利用光控抑制剂在活体小鼠着床前胚胎中对微管细胞骨架进行时空分辨的亚细胞操控

本方案是首个将光敏抑制剂应用于活体小鼠着床前胚胎的研究，并为在其他三维生理系统中使用光控药物提供了参考。可光控的光敏抑制剂能够实现对微管生长在空间和时间上的精确调控，并可被转换回非活性状态。在实验前若意外将光敏抑制剂暴露于蓝光下，可能导致其过早激活。

因此，我们建议在制备样品时始终处于完全黑暗或红光条件下操作。在严格避光的条件下，仅使用红光照明，开始用超纯水配制 PST-1P 的储备液和中间工作液，具体步骤如文稿所述。

然后，用新鲜的KSOM稀释PST-1P，以获得40 M的终浓度。为准备用于活体成像的腔室载玻片，将10 L经PST-1P处理的KSOM加入一个孔的中心，形成半球形液滴。为防止液滴蒸发，用足量的矿物油覆盖液滴。随后，用铝箔 loosely 包裹已准备好的培养皿，或将培养皿放入培养箱中的非密闭不透明容器内，以确保无光照暴露。

将胚胎转移至经 PST-1P 处理的 KSOM 液滴后，确保胚胎聚集在液滴中央，并沉降到培养皿底部。待浸没式物镜准备就绪后，将腔室载玻片置于显微镜内的环境培养箱中。设定温度为 37 °C、CO₂ 浓度为 5%，并在完全黑暗条件下进行，以确保所有 PST-1P 均处于非活性的反式构型，同时保证胚胎能够沉降至培养皿底部。

使用红光手电筒将物镜定位到与浸没介质接触的位置。然后，找到介质液滴的边缘，并将物镜直接置于其上方。采用实时扫描模式和561 nm激光，在液滴中定位胚胎。

使用载物台控制器和实时扫描模式，为获取整个胚胎的z轴层扫图像设置起始点和终止点。根据信号情况，将激光功率调节至最高5%，并将数字偏移量根据信号调节至最高0.900，以优化EB3-dTomato彗星状信号的显示效果。

尽量减少背景噪声。将针孔设置为 2 m。像素分辨率为 512 × 512。

像素驻留时间为 3.15 s，将放大倍数设置为 2 倍。以 1 µm 的切片间隔获取整个胚胎的 z 轴层扫图像，以评估整个生物体中微管生长的区域。

对于 EB3-dTomato 亮斑追踪实验，打开 3D z 轴层叠图像，将放大倍数增加至三倍，然后在特定的亚细胞区域周围绘制一个矩形感兴趣区域（ROI）。接着，使用设定的参数获取单个 z 平面的时间序列图像，时间间隔为 500 ms。

为了激活 PST-1P，切换至 405 nm 激光，并以 10% 激光功率、针孔全开、像素分辨率为 512 × 512、像素驻留时间为 3.15 µs、放大倍数为 3 倍、时间间隔为 500 ms 的条件采集另一组时间序列图像，共采集 20 帧。激活后立即切换回 561 nm 激光，并按照之前所述条件重复采集，以确认 PST-1P 激活后 EB3-dTomato 斑点的消失。接下来，为了将 PST-1P 逆转回其非活性的反式状态，启用 514 nm 激光，并使用设定参数采集另一组时间序列图像。

为了观察 EB3-dTomato 斑点的恢复情况，切换回 561 nm 激光，并重复采集图像。在未经处理的对照胚胎中，照射 405 nm 激光前，EB3-dTomato 信号在整个细胞质中均较强，但细胞核区域除外。照射后，未检测到信号变化。

这表明405 nm激光未对胚胎或微管动力学造成光损伤。在严格避光条件下对16细胞期胚胎进行PST-1P处理时，三维图像中检测到强烈的EB3-dTomato表达，说明在避光条件下失活的PST-1P不会抑制微管聚合。在PST-1P激活前，单个z平面的时间序列成像证实了强烈的EB3-dTomato表达以及亚细胞区域内的微管聚合。

在405 nm光激活后数秒内，可检测到EB3-dTomato彗星信号的减弱。当使用514 nm激光关闭PST-1P时，信号得以恢复。显微注射了EB3-dTomato并孵育PST-1P的胚胎表现出正常的胚胎发育潜能，能够发育至囊胚阶段。

以及有丝分裂期间正常的微管动态，表明活性PST-1P对胚胎无毒性。在获取的时间序列成像视频中，EB3-dTomato标记呈现为彗星状结构，可实现对生长中微管纤维的追踪。

在经 PST-1P 处理并置于黑暗条件下的胚胎中，EB3-dTomato 斑点从间期桥发出，该结构在小鼠早期胚胎中充当非中心体微管组织中心。t-stack 显示了间期桥区域的 EB3-dTomato 斑点。在 PST-1P 激活后，间期桥基部及 t-stack 中的 EB3-dTomato 斑点减少。

请注意，白光可能过早激活 PST-1P，因此仅可使用红光光源进行照明。绿光也会使 PST-1P 失活，请避免使用绿色荧光标记物。

该技术已应用于果蝇、变形虫、小鼠以及多种体外系统，以靶向微管生长，从而研究细胞迁移和组织形成。