Name: 在2D培养系统中将人多能干细胞分化为胰腺β细胞前体 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-16T14:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: 学习在二维单层培养系统中将人多能干细胞分化为胰腺β细胞前体的方法。该优化方案通过调控PDX1和NKX6.1共表达，提高胰腺祖细胞分化效率，适用于糖尿病细胞治疗及早期胰腺发育机制研究。

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本研究由卡塔尔国家研究基金（QNRF）资助（项目编号：NPRP10-1221-160041）。

本研究已获得相应机构研究伦理委员会的批准，并遵循1964年《赫尔辛基宣言》及其后续修订版或类似的伦理标准进行。研究方案已获哈马德医疗集团（HMC）机构审查委员会（IRB）（编号16260/16）和卡塔尔生物医学研究所（QBRI）（编号2016-003）批准。本工作适用于H1、H9和HUES8等人胚胎干细胞（hESCs）。血液样本来自哈马德医疗集团（HMC）医院的健康个体，并已获得完全知情同意。诱导多能干细胞（iPSCs）由对照组健康个体的外周血单个核细胞（PBMCs）生成23。
1. 培养基的制备
<ol>
	<li>准备人多能干细胞（hPSC）培养基
	<ol>
		<li>使用 commercially available medium（用于维持和扩增人胚胎干细胞的市售培养基），添加 100 单位/mL 青霉素和 100 µg/mL 链霉素（参见材料表），配制 hPSC 培养基。分装后长期保存于 -20 °C，或短期保存于 4 °C 以备即用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配制第 1 阶段分化培养基（用于定型内胚层（DE））。
	<ol>
		<li>以 MCDB 131 培养基为基础，添加 0.5% 无脂肪酸牛血清白蛋白（FFA-BSA）、1.5 g/L 碳酸氢钠（NaHCO3）、10 mM 葡萄糖、2 mM Glutamax、100 单位/mL 青霉素和 100 µg/mL 链霉素，配制基础培养基（参见材料表）。使用 0.2 µm 滤器过滤所配制的培养基，并于 4 °C 保存。</li>
		<li>将步骤 1.2.1 配制的基础培养基预热至 37 °C，然后添加 2 µM CHIR99021、100 ng/mL Activin A、10 µM Rock 抑制剂（Y-27632）和 0.25 mM 维生素 C，配制成含 CHIR99021 的第 1 阶段培养基（参见材料表）。充分混匀后用铝箔包裹，避光保存。 
		注：该培养基仅在分化第一天使用。</li>
		<li>将基础培养基预热至 37 °C，添加 100 ng/mL Activin A 和 0.25 mM 维生素 C，充分混匀，配制成不含 CHIR99021 的第 1 阶段培养基。 
		注：可选择性地向该培养基中添加 5 ng/mL 碱性 FGF（或 FGF2）。该培养基用于第 1 阶段其余天数。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配制第 2 阶段分化培养基（用于原始肠管；PGT）。
	<ol>
		<li>将基础培养基预热至 37 °C，添加 50 ng/mL FGF10、50 ng/mL NOGGIN、0.25 µM CHIR99021、10 µM Y-27632（Rock 抑制剂）和 0.25 mM 维生素 C，配制成含 Rock 抑制剂的第 2 阶段分化培养基。 
		注：该培养基用于内胚层细胞解离当天。</li>
		<li>按照步骤 1.3.1 的相同方法配制第 2 阶段分化培养基，但不添加 Rock 抑制剂。 
		注：该培养基用于第 2 阶段的第二天。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配制第 3 阶段分化培养基（用于后部前肠）。
	<ol>
		<li>配制含 4.5 g/L 葡萄糖的 DMEM 培养基，然后添加 1% 青霉素-链霉素和 2 mM Glutamax，作为第 3 和第 4 阶段的基础培养基。</li>
		<li>将步骤 1.4.1 配制的 DMEM 培养基预热，添加 2 µM 视黄酸、0.25 µM SANT-1、50 ng/mL FGF10、50 ng/mL NOGGIN、0.25 mM 维生素 C 和 1% 不含维生素 A 的 B27 添加剂（参见材料表）。 
		注：该培养基用于 P2-D（方案 2，优化，解离）的第 3 阶段 4 天，以及 P1-ND（方案 1，非优化，非解离）的第 3 阶段 2 天。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配制第 4 阶段分化培养基（用于胰腺前体细胞）。
	<ol>
		<li>在含 4.5 g/L 葡萄糖的 DMEM 培养基中添加 100 ng/mL EGF、10 mM 烟酰胺、50 ng/mL NOGGIN、0.25 mM 维生素 C 和 1% 不含维生素 A 的 B27 添加剂（参见材料表）。该培养基用于第 4 阶段的所有天数。 
		注：所有试剂应保存在适当温度下，细胞因子和敏感试剂需分装保存。在更换分化培养基时，将分装的试剂解冻后加入基础培养基中。不同分化培养基的组成详见表 1。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 准备包被基底膜基质的培养皿
<ol>
	<li>在冰上解冻市售基底膜基质（见材料表），分装后于 -20 °C 冻存。</li>
	<li>包被组织培养皿前，将冻存的分装基质在冰上解冻。取适量基底膜基质溶液加入预冷的 KO-DMEM/F-12 培养基（KnockOut DMEM/F-12）（见材料表），稀释至所需浓度，并充分混匀。将稀释后的基质溶液于 4 °C 保存，以备立即使用。</li>
	<li>用稀释后的基底膜基质溶液覆盖组织培养处理过的培养板表面（见材料表），于 37 °C 孵育至少 60 分钟后再接种细胞。进行胰腺分化实验时，使用 1:50 的基底膜基质溶液与 KO-DMEM/F-12 的稀释比例；扩增未分化 hPSCs 时，使用 1:80 的稀释比例。</li>
</ol>
3. 未分化人多能干细胞的培养
<ol>
	<li>当hPSC细胞集落达到70%–80%融合度时进行传代。</li>
	<li>传代时，用预热的PBS洗涤hPSC一次，使用组织培养罩内的便携式真空抽吸装置吸除液体，然后加入含0.5 mM EDTA的PBS溶液覆盖集落表面。在37 °C、5% CO2条件下孵育1分钟，或直至集落边缘从培养皿表面脱离。</li>
	<li>移除EDTA溶液，使用P1000移液器将正在脱落的集落收集至hPSC培养基中。在室温下以128 × g离心4分钟。弃去上清液，向细胞中加入含有10 µM Y-27632（ROCK抑制剂）的hPSC培养基23,24。 
	&#8203;注意：将hPSC以至少1:3的比例传代至经1:80基底膜基质包被的培养皿中。然而，对于分化实验，应将hPSC接种于1:50包被的培养皿上。</li>
</ol>
4. 人多能干细胞中定型内胚层（DE）分化的诱导（第一阶段）
<ol>
	<li>当hPSC集落达到70%-80%融合度时，在生物安全柜内用预热的PBS洗涤两次，并使用便携式真空抽吸器抽吸，以开始第1阶段分化。</li>
	<li>向集落中加入含有CHIR99021（来自步骤1.2.2）的第1阶段分化培养基，每6孔板加入2 mL，于37 °C孵育24 h。</li>
	<li>次日，用不含CHIR99021的第1阶段分化培养基（步骤1.2.3）替换旧培养基。</li>
	<li>每隔24 h，在生物安全柜内使用便携式真空抽吸器吸除旧培养基，并更换为新鲜的不含CHIR99021的第1阶段分化培养基。 
	&#8203;注意：第1阶段最长可延长至4天。具体时长取决于所使用的hPSC细胞系，应相应优化。</li>
</ol>
5. 人多能干细胞分化为定型内胚层（第一阶段）的免疫荧光分析
<ol>
	<li>进行免疫荧光染色时，在组织培养超净台内使用便携式真空抽吸装置吸除孔板中的废弃培养基，并用预热的 PBS 洗涤两次。轻轻摇晃孔板以去除细胞碎片。</li>
	<li>用 4% 多聚甲醛（PFA）覆盖孔板表面，以固定定型内胚层（DE）细胞；例如，向 24 孔板的每个孔中加入 250 µL PFA。将孔板置于 20 × g 的二维摇床上固定 20 分钟。</li>
	<li>固定完成后，用含 0.5% Tween 的 Tris 缓冲盐水（TBST）洗涤 DE 细胞（参见材料表），并将孔板置于 20 × g 摇床上振荡 10 分钟。重复此步骤一次。</li>
	<li>通过加入足量含 0.5% Triton X-100 的磷酸盐缓冲盐水（PBST）对固定后的细胞进行通透处理；例如，向 24 孔板的每个孔中加入 1 mL PBST，并将孔板放回 20 × g 摇床上振荡 20 分钟。</li>
	<li>新鲜配制含 5%-6% BSA 的 PBST 作为封闭缓冲液，并加入通透后的细胞中。将孔板置于摇床上，在封闭液中孵育至少 1 小时。</li>
	<li>将针对 SOX17 和 FOXA2 的一抗混合稀释（参见材料表），稀释于含 2%-3% BSA 的 PBST 溶液中。将混合后的一抗加入已封闭的细胞孔中，并将孔板置于 4 °C 条件下，在低速轻柔振荡环境中过夜孵育。 
	NOTE: SOX17 和 FOXA2 是公认的定型内胚层标志物25,26。</li>
	<li>次日，使用便携式真空过滤装置吸除一抗溶液，并用 TBST 在摇床上洗涤孔板三次，每次洗涤 10 分钟。</li>
	<li>将 Alexa Fluor 488 和 568 标记的二抗（参见材料表）按 1:500 比例稀释于 PBST 中，所选二抗需针对一抗的宿主物种。</li>
	<li>将混合的二抗溶液加入染色孔中，并用铝箔包裹孔板以避光。将孔板置于摇床上，室温孵育 1 小时。</li>
	<li>使用便携式真空过滤装置吸除二抗溶液，并在摇床上用 TBST 洗涤染色孔，每次 10 分钟，共洗涤三次，每次均用铝箔覆盖孔板以避光。</li>
	<li>在 PBS 中新鲜配制 1 µg/mL 的 Hoechst 33342 溶液用于细胞核染色。将 Hoechst 溶液加入各孔中，并将孔板置于摇床上振荡 2-3 分钟。</li>
	<li>使用便携式真空过滤装置吸除 Hoechst 溶液，并用 PBS 洗涤孔板两次。</li>
	<li>最后，向染色后的细胞孔中加入 PBS，并在避光条件下使用倒置荧光显微镜（参见材料表）进行成像。未进行成像时，应始终用铝箔覆盖孔板，以尽量减少荧光染料的光漂白。 
	&#8203;NOTE: 也可采用流式细胞术评估定型内胚层分化效率，方法见步骤 9.2。</li>
</ol>
6. 由人多能干细胞（hPSCs）生成原始肠管（PGT）（第二阶段）
注意：如果步骤 5.13 中的免疫荧光分析结果显示 SOX17 与 FOXA2 的共表达率达到 80% 或以上，则实验进入第 2 阶段；如果效率 &#60;80%，则将第 1 阶段持续时间延长至 4 天。
<ol>
	<li>在第2阶段的第1天，使用TrypLE或Accutase（见材料表）对hPSC来源的内胚层细胞进行消化，以用于优化的P2-D方案。用预热的PBS洗涤贴壁细胞，然后在37 °C、5% CO2条件下，每6孔板孔加入1 mL预热的TrypLE或Accutase溶液，孵育3–5分钟，直至细胞开始彼此分离。</li>
	<li>将孔中脱落的细胞片或单层细胞进一步解离，然后使用不含细胞因子但含有至少0.5%胎牛血清（FBS）或KnockOut血清（KOSR）的基础Stage 1/2培养基（见材料表），将细胞收集至15 mL聚丙烯离心管中。</li>
	<li>在4 °C下以800 × g离心5分钟，弃去上清液。加入1 mL无菌PBS，将细胞沉淀重悬为单细胞悬液。</li>
	<li>使用自动细胞计数仪（见材料表），将推荐体积的细胞悬液加入计数板室中进行细胞计数。将重悬的细胞在4 °C下以800 × g离心5分钟，弃去上清液。</li>
	<li>将细胞沉淀重悬于适量体积的Stage 2分化培养基中，加入Rho激酶抑制剂（Rock inhibitor），细胞密度为2.5–3.5 × 105 个细胞/cm2。 
	注意：对于大多数细胞系，此细胞数量相当于1:2的传代比例，具体取决于细胞增殖速率。最终每孔加入总体积为2 mL的含重悬细胞的培养基，接种于6孔板的一个孔中。</li>
	<li>将重悬的细胞接种至已涂覆1:50基底膜基质的培养板（按步骤2制备）上，置于37 °C、5% CO2的培养箱中孵育。</li>
	<li>24小时后，更换为不含Rho激酶抑制剂的Stage 2分化培养基（按步骤1.3.2制备）。</li>
</ol>
7. 由 hPSCs 生成后部前肠（第 3 阶段）
<ol>
	<li>在生物安全柜内使用便携式真空抽吸装置吸除第二阶段废弃培养基，并用预热的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞。</li>
	<li>向细胞中加入步骤1.4配制的第三阶段分化培养基，于37 °C、5% CO2条件下孵育。</li>
	<li>24小时后，更换为新鲜配制的第三阶段分化培养基。P2-D方案（优化方案）共重复此步骤4天，而非解离的P1-ND方案仅重复2天。</li>
</ol>
8. 由hPSCs生成胰腺前体细胞（第4阶段）
<ol>
	<li>经过3阶段处理4天后，用预热的PBS洗涤细胞，轻轻摇晃培养板，并使用便携式真空抽吸器抽吸。然后向细胞中加入步骤1.5配制的4阶段分化培养基。</li>
	<li>24小时后，用新配制的4阶段培养基更换用过的培养基。重复此步骤，共持续4天。</li>
</ol>
9. 评估由人多能干细胞生成胰腺前体细胞的分化效率
<ol>
	<li>对人多能干细胞（hPSC）分化的胰腺前体细胞（第4阶段）进行免疫荧光分析，检测PDX1和NKX6.1的表达。 
	注意：PDX1和NKX6.1是公认的胰腺前体细胞标志物17,18。
	<ol>
		<li>按照步骤5进行固定、通透、封闭以及抗体孵育和洗涤。</li>
		<li>使用PDX1和NKX6.1抗体组合（见材料表）对hPSC分化的胰腺前体细胞进行染色，抗体用含2%-3% BSA的PBST稀释。</li>
		<li>使用适当比例为1:500的Alexa Fluor 488和568标记的二抗（见材料表）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对hPSC分化的胰腺前体细胞进行流式细胞术分析，检测PDX1和NKX6.1的表达。 
	注意：对所获得的hPSC来源胰腺前体细胞中的胰腺标志物进行流式细胞术分析，可定量分析共表达PDX1和NKX6.1的细胞比例。
	<ol>
		<li>第4阶段结束时，用预热的PBS洗涤细胞两次，加入足量TrypLE或Accutase覆盖孔底表面，例如每孔6孔板加入1 mL TrypLE或Accutase。将培养板放入培养箱中孵育5-7分钟，或直至细胞从表面脱落。</li>
		<li>使用P1000移液器在孔内将贴壁的细胞片层吹打分散，然后收集至15 mL聚丙烯离心管中。</li>
		<li>在4 °C条件下以800 × g离心5分钟，沉淀hPSC来源的胰腺前体细胞，弃去上清液。用PBS重悬细胞并吹打成单细胞悬液进行洗涤。使用自动细胞计数仪（见材料表）计数细胞，并记录每毫升的细胞浓度。</li>
		<li>在4 °C条件下以800 × g离心5分钟，弃去上清液。向沉淀中加入200 µL预冷的PBS并吹打重悬。</li>
		<li>将离心管置于低至中等转速（室温下约400 × g）的涡旋振荡器上，逐滴加入2 mL预冷的80%乙醇。盖紧管盖，将离心管略微倾斜放置于4 °C摇床中过夜。</li>
		<li>在4 °C条件下以800 × g离心5分钟，用PBS洗涤细胞，吹打以分散任何固定的细胞团块。</li>
		<li>用含5%-6% BSA的PBST溶液在室温下封闭固定后的细胞至少1小时，或在4 °C摇床上过夜。</li>
		<li>按照以下步骤对胰腺前体细胞标志物进行染色。
		<ol>
			<li>将每种条件下的200,000个细胞（包括根据一抗宿主物种IgG亚类设置的同型对照、未染色对照和仅二抗对照）分装至96孔V型底板或1.5 mL离心管中。</li>
			<li>在4 °C条件下以800 × g离心5分钟，迅速翻转平板以弃去上清液，避免丢失细胞沉淀。将一抗用含3% BSA的溶液稀释后加入（见材料表）。 
			注意：一抗的稀释比例可在1:50至1:200之间。</li>
			<li>将染色后的细胞在室温下于摇床上低速轻柔振荡孵育至少2小时，或在4 °C过夜。</li>
			<li>用TBST通过反复吹打洗涤染色细胞三次。离心并按步骤9.2.8.2的方法弃去上清液。</li>
			<li>加入用PBS配制的1:500稀释比例的二抗（Alexa Fluor 488和647标记的抗体）（见材料表），室温孵育30分钟。</li>
			<li>用TBST通过反复吹打至少洗涤染色细胞两次。离心并按步骤9.2.8.2的方法弃去上清液。</li>
			<li>将染色后的细胞重悬于至少100 µL PBS中，转移至避光的FACS管中（见材料表），并在流式细胞仪上检测样本。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Rezania, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+human+embryonic+stem+cell-derived+NKX6.1-expressing+pancreatic+progenitor+cells+accelerates+the+maturation+of+insulin-secreting+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Journal%22%5BJournal%5D)">Enrichment of human embryonic stem cell-derived NKX6.1-expressing pancreatic progenitor cells accelerates the maturation of insulin-secreting cells in vivo.</a> Stem Cells Journal. 31 (11), 2432-2442 (2013).</li>
<li>Bruin, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+polyhormonal+insulin-producing+cells+derived+in+vitro+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Characterization of polyhormonal insulin-producing cells derived in vitro from human embryonic stem cells.</a> Stem Cell Research. 12 (1), 194-208 (2014).</li>
<li>Toyoda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+aggregation+optimizes+the+differentiation+of+human+ESCs+and+iPSCs+into+pancreatic+bud-like+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Cell aggregation optimizes the differentiation of human ESCs and iPSCs into pancreatic bud-like progenitor cells.</a> Stem Cell Research. 14 (2), 185-197 (2015).</li>
<li>Memon, B., Abdelalim, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+pancreatic+progenitors+co-expressing+PDX1+and+NKX6.1%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Highly efficient differentiation of human pluripotent stem cells into pancreatic progenitors co-expressing PDX1 and NKX6.1.</a> Methods in Molecular Biology. , (2020).</li>
<li>Memon, B., Karam, M., Al-Khawaga, S., Abdelalim, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+pancreatic+progenitors+co-expressing+PDX1+and+NKX6.1%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Enhanced differentiation of human pluripotent stem cells into pancreatic progenitors co-expressing PDX1 and NKX6.1.</a> Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 15(2018).</li>
<li>Aigha, I. I., Memon, B., Elsayed, A. K., Abdelalim, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+two+distinct+NKX6.1+populations+of+pancreatic+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human pluripotent stem cells into two distinct NKX6.1 populations of pancreatic progenitors.</a> Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 83(2018).</li>
<li>Ali, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keratinocytes+derived+from+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells+recapitulate+the+genetic+signature+of+psoriasis+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Keratinocytes derived from patient-specific induced pluripotent stem cells recapitulate the genetic signature of psoriasis disease.</a> Stem Cells and Development. 29 (7), 383-400 (2020).</li>
<li>Elsayed, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+human+induced+pluripotent+stem+cell+line+%28QBRIi009-A%29+from+a+patient+with+a+heterozygous+deletion+of+FOXA2%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Generation of a human induced pluripotent stem cell line (QBRIi009-A) from a patient with a heterozygous deletion of FOXA2.</a> Stem Cell Research. 42, 101705(2020).</li>
<li>Davenport, C., Diekmann, U., Budde, I., Detering, N., Naujok, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anterior-posterior+patterning+of+definitive+endoderm+generated+from+human+embryonic+stem+cells+depends+on+the+differential+signaling+of+retinoic+acid%2C+Wnt-%2C+and+BMP-signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Anterior-posterior patterning of definitive endoderm generated from human embryonic stem cells depends on the differential signaling of retinoic acid, Wnt-, and BMP-signaling.</a> Stem Cells. 34 (11), 2635-2647 (2016).</li>
<li>Schroeder, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+and+selection+of+Sox17-expressing+endoderm+cells+generated+from+murine+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cells+Tissues+Organs%22%5BJournal%5D)">Induction and selection of Sox17-expressing endoderm cells generated from murine embryonic stem cells.</a> Cells Tissues Organs. 195 (6), 507-523 (2012).</li>
<li>Nostro, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+NKX6-1%2B+pancreatic+progenitors+from+multiple+human+pluripotent+stem+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of NKX6-1+ pancreatic progenitors from multiple human pluripotent stem cell lines.</a> Stem Cell Reports. 4 (4), 591-604 (2015).</li>
<li>Elsayed, A. K., Younis, I., Ali, G., Hussain, K., Abdelalim, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+development+of+pancreatic+beta+cells+derived+from+human+iPSCs+with+FOXA2+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">Aberrant development of pancreatic beta cells derived from human iPSCs with FOXA2 deficiency.</a> Cell Death & Disease. 12 (1), 103(2021).</li>
<li>Mfopou, J. K., Chen, B., Mateizel, I., Sermon, K., Bouwens, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noggin%2C+retinoids%2C+and+fibroblast+growth+factor+regulate+hepatic+or+pancreatic+fate+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Noggin, retinoids, and fibroblast growth factor regulate hepatic or pancreatic fate of human embryonic stem cells.</a> Gastroenterology. 138 (7), 1-14 (2010).</li>
<li>Mfopou, J. K., De Groote, V., Xu, X., Heimberg, H., Bouwens, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonic+hedgehog+and+other+soluble+factors+from+differentiating+embryoid+bodies+inhibit+pancreas+development%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Sonic hedgehog and other soluble factors from differentiating embryoid bodies inhibit pancreas development.</a> Stem Cells. 25 (5), 1156-1165 (2007).</li>
<li>Gattazzo, F., Urciuolo, A., Bonaldo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix%3A+A+dynamic+microenvironment+for+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix: A dynamic microenvironment for stem cell niche.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (8), 2506-2519 (2014).</li>
<li>Watt, F. M., Huck, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+extracellular+matrix+in+regulating+stem+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Role of the extracellular matrix in regulating stem cell fate.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (8), 467-473 (2013).</li>
<li>Shih, H. P., Panlasigui, D., Cirulli, V., Sander, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ECM+signaling+regulates+collective+cellular+dynamics+to+control+pancreas+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">ECM signaling regulates collective cellular dynamics to control pancreas branching morphogenesis.</a> Cell Reports. 14 (2), 169-179 (2016).</li>
<li>Raza, A., Ki, C. S., Lin, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+matrix+properties+on+growth+and+morphogenesis+of+human+pancreatic+ductal+epithelial+cells+in+3D%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The influence of matrix properties on growth and morphogenesis of human pancreatic ductal epithelial cells in 3D.</a> Biomaterials. 34 (21), 5117-5127 (2013).</li>
<li>Lin, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibronectin+and+laminin+promote+differentiation+of+human+mesenchymal+stem+cells+into+insulin+producing+cells+through+activating+Akt+and+ERK%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Science%22%5BJournal%5D)">Fibronectin and laminin promote differentiation of human mesenchymal stem cells into insulin producing cells through activating Akt and ERK.</a> Journal of Biomedical Science. 17, 56(2010).</li>
<li>Boretti, M. I., Gooch, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+extracellular+matrix+and+3D+morphogenesis+on+islet+hormone+gene+expression+by+Ngn3-infected+mouse+pancreatic+ductal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Effect of extracellular matrix and 3D morphogenesis on islet hormone gene expression by Ngn3-infected mouse pancreatic ductal epithelial cells.</a> Tissue Engineering Part A. 14 (12), 1927-1937 (2008).</li>
<li>Boretti, M. I., Gooch, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+cell+clustering+enhances+islet+beta+cell+formation+from+human+cultures+enriched+for+pancreatic+ductal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Induced cell clustering enhances islet beta cell formation from human cultures enriched for pancreatic ductal epithelial cells.</a> Tissue Engineering. 12 (4), 939-948 (2006).</li>
<li>Beattie, G. M., Rubin, J. S., Mally, M. I., Otonkoski, T., Hayek, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+proliferation+and+differentiation+of+human+fetal+pancreatic+islet+cells+by+extracellular+matrix%2C+hepatocyte+growth+factor%2C+and+cell-cell+contact%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Regulation of proliferation and differentiation of human fetal pancreatic islet cells by extracellular matrix, hepatocyte growth factor, and cell-cell contact.</a> Diabetes. 45 (9), 1223-1228 (1996).</li>
<li>Gage, B. K., Webber, T. D., Kieffer, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+cell+seeding+density+influences+pancreatic+endocrine+development+during+in+vitro+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Initial cell seeding density influences pancreatic endocrine development during in vitro differentiation of human embryonic stem cells.</a> PLoS One. 8 (12), 82076(2013).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本研究描述了一种改进的方案，用于从人多能干细胞（hPSCs）高效共表达PDX1和NKX6.1的胰腺前体细胞。将hPSC来源的内胚层细胞以半密度重铺于新鲜基质上进行解离和再接种，可显著提高hPSC来源胰腺前体细胞中PDX1和NKX6.1的表达水平。
尽管各阶段所用的生长因子组合与P1-ND高度相似27，但研究显示，延长第3阶段的处理时间，加入FGF和视黄酸信号通路激活以及BMP和hedgehog信号通路抑制，可提高NKX6.1的表达，这与Nostro等人的研究结果相反27。尽管在胚胎发育过程中胰腺中PDX1的表达受FGF和视黄酸信号的正向调控，并受到BMP和hedgehog信号抑制的影响27,29,30，但本研究结果表明，延长该信号组合处理时间同样可上调NKX6.1的表达。然而，延长第3阶段处理的效果得益...

糖尿病是一种复杂的代谢性疾病，影响着全球数百万人。补充胰岛素被认为是治疗糖尿病的唯一方法。更严重的病例则采用β细胞替代疗法，通过移植整个尸体胰腺或胰岛来实现1,2。然而，移植疗法面临诸多问题，例如组织来源的数量和质量受限、移植手术具有侵入性，以及需要长期使用免疫抑制剂。因此，迫切需要探索新型且可替代的β细胞替代治疗策略2,3。近年来，人类多能干细胞（hPSCs）已成为研究人类胰腺生物学的重要工具，同时也被视为一种可持续且可能更具个体化潜力的移植治疗新来源4,5,6,7。hPSCs包括人类胚胎干细胞（hESCs）和人类诱导性多能干细胞（hiPSCs），具有强大的自我更新能力，可分化为人体所有类型的组织。hESCs来源于胚胎的内细胞团，而hiPSCs则是通过对任何体细胞进行重编程获得的4,8。
定向分化方案经过优化，可将人多能干细胞（hPSCs）依次引导通过胰腺发育的各个阶段，从而生成胰岛β细胞 体外这些方案可生成由人多能干细胞（hPSC）衍生的胰岛类器官。尽管这些方案在提高其中胰腺β细胞比例方面已有显著改进，但其效率仍存在高度变异性，胰岛类器官中NKX6.1+/INSULIN+或C-PEPTIDE+细胞的比例通常无法提升至40%以上。5,9,10,11,12,13然而，这些生成的β细胞在转录和代谢特征以及对葡萄糖的反应方面，与成人人类β细胞并不完全相同。4,5,14hPSC 分化而来的 β 细胞与成人胰岛相比，缺乏关键 β 细胞标志物的基因表达，如 PCSK2、PAX6、UCN3、MAFA、G6PC2 和 KCNK35此外，由hPSC分化而来的β细胞在响应葡萄糖时钙信号减弱。这些细胞中混有同时产生的多激素细胞，后者无法在葡萄糖浓度升高时分泌适量的胰岛素。5另一方面，由人多能干细胞（hPSC）衍生的胰腺前体细胞（即胰岛前体细胞）可更高效地生成 体外 与β细胞相比，且在移植后 体内，可成熟为具有功能的、分泌胰岛素的β细胞15,16目前，临床试验主要致力于验证其在1型糖尿病（T1D）受试者移植后的安全性和有效性。
值得注意的是，在同一胰腺前体细胞中转录因子PDX1（胰腺和十二指肠同源框1）和NKX6.1（NKX6同源框1）的表达对于向β细胞谱系分化至关重要5。未能表达NKX6.1的胰腺前体细胞将分化为多激素内分泌细胞或无功能的β细胞17,18。因此，在胰腺前体细胞阶段实现PDX1和NKX6.1的高共表达，是最终生成大量功能性β细胞的关键。研究表明，在类胚体或三维培养体系中，分化细胞发生聚集，可增强胰腺前体细胞中PDX1和NKX6.1的表达，PDX1+/NKX6.1+细胞群体的比例可达40%–80%12,19。然而，与悬浮培养相比，二维分化培养在多种细胞系的应用中更具成本效益、可行性更高且操作更便捷5。我们近期的研究表明，单层分化培养可获得超过90%的PDX1+/NKX6.1+共表达人多能干细胞（hPSC）来源的胰腺前体细胞20,21,22。该方法赋予所生成的胰腺前体细胞较强的增殖能力，并可防止向其他谱系（如肝细胞谱系）分化21。因此，本方案展示了一种高效的人多能干细胞向共表达PDX1和NKX6.1的胰腺β细胞前体分化的技术。该方法通过解离hPSC来源的内胚层并调控细胞密度，随后延长FGF和类视黄醇信号通路的激活并抑制Hedgehog信号通路，以促进PDX1和NKX6.1的共表达（图1）。该技术可用于规模化生成hPSC来源的胰腺β细胞前体，服务于移植治疗及疾病建模研究。

<table><tbody><tr><td>15 mL 锥形离心管</td><td>Thermo Scientific</td><td>339651</td><td></td></tr><tr><td>20X TBS Tween 20</td><td>Thermo Scientific</td><td>28360</td><td></td></tr><tr><td>24 孔平底带盖细胞培养板</td><td>Costar</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 锥形离心管</td><td>Thermo Scientific</td><td>339652</td><td></td></tr><tr><td>6 孔多孔细胞培养板</td><td>Thermo Scientific</td><td>140685</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>0-7920</td><td></td></tr><tr><td>Activin A</td><td>R&amp;amp;D</td><td>338-AC</td><td>用 4 mM HCl 重悬</td></tr><tr><td>抗 NKX6.1 抗体，小鼠单克隆</td><td>DSHB</td><td>F55A12-C</td><td>流式细胞术稀释至 1:100，免疫染色稀释至 1:2000</td></tr><tr><td>抗 PDX1 抗体，豚鼠多克隆</td><td>Abcam</td><td>ab47308</td><td>流式细胞术稀释至 1:100，免疫染色稀释至 1:1000</td></tr><tr><td>B27（不含维生素 A）</td><td>ThermoFisher</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白，热激片段，无脂肪酸</td><td>Sigma</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>CHIR 99021</td><td>Tocris</td><td>4423</td><td>用 DMSO 重悬</td></tr><tr><td>DMEM，高糖</td><td>ThermoFisher</td><td>41965047</td><td></td></tr><tr><td>驴抗小鼠 IgG (H + L) 高度交叉吸附二抗，Alexa Fluor 568</td><td>Invitrogen</td><td>A10037</td><td></td></tr><tr><td>驴抗兔 IgG (H + L) 高度交叉吸附二抗，Alexa Fluor 488</td><td></td><td>A-21206</td><td></td></tr><tr><td>DPBS 1X</td><td>ThermoFisher</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>ThermoFisher</td><td>PHG0313</td><td>用含 0.1% BSA 的 PBS 重悬</td></tr><tr><td>FGF10</td><td>R&amp;amp;D</td><td>345-FG</td><td>用 PBS 重悬</td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8644</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33258</td><td>Sigma</td><td>23491-45-4</td><td></td></tr><tr><td>倒置显微镜</td><td>Olympus</td><td>IX73</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut DMEM/F-12 (1X)</td><td>Gibco</td><td>12660-012</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut SR 血清替代物</td><td>Gibco</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>L-抗坏血酸（维生素 C）</td><td>Sigma</td><td>A92902</td><td>用蒸馏水重悬</td></tr><tr><td>Matrigel 生长因子减少型（GFR）基底膜基质</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>将解冻后的原液分装，并于 -20°C 冻存</td></tr><tr><td>MCDB131</td><td>ThermoFisher</td><td>10372019</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗 SOX17</td><td>ORIGENE</td><td>CF500096</td><td>流式细胞术稀释至 1:100，免疫染色稀释至 1:2000</td></tr><tr><td>mTeSR Plus</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>85850</td><td>将基础培养基与补充剂混合。分装后可长期保存于 -20 &amp;deg;C，或短期保存于 4 &amp;deg;C 以备即用</td></tr><tr><td>Nalgene 滤器，0.2 &amp;micro;m PES</td><td>ThermoFisher</td><td>566-0020</td><td></td></tr><tr><td>烟酰胺</td><td>Sigma</td><td>72340</td><td>用蒸馏水重悬</td></tr><tr><td>NOGGIN</td><td>R&amp;amp;D</td><td>6057-NG</td><td>用含 0.1% BSA 的 PBS 重悬</td></tr><tr><td>4% 甲醛 PBS 溶液</td><td>ChemCruz</td><td>sc-281692</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（10,000 U/mL）</td><td>ThermoFisher</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>便携式真空吸液器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>兔抗 FOXA2</td><td>Cell signaling technology</td><td>3143</td><td>流式细胞术稀释至 1:100，免疫染色稀释至 1:500</td></tr><tr><td>视黄酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R2625</td><td>用 DMSO 重悬</td></tr><tr><td>ROCK 抑制剂（Y-27632）</td><td>ReproCell</td><td>04-0012-02</td><td>用 DMSO 重悬</td></tr><tr><td>带盖圆底聚苯乙烯 FACS 管，无菌</td><td>Stellar Scientific</td><td>FSC-9010</td><td></td></tr><tr><td>SANT-1</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S4572</td><td>用 DMSO 重悬</td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Sigma</td><td>S5761-500G</td><td></td></tr><tr><td>StemFlex</td><td>ThermoFisher</td><td>A3349401</td><td>将基础培养基与补充剂混合。分装后可长期保存于 -20 &amp;deg;C，或短期保存于 4 &amp;deg;C 以备即用</td></tr><tr><td>TALI 细胞分析载片</td><td>Invitrogen</td><td>T10794</td><td></td></tr><tr><td>Tali 图像型细胞计数仪（自动细胞计数器）</td><td>Invitrogen</td><td>T10796</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE 100 mL</td><td>ThermoFisher</td><td>12563011</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 0.5 M EDTA，pH 8.0</td><td>Invitrogen</td><td>15575-038</td><td></td></tr></tbody></table>

人多能干细胞在二维培养系统中向胰腺β细胞前体的分化

Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells Into Pancreatic Beta-Cell Precursors in a 2D Culture System

人类多能干细胞（hPSCs）是研究早期胰腺发育以及探索糖尿病遗传因素的优良工具。由hPSCs衍生的胰岛素分泌细胞可用于细胞治疗和疾病建模，&#160;然而，&#160;功能特性有限。当人多能干细胞（hPSC）来源的胰腺前体细胞（β细胞及其他内分泌细胞的前体）共表达两种转录因子PDX1和NKX6.1时，可定向分化为具有功能的胰岛素分泌型β细胞 体外 和 体内人多能干细胞（hPSC）分化的胰腺前体细胞目前正作为临床试验的一部分，用于1型糖尿病患者的细胞治疗。然而，现有方案产生的NKX6.1阳性胰腺前体细胞比例较低，导致同时生成大量无功能的内分泌细胞，而能够响应葡萄糖并分泌胰岛素的细胞数量稀少。因此，本研究开发了一种改进的二维单层培养方案，以最大化诱导hPSC来源的胰腺前体细胞中PDX1与NKX6.1的共表达。通过调控细胞密度、新鲜基质的供应以及hPSC来源的内胚层细胞的解离条件，显著提高了所生成胰腺前体细胞中PDX1和NKX6.1的表达水平，并减少了向肝细胞谱系的非目标分化。该研究强调，在细胞分化过程中调控其物理环境可显著影响 体外 分化可影响谱系特化及基因表达。因此，本优化后的实验方案有助于规模化生成共表达PDX1与NKX6.1的前体细胞，用于细胞治疗与疾病建模。

结果表明，优化后的方案P2-D（图1A）通过上调PDX1和NKX6.1的共表达，提高了胰腺前体细胞的分化效率（图2A、B和图3A）。特别是，内胚层细胞的解离以及将其重新接种至新鲜基底膜基质上，同时延长第3阶段的培养时间，可增强人多能干细胞来源的胰腺前体细胞中NKX6.1的表达（优化方案P2-D）（图2和 图3A），相较于未进行细胞解离的方案（P1-ND，该方案改编自先前发表的研究27）。本研究改进的方案相比“P1-D”（方案1，S3 = 2天，进行解离）和“P2-ND”（方案2，S3 = 4天，未解离）产生了最高比例的PDX1+/NKX6.1+前体细胞，详细结果此前已有发表21。使...

本方案描述了一种改进的方法，可提高人多能干细胞（hPSCs）在平面单层培养中衍生的胰腺前体细胞共表达PDX1和NKX6.1转录因子的效率。该方法通过更换新鲜基质、调控细胞密度以及解离内胚层细胞来实现。

人类多能干细胞（hPSCs）是研究早期胰腺发育以及探究与...相关的遗传因素的优良工具

该优化方案提高了从人多能干细胞生成胰腺β细胞前体的效率，可用于糖尿病的细胞治疗以及研究糖尿病发生的分子机制。该技术具有可行性，适用于二维单层培养，操作简便，且在多个对照和患者来源的多能干细胞系中表现一致。这些β细胞前体细胞移植到糖尿病患者体内后，可成熟为分泌胰岛素的β细胞，有望逆转高血糖。因此，利用本方案生成的胰腺前体细胞比例提高，可用于糖尿病的细胞治疗。该优化方案可用于研究健康个体以及糖尿病患者的早期人类胰腺发育过程，而由于组织样本短缺，此类研究此前具有较大挑战性。当人多能干细胞（hPSC）集落达到70%至80%融合度时，在组织培养罩内用预热的PBS洗涤两次。然后使用便携式真空抽吸器吸去缓冲液。接着向集落中加入含有CHIR-99021的第一阶段分化培养基，并将培养板在37°C下孵育24小时。第二天，将耗尽的培养基更换为不含 CHIR-99021 的第一阶段分化培养基。吸除耗尽的培养基后，用预热的 PBS 洗涤定型内胚层细胞两次，轻轻晃动培养板以去除细胞碎片。随后加入 4% 多聚甲醛固定细胞，并将培养板置于二维摇床上。固定后，用含 0.5% Tween 的 TRIS 缓冲盐水洗涤细胞，并将培养板置于摇床上。然后通过加入足量含 0.5% Triton X-100 的 PBS 对固定后的细胞进行透化处理，并将培养板重新放回摇床。接着，向透化后的细胞中加入新鲜配制的封闭缓冲液，在摇床上孵育一小时。然后将稀释的一抗加入封闭后的细胞中，将培养板置于4°C的摇床中轻轻振荡孵育。次日，吸去一抗溶液后，在摇床上用TBST洗涤3次，每次10分钟。接着加入二抗。用铝箔覆盖培养板以避光，并将培养板置于摇床中室温孵育1小时。然后吸去二抗溶液，在摇床上用TBST洗涤染色后的孔，每次10分钟，期间保持培养板覆盖铝箔。接下来，为染色细胞核，向各孔中加入Hoechst溶液，并将培养板置于摇床上。两到三分钟后，吸除Hoechst溶液，并用PBS洗涤孔板两次。最后，向染色的细胞中加入PBS，并在避光条件下使用倒置荧光显微镜进行成像。第二阶段的第1天，通过先用预热的PBS洗涤，然后每六孔板孔中加入1毫升预热的酶溶液，来解离由hPSC衍生的内胚层细胞。将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳环境中孵育三至五分钟，或直至细胞开始相互分离。在孔中将已脱落的细胞片层或单层细胞进行解离，并使用基础阶段半量培养基将脱落的细胞收集至一个15毫升聚丙烯离心管中。随后离心细胞，弃去上清液，并用1毫升无菌磷酸盐缓冲液重悬细胞沉淀。使用自动细胞计数仪计数细胞后，再次离心细胞并弃去上清液。随后将细胞沉淀重悬于适量含有Rock抑制剂的第二阶段分化培养基中。将重悬的细胞接种至1至50个包被有基底膜基质的培养板中，在37摄氏度及5%二氧化碳条件下孵育。24小时后，将培养基更换为不含Rock抑制剂的第二阶段分化培养基。第四阶段结束时，按照之前所示方法将细胞脱离，并收集至15毫升离心管中。然后离心细胞，弃去上清液，用PBS洗涤细胞，并将其解离为单细胞悬液。使用自动细胞计数仪计数细胞后，再次离心细胞，并将沉淀重悬于200微升预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）中。接着，将离心管置于低至中等转速的涡旋振荡器上，逐滴加入2毫升预冷的80%乙醇。盖紧管盖，将离心管略微倾斜放置于4摄氏度摇床中过夜。第二天，离心细胞，并用 PBS 洗涤沉淀，以分散任何固定的细胞团块。然后在摇床上于室温孵育至少一小时，或在 4 摄氏度过夜，对固定后的细胞进行封闭。接下来，为了对胰腺前体细胞标志物进行染色，将每种条件下的 200,000 个细胞（包括相应的同型对照、未染色对照和二抗对照）分装至 96 孔 V 型底板中。然后短暂离心，迅速翻转培养板以弃去上清液，避免丢失沉淀。接下来，在室温下将细胞与一抗在摇床上轻轻振荡孵育至少两小时。然后用TBST缓冲液通过在孔中反复吹打的方式洗涤染色后的细胞三次。再次离心细胞，弃去上清液，并向细胞中加入二抗。室温孵育30分钟后，用TBST缓冲液将染色后的细胞洗涤两次。然后离心培养板，将染色后的细胞重悬于100微升PBS中，置于避光的离心管内，随后在流式细胞仪上检测样品。与非优化方法相比，优化后的方案通过上调 PDX1 和 NKX6.1 的共表达，提高了胰腺前体细胞的分化效率。特别是将内胚层细胞解离并重新接种至新鲜基底膜基质上，同时延长第三阶段的培养时间，相较于未解离细胞的方案，显著增强了由 hPSCs 分化而来的胰腺前体细胞中 NKX6.1 的表达。采用优化方案生成的胰腺前体细胞中 SOX9 阳性细胞的数量也较未解离方法有所增加。此外，优化后的方法还产生了更高比例的增殖性NKX6.1阳性细胞，这些细胞共表达增殖标志物Ki67。为了提高效率，关键步骤是将HbA1来源的内胚层进行解离，然后延长第三阶段使用FGF信号激活和Hedgehog信号抑制的处理时间。利用该增强型方案可规模化生成胰腺前体细胞，这有助于研究人多能干细胞来源的胰腺β细胞的效率提升与成熟过程，并实现了对不同类型糖尿病的建模研究。

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Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

在2D培养系统中将人多能干细胞分化为胰腺β细胞前体

本研究描述了一种诱导人类胚胎干细胞向胰腺分化的定向分化方法。具有重要意义的发现是，内皮细胞共培养可介导由人类胚胎干细胞衍生的胰腺前体细胞成熟为表达胰岛素的细胞。...

内皮细胞共培养在定向分化策略中促进人胚胎干细胞向胰岛素生成胰腺细胞的成熟

本方案所述的三维培养方法可重现小鼠胚胎胰腺前体细胞发育为分支器官的过程，包括前体细胞的大量扩增、分化及形态发生。该方法适用于对微环境进行成像观察、功能干扰及操作干预。...

体外 从小鼠胚胎前体细胞诱导胰腺器官发生

本文介绍一种用于纯化已定向分化为定型内胚层的人胚胎干细胞的方法，旨在提升后续应用及进一步分化的效率。...

一种快速高效地纯化由人胚胎干细胞分化而来的内胚层细胞的方法

在此，我们描述了一种四阶段方案，用于将人类胚胎干细胞分化为NKX6-1阳性细胞。+ 胰腺前体细胞 体外...

高效地将多能干细胞分化为NKX6-1+胰腺前体细胞

本文描述了利用iCRISPR平台生成人多能干细胞（hPSC）突变细胞系以及将hPSC分化为葡萄糖响应性β样细胞的实验方案。将基因组编辑技术与hPSC定向分化相结合，为系统分析谱系决定因子在人类发育和疾病进展中的作用提供了强有力的平台。...

利用基因组编辑和hPSC定向分化探究人类胰腺发育中的谱系决定因子

本文介绍了一种详细的实验方案，通过解离的单细胞非克隆型单层培养方法，将人多能干细胞（hPSCs）分化为胰腺/十二指肠同源框蛋白1+（PDX1+）细胞，以生成胰腺谱系细胞。该方法适用于制备均一的hPSC来源细胞，并可用于基因操作与筛选。...

高效生成人多能干细胞在贴壁培养中分化为胰腺/十二指肠同源框蛋白1+ 后前肠/胰腺前体细胞

本方案比较了两种不同诱导方案在将人牙髓干细胞（hDPSCs）向胰腺谱系分化中的应用...

体外诱导人牙髓干细胞向胰腺谱系分化

干细胞向胰岛细胞的分化为传统的糖尿病治疗和疾病建模提供了替代方案。本文介绍了一种详细的干细胞培养方案，该方案结合商用分化试剂盒与先前已验证的方法，有助于在体外生成可分泌胰岛素的干细胞来源胰岛细胞。...

人多能干细胞向胰岛素分泌型胰岛样细胞团的分化

本文介绍了一种定向分化及功能分析类β细胞的方法。我们描述了在生成胰岛素分泌型胰腺细胞前，人多能干细胞所需的最佳培养条件和传代方法。该六阶段分化过程从定型内胚层形成开始，最终获得能够响应葡萄糖刺激而分泌胰岛素的功能性类β细胞。...

从人多能干细胞生成功能性胰岛素分泌胰腺细胞的优化方案

我们提供一种微创方案，用于将人干细胞来源的胰腺干细胞胰岛移植到免疫缺陷小鼠的肌肉内 体内...

小鼠肌肉内移植人多能干细胞衍生的胰腺内分泌细胞

学习在二维单层培养系统中将人多能干细胞分化为胰腺β细胞前体的方法。该优化方案通过调控PDX1和NKX6.1共表达，提高胰腺祖细胞分化效率，适用于糖尿病细胞治疗及早期胰腺发育机制研究。

人多能干细胞在二维培养系统中向胰腺β细胞前体的分化

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