人多能干细胞在二维培养系统中向胰腺β细胞前体的分化

该优化方案提高了从人多能干细胞生成胰腺β细胞前体的效率，可用于糖尿病的细胞治疗以及研究糖尿病发生的分子机制。该技术具有可行性，适用于二维单层培养，操作简便，且在多个对照和患者来源的多能干细胞系中表现一致。

这些β细胞前体细胞移植到糖尿病患者体内后，可成熟为分泌胰岛素的β细胞，有望逆转高血糖。因此，利用本方案生成的胰腺前体细胞比例提高，可用于糖尿病的细胞治疗。该优化方案可用于研究健康个体以及糖尿病患者的早期人类胰腺发育过程，而由于组织样本短缺，此类研究此前具有较大挑战性。

当人多能干细胞（hPSC）集落达到70%至80%融合度时，在组织培养罩内用预热的PBS洗涤两次。然后使用便携式真空抽吸器吸去缓冲液。接着向集落中加入含有CHIR-99021的第一阶段分化培养基，并将培养板在37°C下孵育24小时。

第二天，将耗尽的培养基更换为不含 CHIR-99021 的第一阶段分化培养基。吸除耗尽的培养基后，用预热的 PBS 洗涤定型内胚层细胞两次，轻轻晃动培养板以去除细胞碎片。随后加入 4% 多聚甲醛固定细胞，并将培养板置于二维摇床上。

固定后，用含 0.5% Tween 的 TRIS 缓冲盐水洗涤细胞，并将培养板置于摇床上。然后通过加入足量含 0.5% Triton X-100 的 PBS 对固定后的细胞进行透化处理，并将培养板重新放回摇床。接着，向透化后的细胞中加入新鲜配制的封闭缓冲液，在摇床上孵育一小时。

然后将稀释的一抗加入封闭后的细胞中，将培养板置于4°C的摇床中轻轻振荡孵育。次日，吸去一抗溶液后，在摇床上用TBST洗涤3次，每次10分钟。接着加入二抗。

用铝箔覆盖培养板以避光，并将培养板置于摇床中室温孵育1小时。然后吸去二抗溶液，在摇床上用TBST洗涤染色后的孔，每次10分钟，期间保持培养板覆盖铝箔。接下来，为染色细胞核，向各孔中加入Hoechst溶液，并将培养板置于摇床上。

两到三分钟后，吸除Hoechst溶液，并用PBS洗涤孔板两次。最后，向染色的细胞中加入PBS，并在避光条件下使用倒置荧光显微镜进行成像。第二阶段的第1天，通过先用预热的PBS洗涤，然后每六孔板孔中加入1毫升预热的酶溶液，来解离由hPSC衍生的内胚层细胞。

将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳环境中孵育三至五分钟，或直至细胞开始相互分离。在孔中将已脱落的细胞片层或单层细胞进行解离，并使用基础阶段半量培养基将脱落的细胞收集至一个15毫升聚丙烯离心管中。随后离心细胞，弃去上清液，并用1毫升无菌磷酸盐缓冲液重悬细胞沉淀。

使用自动细胞计数仪计数细胞后，再次离心细胞并弃去上清液。随后将细胞沉淀重悬于适量含有Rock抑制剂的第二阶段分化培养基中。将重悬的细胞接种至1至50个包被有基底膜基质的培养板中，在37摄氏度及5%二氧化碳条件下孵育。

24小时后，将培养基更换为不含Rock抑制剂的第二阶段分化培养基。第四阶段结束时，按照之前所示方法将细胞脱离，并收集至15毫升离心管中。然后离心细胞，弃去上清液，用PBS洗涤细胞，并将其解离为单细胞悬液。

使用自动细胞计数仪计数细胞后，再次离心细胞，并将沉淀重悬于200微升预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）中。接着，将离心管置于低至中等转速的涡旋振荡器上，逐滴加入2毫升预冷的80%乙醇。盖紧管盖，将离心管略微倾斜放置于4摄氏度摇床中过夜。

第二天，离心细胞，并用 PBS 洗涤沉淀，以分散任何固定的细胞团块。然后在摇床上于室温孵育至少一小时，或在 4 摄氏度过夜，对固定后的细胞进行封闭。接下来，为了对胰腺前体细胞标志物进行染色，将每种条件下的 200,000 个细胞（包括相应的同型对照、未染色对照和二抗对照）分装至 96 孔 V 型底板中。

然后短暂离心，迅速翻转培养板以弃去上清液，避免丢失沉淀。接下来，在室温下将细胞与一抗在摇床上轻轻振荡孵育至少两小时。然后用TBST缓冲液通过在孔中反复吹打的方式洗涤染色后的细胞三次。

再次离心细胞，弃去上清液，并向细胞中加入二抗。室温孵育30分钟后，用TBST缓冲液将染色后的细胞洗涤两次。然后离心培养板，将染色后的细胞重悬于100微升PBS中，置于避光的离心管内，随后在流式细胞仪上检测样品。

与非优化方法相比，优化后的方案通过上调 PDX1 和 NKX6.1 的共表达，提高了胰腺前体细胞的分化效率。特别是将内胚层细胞解离并重新接种至新鲜基底膜基质上，同时延长第三阶段的培养时间，相较于未解离细胞的方案，显著增强了由 hPSCs 分化而来的胰腺前体细胞中 NKX6.1 的表达。采用优化方案生成的胰腺前体细胞中 SOX9 阳性细胞的数量也较未解离方法有所增加。

此外，优化后的方法还产生了更高比例的增殖性NKX6.1阳性细胞，这些细胞共表达增殖标志物Ki67。为了提高效率，关键步骤是将HbA1来源的内胚层进行解离，然后延长第三阶段使用FGF信号激活和Hedgehog信号抑制的处理时间。利用该增强型方案可规模化生成胰腺前体细胞，这有助于研究人多能干细胞来源的胰腺β细胞的效率提升与成熟过程，并实现了对不同类型糖尿病的建模研究。