注射器（10 mL）</td><td>BD</td><td>305482</td><td></td></tr><tr><td>三通阀</td><td>Cole-Parmer</td><td>19406-49</td><td></td></tr><tr><td>血管分析插件</td><td></td><td></td><td>可免费下载，无需许可证。参见参考文献：Elfarnawany（2015）。</td></tr><tr><td>赛拉嗪</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠后肢坏疽模型中足垫血管系统的高分辨率三维成像

High-Resolution Three-Dimensional Imaging of the Footpad Vasculature in a Murine Hindlimb Gangrene Model

外周动脉疾病（PAD）是由于长期暴露于动脉粥样硬化危险因素而导致的重要致病原因。患有其最严重形式——慢性肢体威胁性缺血（CLTI）的患者，日常生活能力受到显著影响，包括慢性疼痛、无痛行走距离受限以及难以愈合的伤口。目前已在多种动物中建立了用于研究PAD的临床前模型，但小鼠后肢缺血模型仍是应用最广泛的。这些模型对缺血性损伤的反应可能存在显著差异，具体取决于小鼠品系、动脉阻断部位、数量及方法。本方案描述了一种独特的方法，通过结合股动脉和股静脉电凝术与一氧化氮合酶（NOS）抑制剂给药，可在Friend病毒B（FVB）小鼠中稳定诱导足垫坏疽，其组织缺失情况与CLTI相似。尽管仍推荐使用激光多普勒灌注成像（LDPI）等传统方法评估再灌注情况，但本方法采用经心内灌注脂溶性染料1,1'-二辛基-3,3,3',3'-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐（DiI）标记血管系统。随后通过整体组织共聚焦激光扫描显微镜成像，可实现足垫血管网络的高分辨率三维（3D）重建，从而补充传统后肢缺血模型中再灌注评估手段。

本方案详细描述了一种在易感FVB小鼠足垫中通过股动脉和股静脉凝固联合给予一氧化氮合酶抑制剂L-NAME，诱导缺血和组织丢失的可靠方法。图1展示了小鼠后肢血管系统的解剖结构，并标出了股动脉和股静脉凝固的位置（黄色X），即位于股外侧旋动脉（LCFA）近端以及隐腘交界处近端。手术中需明确识别股外侧旋动脉，并以该结构为参照，确保所有手术操作中凝固位置的一致性。如文中所述，在手术前2小时以及术后第1至第3天，小鼠还需腹腔注射40 mg/kg的L-NAME，以维持组织内高水平的氧化应激。图2显示了术后一周该模型可能出现的组织丢失程度差异，每张图像右下角记录了Faber评分9。
在股动脉和静脉凝固诱导缺血后5天和20天，对FVB小鼠进行DiI灌注，以评估后肢再灌注情况。 图3A 展示小鼠解剖后暴露胸腔的解剖结构。将蝴蝶针插入左心室以开始心脏灌注。注意左心室颜色较右心室略显...

本方案描述了一种独特且具有临床相关性的外周动脉疾病模型，该模型通过结合股动脉和股静脉电凝以及给予一氧化氮合酶抑制剂，在FVB小鼠中诱导后肢坏疽。随后采用心脏内灌注DiI的方法，对足垫血管系统进行高分辨率的三维成像。

外周动脉疾病（PAD）是由于长期暴露于动脉粥样硬化危险因素而导致的重要致病原因。患有……的患者……

本方案介绍了如何通过给予大剂量抑制剂并结合股动脉凝固的方法建立小鼠足垫坏疽模型。随后通过DiI灌注，可实现对足垫血管系统的高分辨率成像。该模型具有临床相关性，可用于临床前药物测试以及肢体缺血的研究。高分辨率可视化血管系统为评估新生血管形成提供了一种技术上简便的方法。该足垫坏疽模型在外周动脉疾病和严重肢体缺血的临床前研究中具有重要应用价值。DiI灌注是研究动物模型中新生血管形成的有用工具。演示该操作的将是外科住院医师Antoine Ribieras以及我实验室的研究助理Yulexi Ortiz。首先，在使用前立即取200微升DiI储备液加入10毫升工作稀释液中，配制DiI工作液。用手摇晃充分混匀。将两到三个三通旋塞阀与一个25号蝶形针头串联连接。准备10毫升注射器，分别装入4毫升磷酸盐缓冲液（PBS）、10毫升DiI溶液和10毫升10%中性缓冲甲醛溶液。将装有甲醛的注射器连接至近端进液口，注入溶液以排空管路中的空气。然后旋转活塞以关闭端口。重复相同操作，将含有DiI的注射器和PBS分别连接至中间和远端进液口。安乐死后，将动物仰卧置于吸水垫上，并用针固定腋窝和下肢。使用剪刀做横向切口以打开腹腔，随后暴露并切开左右膈肌以进入胸腔。从下部肋骨至第一或第二肋骨处，沿胸骨两侧剪开胸壁。用止血钳夹住胸骨下端，并将其向上翻向动物头部以暴露胸腔。辨认左心室，其颜色比右心室更浅。用钝头镊子轻轻夹住心脏，将蝴蝶针插入左心室。使用剪刀或18号针头穿刺右心房，使血液和灌注液能够回流至心脏并排出。打开PBS注射器的端口，以每分钟1至2毫升的速度手动注入2至4毫升PBS，持续1至2分钟，以冲洗血管系统中的血液。通过观察右心房是否出血来确认灌注成功。注射完成后，关闭PBS注射器的端口。打开装有DiI的注射器端口，以每分钟1至2毫升的速度在5分钟内注入5至10毫升。注射后，关闭DiI注射器的端口，静置2分钟，使染料充分掺入，然后再注入固定剂。打开装有甲醛的注射器端口，以每分钟1至2毫升的速度在5分钟内注入5至10毫升。注射后，将针头从左心室取出。使用粗剪刀在踝关节处离断胫骨，完全将左脚和右脚与小腿分离。将采集的足部组织放入12孔板中，每孔加入一到二毫升10%福尔马林溶液。用锡箔纸包裹培养板，并在4°C下过夜保存。次日，将12孔板中的固定液更换为每孔1至2毫升的PBS。使用手术刀在足底面和背侧做纵向切口。然后使用齿状镊子和小型止血钳，小心地将足部及脚趾上的所有皮肤去除，注意不要损伤下方的软组织。为了固定组织，将每只足部单独置于两片玻璃载玻片之间，并在两端各放置一片对折的泡沫活检垫。在每一端使用两个小型文件夹夹子将玻璃载玻片夹紧。或者，将足垫放回12孔板中，加入一到两毫升PBS。用锡箔纸包裹后，于4摄氏度保存，可维持荧光长达一个月。打开成像系统，启动采集软件，使用低倍率或低数值孔径的物镜采集图像。单击激活阶段对话框中的“是”。在配置选项卡中激活561纳米激光器。在主屏幕上，通过单击可见光按钮来激活可见光路。通过点击相应的活动复选框，将检测器设置为 570 至 600 纳米的范围。在采集选项卡中选择拼图扫描图标，并设置所需的分辨率。将夹在玻璃载玻片之间的干燥贴附组织样本置于显微镜载物台上，并将组织调至焦点。导航至样本的一个角落。在图块扫描菜单下，点击“标记位置”按钮。然后导航至对角的另一个角落，再次点击“标记位置”按钮，以设定扫描边界。要设置Z轴扫描的深度，请点击实时按钮。将视野移至样本中心，使用Z轴旋钮向下滚动至样本底部。在采集选项卡的Z轴扫描菜单下，点击“开始”按钮。滚动至样品顶部，然后点击末端按钮。点击 z 步长大小并设置为所需数值，然后点击开始以启动图像采集。该图展示了术后一周该模型中可预期的组织缺损变化情况，每张图像右下角标注了FABER评分。重建显微图像显示，与术后第五天结扎后肢足垫的严重灌注减少相比，未结扎对照组足垫具有正常的血管解剖结构。术后20天，足垫灌注显著改善，但仍未达到未结扎对照组的水平。视频显示，随后使用动画功能创建了表面渲染。将灌注装置中的所有气泡排出。如果肺在灌注过程中膨胀并变为粉红色，则说明针头已刺入右心室，应稍作回撤。肢体组织可用于免疫染色，以评估肌肉坏死、组织再生、血管密度以及祖细胞和其他组织修复细胞的募集情况。在该小鼠坏疽模型中，DiI灌注技术已被应用于基因和细胞治疗的相关研究。该研究旨在改善重症肢体缺血患者肢体的灌注情况。

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