可视化 果蝇 胚胎中含脂质细胞器的细胞骨架依赖性运输
December 13th, 2021
在早期的 果蝇 胚胎中，许多细胞器是运动的。原则上，它们 可以通过特定的荧光 探针进行现场成像，但蛋壳会阻止直接应用于胚胎。该协议描述了如何 通过 显微注射引入这种探针，然后 通过 粒子图像测速分析本体细胞器运动。
在早期的果蝇胚胎中，许多细胞器经历大规模的运动。我们的实验方案描述了如何使用为细胞培养开发的荧光染料来监测这种运动。与荧光蛋白相比，市售荧光探针更亮，光谱范围更广。
它们允许多重协同标记，并且可以在任何遗传背景中使用。需要练习和反复试验才能知道胚胎干燥多长时间，以便它们在注射过程中破裂或干涸并停止发育。首先，通过将毛细管放在拉针器上的毛细管支架中并使用翼形螺母固定它来开始准备注射针。
将毛细管中心与加热元件对齐。根据制造商的说明，在拔针器上选择适当的设置。使用解剖显微镜进行质量控制测试。
将针头水平按压到腻子中，针尖悬挂在空中。用盖子盖住针头，储存直至使用。使用连接到微量移液管的针头，将一微升注射溶液吸入吸头而不会捕获气泡。
戴上手套，用一只手握住针头，将针尖指向远处，然后将装载针头插入其中。将液体分配到针尖附近，取出移液器并垂直握住针头，直到液体流到针尖。用铝箔覆盖容器，而不会损坏针尖，以防止染料漂白。
使用转印移液器或微量移液器，在矩形盖玻片的中心放置一小滴庚烷胶，并使其蒸发。为了机械地去除脉络膜，用一层薄薄的卤代碳油27覆盖适当老化的胚胎板，使蛋壳透明。在具有反式照明的解剖显微镜下观察板，以确认胚胎阶段并选择处于裂解阶段的胚胎。
使用细镊子，通过抓住背侧附属物并将其转移到用双面胶带覆盖的准备好的载玻片上，拾取所需阶段的胚胎。将胚胎放在胶带上，并尽量减少油的转移。通过用镊子尖端的侧面轻推胚胎，轻轻地将胚胎滚动到胶带表面，而不直接戳它。
继续滚动胚胎，直到脉络膜粘附在胶带上并开裂。在绒毛膜破裂后，继续滚动胚胎以将其与绒毛膜分离，绒毛膜仍然粘在胶带上。将胚胎滚回脉络膜上，其粘性比胶带少。
用镊子轻轻摩擦胚胎，直到它附着在镊子上进行移植。然后，将胚胎转移到盖玻片上，并使其与胶水接触以将胚胎固定到位，将其与镊子分开。在盖玻片上调整胚胎的方向。
通过将带有胚胎的盖玻片放入干燥室并密封，让胚胎干燥5至12分钟。从腔室中取下盖玻片，滴下卤烃油700，覆盖胚胎以防止进一步干燥。在解剖范围内检查它们，如果胚胎干燥得当，则继续进行显微注射。
将4X物镜放入光路中，并使用显微镜上的焦点旋钮，将胚胎调整到焦点中。使用载物台控制将胚胎水平移动到视野的中心。将胚胎保持在视野的边缘，然后平移，准备降低针头。
保持相同的焦平面，降低针尖，并确保它与胚胎一起在视野中可见。通过将一些注射溶液分配到卤烃油700中来检查针头是否正常工作。如果成功，针尖附近的油中将出现溶液气泡。
使用分阶段对照，将胚胎向针尖移动，直到尖端轻轻刺穿胚胎并进入其中。同时，开始注射溶液的流动，直到针尖部位出现瞬时的透明斑点，表明溶液成功转移到胚胎中。使用载玻片支架将盖玻片固定在共聚焦显微镜上。
请小心，因为盖玻片很脆弱。使用共聚焦显微镜上的落射荧光功能用40X物镜检查胚胎，并确保胚胎中的氟4在继续之前可见。对于实时成像，在合体阶段，将图像大小设置为 512 x 512 像素，线平均值为 3，帧速率设置为每秒 0.1 帧。
注射BODIPY 493 503染料后，将其定位在针尖插入的部位，然后在注射部位附近扩散。24分钟后，染料扩散到胚胎的中点。通过向胚胎注射BODIPY 493 503和LysoTracker Red来监测细胞器运动。
粒子图像测速分析显示，胚胎内容物收敛于胚胎的中心区域，细胞质流入胚胎内部。使用ER-Tracker Green对ER进行标记，可提供核包膜的生动分辨率，从而实现主要细胞周期阶段的可视化。在胚芽阶段向胚胎注射MitoView 633，并在四小时后成像。
该图像显示了胚带延伸的胚胎的神经外胚层细胞。向细胞化胚胎注射BODIPY 493 503和SiR微管蛋白的混合物，其显示脂质液滴沿微管双向移动。胚胎必须部分干燥，以便可以注入液体。
过少的干燥会导致胚胎在注射时泄漏，过多的干燥会杀死胚胎。移动细胞器的视频可以通过各种图像分析技术进行表征。颗粒跟踪揭示了单个细胞器的行为，颗粒成像测速揭示了体积流动。
概述
本协议概述了一种使用荧光探针监测果蝇早期胚胎中细胞器运动的方法。通过微注射引入这些探针，研究人员可以分析活体胚胎中细胞器的动态。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 发育生物学
背景
- 早期果蝇胚胎中的许多细胞器表现出显著的运动性。
- 荧光探针为成像提供了比荧光蛋白更明亮的替代方案。
- 由于胚胎的保护性卵壳，微注射技术是必要的。
- 胚胎的适当脱水对于成功的微注射至关重要。
研究目的
- 开发一种可靠的方法将荧光探针引入果蝇胚胎中。
- 使用粒子图像测速法分析细胞器的运动。
- 增强对早期发育过程中细胞器动态的理解。
使用的方法
- 注射针的准备和质量控制测试。
- 机械去除胚胎的胚膜。
- 将荧光染料微注射到胚胎中。
- 使用共聚焦显微镜进行活体成像和分析细胞器运动。
主要结果
- 成功注射荧光探针允许可视化细胞器运动。
- 粒子图像测速法揭示了胚胎内部的汇聚细胞质流。
- 荧光标记提供了对脂质滴和内质网等细胞器动态的洞察。
- 脱水时间对于保持胚胎在注射过程中的活力至关重要。
结论
- 该协议能够详细研究活体果蝇胚胎中的细胞器动态。
- 荧光探针增强了细胞过程的可视化。
- 理解细胞器运动有助于对发育生物学的更广泛的洞察。
常见问题
Executive Industry Relevance
Visualizing lipid-containing organelle trafficking in early Drosophila embryos provides a genetically unconstrained system for studying intracellular transport mechanisms relevant to neurodegenerative and metabolic disease models. The use of commercially available fluorescent dyes enables multiplexed, high-signal imaging without reliance on transgenic expression, supporting scalable assay development in discovery biology. This approach facilitates mechanistic de-risking of targets involved in lipid metabolism, organelle positioning, and cytoskeletal regulation by providing quantitative readouts of motility and subcellular localization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of lipid droplet and organelle dynamics to validate targets in lipid storage and trafficking pathways.
- Operational Value: Supports phenotypic screening in any genetic background using vital dyes, bypassing need for transgenic lines.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Multiplex co-labeling of organelles and cytoskeletal elements allows simultaneous readouts of trafficking and structural integrity.
- Operational Value: Commercially available dyes span violet/blue to far-red spectrum, enabling high-throughput imaging with minimal bleed-through.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides disease-relevant system to study organelle motility defects linked to neurodegeneration and metabolic disorders.
- Operational Value: Live imaging with particle image velocimetry and tracking yields quantitative, reproducible motility parameters for lead optimization.
Pipeline & Workflow Integration
The method supports discovery biology through direct visualization of organelle dynamics, informing target validation and pathway analysis prior to lead identification.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of cytoskeletal regulators and motor proteins via direct observation of lipid droplet and ER trafficking.
- Screening: Facilitates assay readiness through standardized dye injection and live imaging protocols applicable across genotypes.
- Analytics: Particle image velocimetry and tracking deliver quantitative flux and velocity metrics to compare experimental conditions.
- Translational Research: Links organelle motility phenotypes to developmental continuity, supporting biomarker alignment in disease models.
- Enterprise Reuse: Protocol is adaptable to lysosomes, mitochondria, and yolk vesicles, enabling platform reuse across multiple target classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence by reducing ambiguity in organelle behavior and cytoskeletal dependence.
- Operational Value: Standardized microinjection and imaging workflow ensures reproducibility across labs and genetic backgrounds.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by revealing mechanistic links between targets and subcellular logistics.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds affecting lipid trafficking or organelle positioning.
Implementation Considerations
- Expertise in Drosophila embryo handling and microinjection technique.
- Confocal microscopy with spectral separation for multiplex dye detection.
- Standardized desiccation protocol to balance embryo permeability and viability.
- Access to vital dyes such as BODIPY, LysoTracker, ER-Tracker, and MitoView.
- Optimization of injection volume and timing to avoid leakage or toxicity.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:40
Injection Needle Preparation
1:26
Injection Solution Preparation and Needle Loading
2:08
Embryo Preparation for Microinjection
4:34
Microinjecting Embryos
5:51
Imaging Embryos
6:38
Results: Representative Results for Organelle Dependent Trafficking in Drosophila Embryos
8:14
Conclusion
