通过将CBir1 TCR转基因CD4⁺ T细胞过继转移至免疫缺陷小鼠诱导肠道炎症

炎症性肠病（IBD）给个人和社会带来了重大的健康和经济负担。该结肠炎模型有助于研究IBD的发病机制并评估IBD的治疗方法。这种针对免疫优势Cbir鞭毛蛋白特异性T细胞的过继转移结肠炎模型，为肠道细菌抗原如何诱导T细胞反应进而引发结肠炎提供了重要见解。

处死小鼠后，在左侧腹部做约一厘米长的切口，并将皮肤从腹肌组织上拉开。然后，在腹肌组织上做约三厘米长的切口。接着，用无菌剪刀和镊子取出脾脏。

将脾脏置于含有5毫升预冷洗涤缓冲液的培养皿中。用两片无菌玻璃片的粗糙面研磨脾脏。将细胞悬液通过100微米细胞滤筛，收集入50毫升离心管中。

用 5 毫升预冷的洗涤缓冲液冲洗玻片和培养皿，并将洗涤缓冲液转移至离心管中。离心细胞悬液，弃去上清液，每只脾脏加入 5 毫升预热的 Tris 氯化铵裂解缓冲液重悬细胞。室温孵育 10 分钟。

向离心管中加入 10 毫升预冷的洗涤缓冲液。然后，离心细胞悬液，弃去上清液，并用 10 毫升预冷的分离缓冲液重悬细胞。为计数细胞，取 10 微升细胞悬液与 10 微升台盼蓝充分混匀，再将 10 微升混合液加入载玻片中。

然后，将载玻片插入自动细胞计数仪以获得活细胞数量。离心剩余的细胞悬液，并弃去所有上清液。涡旋抗小鼠CD4磁性颗粒，每1000万个细胞直接加入50 µL磁性颗粒，并与细胞沉淀充分混匀。

将混合物在 4 摄氏度下孵育 30 分钟。将细胞颗粒悬液转移至无菌收集管中。向管中加入 3.5 毫升预冷的分离缓冲液。

将离心管置于细胞分离磁铁上，在室温下静置八分钟。然后，用三毫升移液管小心吸除上清液。从细胞分离磁铁上取下离心管。

然后，用 3.5 毫升预冷的分离缓冲液重悬细胞，并将试管置于磁力架上，室温放置 4 分钟。用 3 毫升移液器小心吸除上清液。最后，用 1 毫升预冷的 FACS 缓冲液重悬细胞。

将细胞转移至受体小鼠时，用1×PBS将Cbir1 TCR转基因性CD4阳性T细胞重悬至每毫升500万个细胞。在加热灯下预热小鼠，并使用小鼠固定器固定小鼠。将200微升细胞悬液经尾静脉注射入小鼠体内。

处死小鼠后，作一个约一厘米长的腹侧正中皮肤切口。将皮肤从腹肌组织上剥离。然后，在腹肌组织上作一个三厘米长的切口。

接下来，识别盲肠，并用无菌剪刀和镊子移除整个结肠。用预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）润湿培养皿中的结肠。沿纵轴切开结肠，并用预冷的PBS冲洗。

沿纵轴切取三分之一的结肠。将结肠条置于纸巾上，使管腔面朝上。使用牙签进行瑞士卷样卷曲操作。

将结肠组织放入包埋盒中，然后将包埋盒置于10%缓冲福尔马林溶液中固定24小时。使用自动组织处理机对结肠组织进行脱水和石蜡包埋。随后，用切片机切出5 µm厚的组织切片。

将组织切片置于载玻片上，并进行苏木精和伊红染色。Rag基因敲除小鼠在细胞移植后约三周开始出现体重下降，至移植后六周时体重降至原始体重的80%至85%。受体小鼠在细胞移植后六周表现出结肠长度缩短。

受体小鼠在细胞移植后四周表现出肠道固有层中更多的细胞浸润。细胞移植后五周出现杯状细胞减少和肠上皮细胞增生，六周时出现结肠黏膜下层的黏膜糜烂及炎性细胞浸润。组织病理学评分从四周到六周显著升高。

同时，仅接受PBS的Rag基因敲除小鼠未出现炎症。通过该方法，可采用ELISA和qPCR检测结肠细胞因子水平。