高速视频显微镜分析用于原发性纤毛运动障碍的初诊
2022年1月19日
高速视频显微镜分析是一种相对易于操作、快速、经济且在经验丰富的操作者手中具有较高可靠性的工具，可用于原发性纤毛运动障碍的初筛诊断，应成为每个从事重症肺部疾病诊断与治疗的医疗中心的常规配备。
高速视频显微分析是原发性纤毛运动障碍一线诊断的可靠工具。该技术相对易于操作，快速、经济有效，在经验丰富的操作者手中还具有很高的可靠性。此外，该技术适用于所有年龄组的患者。
视频显微镜还可揭示纤毛的继发性功能障碍，例如由细菌或病毒感染引起的情况。但该技术主要用于诊断原发性纤毛运动障碍。
科学家还使用此方法来观察活细胞内的过程或生物功能。协助我完成此操作的是我们的实验室技术员蒂娜·佩罗梅亚女士。
采集呼吸道上皮细胞前，要求患者彻底擤鼻。当患者准备就绪后，用一只手固定患者头部，另一只手使用0.6毫米大小的牙间刷刷拭鼻腔下鼻甲，以收集足够的上皮细胞条带。将采集到的细胞条带放入含有细胞培养用DMEM的1.5毫升微量离心管中。
关闭微量离心管管盖后，将管子紧贴光源并轻轻振荡，以观察收集到的细胞条带和聚集体。随后，将管盖已正确封闭的微量离心管放入聚苯乙烯盒中。在 tightly 关闭盒子之前，确保管子已在盒内固定稳妥。
然后在避免样本冻结的前提下，向盒中加入冰袋。从聚苯乙烯盒中取出含有样本的微量离心管后，将其中一根离心管置于显微镜加热装置的罩下，使其升温至37摄氏度，用于高速视频显微分析（HSVMA）。接着，在计算机上启动摄像机及视频装置的软件。
使用移液器取少量样品，将两滴样品加入比色皿中。将比色皿盖上盖子，然后置于显微镜下。使用100倍放大倍率的油浸物镜，并在光学镜片表面滴加一滴浸油。
用显微镜物镜接近培养皿底部时，寻找不含红细胞且黏液含量较低的细胞团簇。找到具有代表性的感兴趣区域（ROI）后，聚焦于纤毛运动幅度最大的一组活动纤毛，并录制一段视频序列。分别从侧面和上方录制具有活动纤毛的细胞。
代表性分析显示了从侧面和上方观察到的正常纤毛运动。一名携带 DNAH11 基因突变的原发性纤毛运动障碍（PCD）患者的样本表现出典型的纤毛摆动僵硬且活动极少的模式，从侧面和上方观察时尤为明显。
在另一位具有相同突变的PCD患者中，观察到一种不同的、呈高动力但效率低下的纤毛摆动模式。在一名反复发生上呼吸道感染的患者中，也观察到了病理性纤毛摆动模式和纤毛摆动频率异常。如果刷取操作过于剧烈，则无法进行HSVMA分析，因为纤毛上皮细胞表面会被一层红细胞覆盖。
该操作过程中最重要的步骤是从刷取物中获得足够的呼吸系统细胞，并妥善保存该材料以用于视频分析。剩余材料可用于进行电子显微镜或免疫荧光显微镜检查，以检测纤毛中可能存在的结构异常，或揭示纤毛蛋白的合成缺陷。
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概述
高速视频显微分析是一种可靠且经济有效的原发性纤毛运动障碍诊断工具。该方法操作简便，适用于所有年龄组，对于治疗严重肺部疾病的医疗中心而言至关重要。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 呼吸病学
- 诊断技术
背景
- 原发性纤毛运动障碍是一种影响纤毛功能的疾病。
- 高速视频显微技术能够揭示原发性和继发性纤毛功能状态。
- 该技术在诊断与纤毛功能障碍相关的呼吸系统疾病方面尤为有用。
- 临床医生必须能够获得可靠的诊断工具。
研究目的
- 评估高速视频显微镜在诊断原发性纤毛运动障碍中的有效性。
- 评估该技术在不同患者年龄组中的适用性。
- 强调该诊断工具在临床环境中的重要性。
使用的方法
- 高速视频显微镜分析。
- 纤毛运动与功能的评估。
- 不同患者人群间结果的比较。
- 与感染相关的继发性纤毛功能评估。
主要结果
- 高速视频显微镜技术对诊断原发性纤毛运动障碍具有良好的效果。
- 该技术由经验丰富的人员操作时具有较高的可靠性。
- 可提供有关继发性纤毛功能的信息。
- 适用于所有年龄段的患者，提高了其在临床实践中的应用价值。
结论
- 高速视频显微镜应成为呼吸医学中的标准诊断工具。
- 其操作简便性和可靠性使其适用于一线诊断。
- 广泛推广应用可改善重症肺部疾病患者的临床预后。
常见问题
行业重要性概述
高速视频显微分析（HSVMA）为原发性纤毛运动障碍（PCD）这一影响黏液纤毛清除功能的罕见遗传病提供了一种快速且经济有效的初筛诊断方法。通过直接观察活体呼吸上皮细胞中的纤毛摆动模式，HSVMA有助于早期发现疾病，并减少对透射电子显微镜等资源消耗较大的检测技术的依赖。该技术提升了肺科及罕见病诊疗中心的诊断通量，有利于及时干预，降低长期肺部并发症风险。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：能够对患者来源的细胞中纤毛运动功能进行评估，支持纤毛病研究中的靶点验证。
- 操作价值：提供可重复的功能读数，用于评估基因或药物干预对纤毛功能的影响。
- 预测价值：可区分结构缺陷与功能缺陷，提高对机制假设的信心。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：生成关于纤毛摆动频率和波形的定量数据，用于检测方法的标准化。
- 操作价值：支持建立用于呼吸系统疾病模型中活细胞成像的标准操作流程。
- 可扩展性：能够对多个患者样本或不同遗传变异体中的纤毛动态进行高通量分析。
转化与临床前研究
- 转化连续性：通过将 HSVMA 输出结果与疾病严重程度相关联，架起体外发现与临床表型之间的桥梁。
- 机制性风险降低：通过恢复正常的纤毛摆动功能，在临床前模型中识别功能挽救效应。
- 生物标志物一致性：提供功能性读数，与原发性纤毛运动障碍（PCD）中的结构或分子生物标志物相互补充。
流程与工作流整合
HSVMA 涵盖了从靶点验证到临床前评估的整个发现过程，为纤毛治疗药物的开发提供了功能性检测方法。
- 发现生物学：促进对参与纤毛组装和运动相关基因（如 DNAH11）的假设验证。
- 筛选：提供适用于纤毛病模型中化合物筛选的定量、实时读数。
- 分析：支持在不同条件下对纤毛摆动参数进行统计学比较，助力数据驱动的决策。
- 转化研究：将细胞表型与临床结果关联，推动从临床前到临床的转化。
- 企业级复用：建立可重复使用的平台，用于评估多种呼吸系统疾病模型中的纤毛功能。
运营与企业影响
- 科学价值：通过直接可视化纤毛在天然细胞环境中的动态过程，减少机制上的不确定性。
- 操作价值：通过明确的取样、保存和成像方案，确保实验的标准化和可重复性。
- 战略价值：通过确认基因筛选结果的功能相关性，优化靶点验证中的推进/终止决策。
- 项目影响：基于功能挽救证据，实现对纤毛病相关靶点的风险调整后优先排序。
实施注意事项
- 准确解读需要具备细胞采集、显微镜操作和视频分析方面的专业知识。
- 依赖配备油浸光学系统和环境控制的高速视频显微镜系统。
- 需要标准化的样品处理流程，以防止污染或样品降解。
- 在不同模型系统间应用时，可能需要优化培养条件和成像参数。
- 受限于对活性且无污染的上皮样品的需求；红细胞或黏液的存在可能阻碍分析。
