可视化 果蝇 胚胎中含脂质细胞器的细胞骨架依赖性运输

在早期的 果蝇 胚胎中，许多细胞器是运动的。原则上，它们 可以通过特定的荧光 探针进行现场成像，但蛋壳会阻止直接应用于胚胎。该协议描述了如何 通过 显微注射引入这种探针，然后 通过 粒子图像测速分析本体细胞器运动。

在早期的果蝇胚胎中，许多细胞器经历大规模的运动。我们的实验方案描述了如何使用为细胞培养开发的荧光染料来监测这种运动。与荧光蛋白相比，市售荧光探针更亮，光谱范围更广。

它们允许多重协同标记，并且可以在任何遗传背景中使用。需要练习和反复试验才能知道胚胎干燥多长时间，以便它们在注射过程中破裂或干涸并停止发育。首先，通过将毛细管放在拉针器上的毛细管支架中并使用翼形螺母固定它来开始准备注射针。

将毛细管中心与加热元件对齐。根据制造商的说明，在拔针器上选择适当的设置。使用解剖显微镜进行质量控制测试。

将针头水平按压到腻子中，针尖悬挂在空中。用盖子盖住针头，储存直至使用。使用连接到微量移液管的针头，将一微升注射溶液吸入吸头而不会捕获气泡。

戴上手套，用一只手握住针头，将针尖指向远处，然后将装载针头插入其中。将液体分配到针尖附近，取出移液器并垂直握住针头，直到液体流到针尖。用铝箔覆盖容器，而不会损坏针尖，以防止染料漂白。

使用转印移液器或微量移液器，在矩形盖玻片的中心放置一小滴庚烷胶，并使其蒸发。为了机械地去除脉络膜，用一层薄薄的卤代碳油27覆盖适当老化的胚胎板，使蛋壳透明。在具有反式照明的解剖显微镜下观察板，以确认胚胎阶段并选择处于裂解阶段的胚胎。

使用细镊子，通过抓住背侧附属物并将其转移到用双面胶带覆盖的准备好的载玻片上，拾取所需阶段的胚胎。将胚胎放在胶带上，并尽量减少油的转移。通过用镊子尖端的侧面轻推胚胎，轻轻地将胚胎滚动到胶带表面，而不直接戳它。

继续滚动胚胎，直到脉络膜粘附在胶带上并开裂。在绒毛膜破裂后，继续滚动胚胎以将其与绒毛膜分离，绒毛膜仍然粘在胶带上。将胚胎滚回脉络膜上，其粘性比胶带少。

用镊子轻轻摩擦胚胎，直到它附着在镊子上进行移植。然后，将胚胎转移到盖玻片上，并使其与胶水接触以将胚胎固定到位，将其与镊子分开。在盖玻片上调整胚胎的方向。

通过将带有胚胎的盖玻片放入干燥室并密封，让胚胎干燥5至12分钟。从腔室中取下盖玻片，滴下卤烃油700，覆盖胚胎以防止进一步干燥。在解剖范围内检查它们，如果胚胎干燥得当，则继续进行显微注射。

将4X物镜放入光路中，并使用显微镜上的焦点旋钮，将胚胎调整到焦点中。使用载物台控制将胚胎水平移动到视野的中心。将胚胎保持在视野的边缘，然后平移，准备降低针头。

保持相同的焦平面，降低针尖，并确保它与胚胎一起在视野中可见。通过将一些注射溶液分配到卤烃油700中来检查针头是否正常工作。如果成功，针尖附近的油中将出现溶液气泡。

使用分阶段对照，将胚胎向针尖移动，直到尖端轻轻刺穿胚胎并进入其中。同时，开始注射溶液的流动，直到针尖部位出现瞬时的透明斑点，表明溶液成功转移到胚胎中。使用载玻片支架将盖玻片固定在共聚焦显微镜上。

请小心，因为盖玻片很脆弱。使用共聚焦显微镜上的落射荧光功能用40X物镜检查胚胎，并确保胚胎中的氟4在继续之前可见。对于实时成像，在合体阶段，将图像大小设置为 512 x 512 像素，线平均值为 3，帧速率设置为每秒 0.1 帧。

注射BODIPY 493 503染料后，将其定位在针尖插入的部位，然后在注射部位附近扩散。24分钟后，染料扩散到胚胎的中点。通过向胚胎注射BODIPY 493 503和LysoTracker Red来监测细胞器运动。

粒子图像测速分析显示，胚胎内容物收敛于胚胎的中心区域，细胞质流入胚胎内部。使用ER-Tracker Green对ER进行标记，可提供核包膜的生动分辨率，从而实现主要细胞周期阶段的可视化。在胚芽阶段向胚胎注射MitoView 633，并在四小时后成像。

该图像显示了胚带延伸的胚胎的神经外胚层细胞。向细胞化胚胎注射BODIPY 493 503和SiR微管蛋白的混合物，其显示脂质液滴沿微管双向移动。胚胎必须部分干燥，以便可以注入液体。

过少的干燥会导致胚胎在注射时泄漏，过多的干燥会杀死胚胎。移动细胞器的视频可以通过各种图像分析技术进行表征。颗粒跟踪揭示了单个细胞器的行为，颗粒成像测速揭示了体积流动。