Name: 猪外周血血液生长内皮细胞（BOEC）的表征 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: 了解从猪外周血分离培养血液生长内皮细胞（BOEC）的完整实验流程。该方法通过密度梯度离心和纤维连接蛋白包被培养，可获得高增殖能力的内皮细胞，适用于组织工程、细胞治疗及疾病模型研究。

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作者希望感谢美国国立卫生研究院/国家心肺血液研究所（NIH/NHLBI）R00 HL129068 项目提供的资金支持。

所有动物实验均获得威斯康星医学院和梅奥诊所各自的机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。
注意：本研究使用约克夏/长白/杜洛克杂交家猪（Sus domesticus），雌雄均有，体重40-80 kg，年龄3-6个月。
1. 收集猪外周血
<ol>
	<li>准备材料。
	<ol>
		<li>将肝素溶液用无菌生理盐水稀释至 100 U/mL。</li>
		<li>向两个 50 mL 锥形管和两个 60 mL 注射器中各加入 3–4 mL 肝素溶液。</li>
		<li>将未稀释的肝素溶液（1,000 U/mL）抽入一段延长管中。</li>
		<li>将 19 G 针头连接至装有肝素的延长管一端，另一端连接含肝素的 60 mL 注射器。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>根据机构规定对猪进行麻醉。
	<ol>
		<li>通过肌内注射给予阿托品（0.05 mg/kg）、替来他明/唑拉西泮（2–5 mg/kg）和赛拉嗪（2 mg/kg）以诱导麻醉。 
		注意：当动物失去意识且下颌肌肉松弛时，表明已达到充分麻醉状态。</li>
		<li>将动物仰卧位放置，并在两侧放置卷起的毛巾以提供稳定性。</li>
		<li>在眼睛上涂抹眼用软膏，防止麻醉期间角膜干燥。</li>
		<li>在麻醉期间提供保温支持，包括毛毯、加热垫和/或加热手术台。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用聚维酮碘擦洗液清洁股部腹股沟区域。</li>
	<li>用 19 G 针头穿刺股静脉或股动脉，缓慢（约 1–2 mL/s）将 50 mL 血液抽入注射器中。 
	注意：抽吸过快可能损伤细胞。</li>
	<li>保持针头位置不变，立即夹闭延长管并断开 60 mL 注射器。</li>
	<li>缓慢将血液转移至含肝素的 50 mL 锥形管中。</li>
	<li> tightly 盖紧 50 mL 锥形管盖子，轻轻倒置数次以混匀，并置于冰上。</li>
	<li>将另一个含肝素的 60 mL 注射器连接至延长管，松开夹闭的延长管，缓慢再抽取 50 mL 血液至注射器中。</li>
	<li>立即从动脉或静脉中拔出针头，并缓慢将延长管中剩余的血液抽入注射器。</li>
	<li>断开 60 mL 注射器与延长管的连接，缓慢将血液转移至另一个含肝素的 50 mL 锥形管中。</li>
	<li> tightly 盖紧 50 mL 锥形管盖子，轻轻倒置数次以混匀，并置于冰上。</li>
	<li>对猪的股部腹股沟区域施加压迫止血。</li>
	<li>根据机构规定使猪恢复。持续监测动物，直至其恢复足够的意识以维持胸卧位，并能返回常规饲养/犬舍区域。</li>
</ol>
2. 单个核细胞的分离
<ol>
	<li>在四个50 mL离心管中，将血液与磷酸盐缓冲液（PBS）按1:1比例稀释。 
	注意：该操作需在细胞培养罩内使用无菌技术进行，以避免细胞培养物受到污染。</li>
	<li>向八个50 mL离心管中各加入25 mL室温即用型密度梯度溶液。</li>
	<li>将含有密度梯度溶液的50 mL离心管倾斜成锐角，用移液器沿管壁极缓慢地加入25 mL血液/盐水混合液。 
	注意：血液溶液应轻柔地叠加在密度梯度溶液上方，并保持清晰的界面。</li>
	<li>将离心管在560 × g 条件下室温（RT）离心30分钟。 
	注意：为获得最佳分离效果，如有可能，请关闭离心机刹车功能。</li>
	<li>使用细口移液器小心收集每根离心管中的白膜层（位于密度梯度溶液上方、透明血浆层下方的浑浊单个核细胞层），并均匀转移至两个新的50 mL离心管中。弃去含有密度梯度溶液的离心管。 
	&#8203;注意：应尽可能多地收集白膜层，同时尽量减少密度梯度溶液和血浆的混入。</li>
</ol>
3. 细胞的洗涤与铺板
<ol>
	<li>用纤连蛋白包被6孔板。
	<ol>
		<li>将人血浆纤连蛋白用无菌水稀释至1 mg/mL，配制储备液。将分装的储备液储存于-20 °C。</li>
		<li>取600 µL纤连蛋白储备液加入3 mL PBS中，配制3.6 mL工作液。</li>
		<li>将600 µL纤连蛋白工作液加入6孔板的每个孔中，轻轻摇动，直至均匀包被。</li>
		<li>静置30分钟，使纤连蛋白充分包被孔壁，然后轻轻吸去每孔中的溶液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在等待纤连蛋白包被期间，洗涤单个核细胞
	<ol>
		<li>向各离心管中加入PBS至总体积达45 mL</li>
		<li>在4 °C条件下，以560 x g离心5分钟，刹车设置为低档。吸去两管中的上清液。</li>
		<li>将每管的细胞沉淀用25 mL PBS重悬。</li>
		<li>重复上述步骤，进行第二次洗涤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将每管细胞沉淀用5 mL PBS重悬，并向每管中加入15 mL 0.8%氯化铵溶液。 
	注：此步骤用于裂解残留的红细胞。</li>
	<li>冰上孵育10分钟。</li>
	<li>同前法洗涤细胞：向各管中补加PBS，然后在4 °C条件下以560 x g离心5分钟，刹车设置为低档。吸去两管中的上清液。</li>
	<li>将每管的细胞沉淀用25 mL PBS重悬，并重复洗涤一次。</li>
	<li>将每管的细胞沉淀用6 mL EGM-2培养基重悬，该培养基需添加10%胎牛血清（FBS）和1×抗生素/抗真菌溶液（含10,000 U/mL青霉素、10 mg/mL链霉素和25 µg/mL两性霉素B）。 
	注：EGM-2培养基由EBM-2基础培养基配制而成，每500 mL中加入200 µL氢化可的松、2 mL人成纤维细胞生长因子（hFGF-B）、500 µL血管内皮生长因子（VEGF）、500 µL胰岛素样生长因子的重组类似物（R3 IGF-1）、500 µL抗坏血酸、500 µL人表皮生长因子（hEGF）、500 µL庆大霉素/两性霉素以及500 µL肝素。</li>
	<li>将2 mL细胞悬液轻柔地加入纤连蛋白包被的6孔板的每个孔中，轻轻摇动，直至均匀铺布。 
	&#8203;注：目的是尽可能多地接种细胞，以最大化形成的内皮细胞克隆数量。</li>
</ol>
4. 细胞培养
<ol>
	<li>将细胞置于 37 °C、5% CO2 和 100% 湿度条件下培养。</li>
	<li>次日，向每孔中轻柔加入 1 mL 新鲜培养基。 
	注意：操作时应轻柔，避免扰动松散贴附于纤连蛋白包被表面的细胞。</li>
	<li>再过一天，通过轻柔吸出每孔中的 1.5 mL 培养基，并替换为 1.5 mL 新鲜培养基，进行半量换液。</li>
	<li>在接下来的连续 5 天中，每天对每孔进行一次完全换液（每孔加入 2 mL 新鲜培养基）。</li>
	<li>此后，每周进行三次轻柔换液。</li>
	<li>定期在低倍（4×物镜）光学显微镜下观察细胞培养情况。 
	注意：贴壁的血液来源内皮祖细胞（BOEC）克隆通常在接种后 7–10 天开始出现在孔中。非贴壁细胞类型会随换液被去除，其他贴壁细胞类型也会随着 BOEC 克隆的生长而逐渐消失。</li>
	<li>当 BOEC 细胞融合度达到约 70%–80% 时，将其传代至经纤连蛋白包被的 T-75 培养瓶中，并继续维持每周换液三次。 
	注意：可通过将克隆传代至 T25 培养瓶来控制接种密度。后续传代无需再使用纤连蛋白包被，且培养基更换频率可减少至每周两次。</li>
	<li>第 1 至第 3 代的细胞可用于实验，或转移至冻存液中，保存于液氮中以备将来使用。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

BOECs 是一种强大的工具，可用于多种科学研究和治疗策略7,8,16。BOECs 已被用于分析内皮细胞（EC）基因表达，以阐明导致血管疾病和癌症发生的关键因素5,19,20,21。BOECs 还已被应用于血管再生和基因递送等治疗领域22,23,24。经基因修饰的 BOECs 已被证实具有抗血管生成的肿瘤治疗能力25,<sup class="xr...

内皮是一类高度复杂且动态的结构，是血管壁的重要组成部分。它衬在血管内表面，为循环血液与周围组织之间提供一个物理界面。这种异质性结构具有多种功能，包括血管生成、炎症反应、血管调节以及止血功能1,2,3,4。人脐静脉内皮细胞是研究内皮细胞功能的常用细胞类型。然而，由于存在患者特异性的批次差异、表型不一致以及较低的传代效率，提示有必要寻找一种能够改善上述所有特性的细胞来源5。
获得均一的原代内皮细胞群体在技术上具有挑战性，且原代内皮细胞的增殖能力较低6。&#160;因此，为了研究血管再生并评估病理生理过程，多个研究团队已尝试获取和评估来源于外周血的不同类型内皮细胞，例如内皮祖细胞（EPCs）或血液来源的内皮细胞（BOECs）6,7,8,9。纺锤形的早期EPCs来源于造血干细胞（HSCs），其生长潜能有限，生成成熟内皮细胞的血管生成能力也有限。此外，它们在表型上与炎症性单核细胞非常相似。同时，它们进一步分化为功能性、可增殖的成熟内皮细胞的能力仍存在争议6,7,9,10。&#160;对外周血单个核细胞（PBMCs）进行持续培养，可产生一类继发性细胞群体，称为晚期迁出EPCs、BOECs或内皮集落形成细胞（ECFCs）6,7,9,10。Medina等人于2018年指出，EPCs存在诸多局限性，其命名尚不明确，且目前被统称为EPCs的多种不同细胞类型之间缺乏一致性11。相比之下，BOECs因其在血管修复、健康与疾病以及细胞治疗中的作用而逐渐被认可。对这些细胞的进一步研究和治疗应用，将依赖于能够稳定地从循环祖细胞中分离出此类细胞的标准化实验方案。
内皮祖细胞（BOECs）等原代细胞可作为替代来源，用于获取高增殖能力的成熟内皮细胞6。BOECs在表型上不同于早期内皮祖细胞（EPCs），具有典型的内皮细胞特征，如铺路石样形态以及黏附连接和小凹的表达12。Hebbel 等人13,14,15通过基因表达谱分析发现，BOECs或内皮集落形成细胞（ECFCs）才是真正意义上的内皮细胞，因其能够促进微血管和大血管的形成。因此，BOECs可作为研究病理生理过程和遗传变异的工具16。它们也被认为是血管再生细胞治疗的理想细胞来源17。因此，建立一种标准化的方案以稳定地分离这些高增殖性细胞至关重要。
尽管BOECs为研究人类病理生理学和遗传变异提供了有力工具，但使用更均一的BOEC来源可能获得更稳健且可靠的实验与治疗结果。通过使用来自遗传背景相似、饲养条件一致的动物的异种细胞来源，可实现更高的均一性18。尽管异种细胞来源容易引发宿主免疫反应，但目前已有免疫调节策略正在开发中，旨在生成免疫兼容的动物及其产物，包括细胞。特别是猪，其外周血来源丰富，且由于在解剖结构和生理特征上与人类具有相似性，常被用于研究医疗器械及其他疗法。因此，本研究优化了从猪外周血中分离和扩增高增殖性BOECs的实验方案。下述方案是一种简单且可靠的方法，可从相对少量的血液中获得大量BOECs。这些细胞培养物可通过多次传代扩增，由单份血样生成数百万个细胞。

<table><tbody><tr><td>19 G 针头</td><td>Covidien</td><td>1188818112</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 锥形管</td><td>Corning</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>6 孔板</td><td>BD Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>60 mL 注射器</td><td>Covidien</td><td>8881560125</td><td></td></tr><tr><td>氯化铵溶液（0.8%）</td><td>Stemcell Technologies</td><td>07850</td><td></td></tr><tr><td>抗生素/抗真菌素溶液（100 倍浓度）</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Thermo Scientific</td><td>75-253-839</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2 培养基</td><td>Lonza Walkersville</td><td>CC-3162</td><td></td></tr><tr><td>延长管</td><td>Hanna Pharmaceutical Supply Co.</td><td>03382C6227</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Atlas Biologicals</td><td>F-0500-A</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque 1077</td><td>Cytiva</td><td>17144003</td><td>密度梯度溶液</td></tr><tr><td>肝素钠注射液（1,000 单位/mL）</td><td>Pfizer</td><td>00069-0058-01</td><td></td></tr><tr><td>人血浆纤连蛋白</td><td>Gibco</td><td>33016-015</td><td></td></tr><tr><td>冰</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>移液器套装</td><td>Eppendorf</td><td>2231300004</td><td></td></tr><tr><td>无菌水</td><td>Gibco</td><td>15230-162</td><td></td></tr><tr><td>细移液管</td><td>Celltreat Scientific</td><td>229280</td><td></td></tr></tbody></table>

猪外周血来源的血液出芽内皮细胞（boec）的表征

Characterization of Blood Outgrowth Endothelial Cells (BOEC) from Porcine Peripheral Blood

内皮是一类动态的整合性结构，在血管生成、止血、炎症反应和稳态等多种生理功能中发挥重要作用。内皮还在动脉粥样硬化、高血压和糖尿病等病理生理过程中起关键作用。内皮细胞构成血液和淋巴管的内层衬里，并在结构和功能上表现出异质性。多个研究团队已评估了来源于人外周血的内皮细胞功能，重点关注由造血干细胞衍生的内皮祖细胞或成熟血液来源的内皮细胞（即内皮集落形成细胞）。这些细胞可作为自体治疗和疾病建模的资源。异种细胞由于来源丰富且可通过在相似条件下饲养遗传背景相近的动物获得较高同质性，可能成为治疗用细胞的替代来源。因此，本文提出了一种从猪外周血中有效分离和扩增高增殖性血液来源内皮细胞的稳健方案。这些细胞可用于多种应用，包括心血管组织工程、细胞治疗、疾病建模、药物筛选、内皮细胞生物学研究，以及用于研究异种移植中炎症和凝血反应的体外共培养体系。

从细胞培养开始直至观察到BOEC集落，持续观察了培养细胞的形态（图1）。一小部分贴壁细胞开始附着于培养皿并生长，而非贴壁细胞则通过更换培养基被去除（图1B）。集落最早在第6天出现，表现为一群类似内皮细胞的细胞从中心点向外呈放射状增殖（图1D）。随着培养的进行，细胞集落逐渐变得更加致密，并呈现出类似于成熟内皮细胞的鹅卵石样形态（图1F）。典型的内皮细胞鹅卵石样形态可通过光学显微镜对BOEC进行简便的初步鉴定。
内皮细胞集落通常在培养10至14天后即可进行传代。此时，6孔板通常可获得约100万个细胞，细胞活力百分比为93%–98%。在首次传代过程中，内皮细胞在T75培养瓶中扩增后可获得约600万至1000万个细胞。
为评估BOECs的形态发生过程，将基底膜基质（例如Matrigel）以每孔10 ...

猪外周血来源的血液出芽内皮细胞（BOEC）的表征

内皮是一动态整合结构，在血管生成、止血等多种生理功能中发挥重要作用，……

该方案可获得高增殖活性的血液来源内皮细胞，可用于多种组织工程、细胞治疗及疾病模型研究。此技术能从单次采血中稳定地获得大量细胞。为确保该技术成功，关键在于尽快将细胞接种至培养基并放入培养箱环境中。首先，将肝素溶液用无菌生理盐水稀释至每毫升含100单位。向两个50毫升锥形管和两个60毫升注射器中各加入3至4毫升肝素溶液。然后，将未稀释的每毫升1,000单位肝素溶液抽入延长管中。将一根19号针头连接至肝素填充的延长管的一端，将一个含有肝素的60毫升注射器连接至延长管的另一端。接着，使用聚维酮碘擦洗液清洁麻醉猪的股部腹股沟区域。用19号针头穿刺股静脉或股动脉，并以每秒1至2毫升的速度，缓慢将50毫升血液抽入注射器中。保持针头位置不变，立即弯折延长管并取下60毫升注射器。缓慢将血液转移至含有肝素的50毫升锥形管中。拧紧锥形管盖，轻轻倒置混匀数次，并将其置于冰上。将另一支含有肝素的60毫升注射器连接到延长管上。解开延长管的弯折处，缓慢将额外的50毫升血液抽入注射器中。立即从动脉或静脉中拔出针头，并缓慢将延长管中剩余的血液全部抽入注射器内。将60毫升注射器从延长管上断开，并缓慢将血液转移至另一支含有肝素的50毫升锥形管中。盖紧50毫升锥形管的盖子，轻轻倒置数次以混匀，然后置于冰上。对猪的股部腹股沟区域施加压迫止血。将血液与PBS按1:1比例在四个50毫升锥形管中稀释。向八个50毫升锥形管中各加入25毫升室温即用型密度梯度溶液。将含有密度梯度溶液的50毫升锥形管倾斜成锐角，缓慢吸取25毫升血液盐溶液，加入每个含有密度梯度溶液的50毫升锥形管中。将离心管在室温下以 560 g 离心 30 分钟。用细移液管小心收集每根离心管中的白膜层，即位于密度梯度溶液上方、透明血浆层下方的浑浊单个核细胞层，并将其均匀分配至两个新的 50 毫升锥形管中。弃去含有密度梯度溶液的离心管。为用纤连蛋白包被六孔板，先通过将人血浆纤连蛋白稀释至每毫升含1毫克，制备其储存液。取600微升纤连蛋白储存液加入3毫升磷酸盐缓冲液（PBS）中，配制成3.6毫升的工作液。将600微升纤连蛋白工作液加入六孔板的每个孔中，轻轻摇动，直至液体均匀覆盖孔底。轻柔地将各孔中的溶液吸出。在等待纤连蛋白包被的同时，用PBS将两管补至45毫升以洗涤单个核细胞，于4°C、560 × g离心5分钟，刹车设为低档。吸去两管中的上清液。将每份细胞沉淀重悬于25毫升PBS中。将每份细胞沉淀重悬于5毫升PBS中，并向每管加入15毫升0.8%氯化铵溶液。通过加入PBS按前述方法洗涤细胞。吸去两支试管中的上清液。将每份细胞沉淀重悬于25毫升PBS中。再将每份细胞沉淀重悬于6毫升添加了10% FBS和1×抗生素-抗真菌溶液的EGM-2培养基中。将两毫升细胞悬液轻柔地转移至经纤连蛋白包被的六孔板的每个孔中，并轻轻摇晃，直至均匀覆盖。细胞接种后24小时

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科研

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Bioengineering

生物工程

猪外周血血液生长内皮细胞（BOEC）的表征

内皮集落形成祖细胞（ECFCs）是研究血管稳态与修复的有力工具1,2。本文介绍一种新型无动物血清的方法，利用混合人血小板裂解物（pHPL）从肝素抗凝的成人外周血中分离并扩增ECFC，从而降低抗牛血清免疫反应的风险。...

成人人类内皮集落形成祖细胞的分离与大规模扩增

我们提供一种分离和培养纯化心脏瓣膜内皮细胞（VEC）群体的方法。VEC...

瓣膜内皮细胞的分离

介绍了一种在钛基血液接触性生物材料上接种自体细胞并检测其生物相容性的方法。该方法利用内皮祖细胞和钛管，在将钛管植入猪腔静脉后的数分钟内完成细胞接种。该技术可适用于多种其他可植入式 biomedical...

自体血管内皮祖细胞接种技术及心血管器械在大型动物模型中的生物相容性测试

我们正在描述一种在无菌连续流动回路中对贴壁细胞施加层流剪切应力的方法。通过透明的腔室可观察细胞的黏附和形态，从回路中获取样品用于代谢物分析，并在剪切作用后收集细胞以用于后续实验或培养。...

平行板流动腔室与连续流动回路用于评估内皮祖细胞在层流剪切应力下的反应

内皮集落形成细胞（ECFCs）是一类具有强大克隆增殖潜能的循环内皮细胞，表现出固有的 体内 血管形成能力。对源自脐带血的外向生长型内皮细胞进行表型和功能特征鉴定，对于识别和分离这些细胞至关重要 真正有效的...

人脐带血来源的内皮集落形成细胞的表型与功能特征分析

在本视频中，我们演示了使用一步胶原酶消化法从猪模型的腹主动脉中分离内皮细胞。这些内皮细胞可进行培养，用于后续实验应用。...

猪主动脉内皮细胞（pAEC）分离：一种基于酶消化法从收获的猪腹主动脉中分离内皮细胞的方法

本方案可从少量成人外周血中可靠地生成并鉴定血液来源的内皮细胞（BOECs）。BOECs...

从人外周血中生成与培养血液出芽内皮细胞

造血干细胞和祖细胞（HSPC）在发育过程中来源于特化的（生血性）内皮细胞，但关于部分内皮细胞如何特化为造血细胞的过程仍知之甚少。我们展示了一种基于流式细胞术的方法，可从鼠胚组织中同时分离生血性内皮细胞和HSPC。...

小鼠胚胎造血性内皮细胞的分离

本实验方案的目的是从脐带血中分离内皮祖细胞。这些细胞的一些应用包括将其作为生物标志物用于识别心血管疾病风险患者、治疗缺血性疾病，以及构建组织工程化的血管和心脏瓣膜结构。...

从人脐带血中分离内皮祖细胞

利用三维细胞培养和非抗凝全血评估内皮细胞的抗凝和抗炎特性

本方案描述了从人类多能干细胞和诱导性多能干细胞生成自组织血管的方法。这些血管网络表现出广泛且相互连接的内皮细胞网络，周围分布着周细胞、平滑肌肌动蛋白以及连续的基底膜。...

从多能干细胞生成人血管类器官

了解从猪外周血分离培养血液生长内皮细胞（BOEC）的完整实验流程。该方法通过密度梯度离心和纤维连接蛋白包被培养，可获得高增殖能力的内皮细胞，适用于组织工程、细胞治疗及疾病模型研究。

猪外周血来源的血液出芽内皮细胞（BOEC）的表征

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