Name: 转录组水平上人类原发性肠系膜动脉内皮细胞的分离和分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: 学习从人肠系膜动脉分离内皮细胞并进行转录组分析的方法。该技术无需分选步骤即可富集细胞群体，支持单细胞与空间转录组学研究，可用于探索糖尿病和肥胖等疾病的血管生物学机制。

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本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助，资助项目编号为 R01HL108735、R01HL145170、R01HL106089（授予 Z.B.C.）；DP1DK126138 和 DP1HD087990（授予 S.Z.）；Ella Fitzgerald 基金会资助项目及 Wanek 家族项目（授予 Z.B.C.）；以及人类细胞图谱种子网络资助项目（授予 Z.B.C. 和 S.Z.）。本出版物中报道的研究包括在希望之城综合基因组核心实验室完成的工作，该实验室由美国国立卫生研究院国家癌症研究所通过资助号 P30CA033572 提供支持。作者谨此感谢希望之城胰岛移植团队的 Ismail Al-Abdullah 博士和 Meirigeng Qi 博士在人组织分离方面的贡献，感谢希望之城 Dongqiang Yuan 博士在单细胞 RNA 测序分析方面的协助，以及约翰斯·霍普金斯大学医学院心血管病理学部 Marc Halushka 博士在血管组织学方面提供的宝贵见解。

人体组织研究使用了来自希望之城南加州胰岛细胞资源中心的去标识化样本。本研究使用尸体人体组织的研究同意书由捐赠者近亲提供，并已获得希望之城机构审查委员会（IRB 编号：01046）的伦理批准。
1. 物理解离（预计时间：1-2 小时）
<ol>
	<li>将一条新鲜动脉置于10 cm培养皿中，用无菌的Dulbecco磷酸盐缓冲液（D-PBS）冲洗。</li>
	<li>使用无菌镊子和解剖剪去除血管周围的脂肪组织和外层结缔组织，直至血管清洁。将尺子置于培养皿外侧，测量血管长度，并拍照记录。图1A).</li>
	<li>将适当的消化缓冲液预热至 37 °C：进行单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）时使用细胞解离酶；进行细胞培养实验时使用含 1–6 mg/mL Collagenase D、3 mg/mL 细菌来源蛋白酶、100 mM HEPES、120 mM NaCl、50 mM KCl、5 mM 葡萄糖和 1 mM CaCl₂ 的缓冲液26,38 （pH 7.0，无需调节），使用前5分钟加入。</li>
	<li>取肠系膜动脉（通常直径为6-8 mm），用剪刀沿纵轴剪开，以垂直打开血管腔。</li>
	<li>使用针将血管固定在黑色石蜡的四个角上，使内膜暴露在外（图1B).</li>
	<li>向内膜中加入1 mL预热的消化缓冲液。取无菌手术刀，轻轻刮擦血管腔内壁两次。 
	注意：该步骤的目的是分离内膜层，可能需要一定练习。施加的力度应足以去除内皮细胞，但不可过大，以免同时去除组织的深层结构，否则将降低内皮细胞的代表性。</li>
	<li>将消化缓冲液转移至一个5 mL离心管中。向内膜中加入1 mL消化缓冲液，轻轻吹打数次以收集剩余细胞，并将悬液转移至5 mL离心管中。于37 °C、150 rpm振荡孵育5 min。</li>
	<li>加入 2 mL M199 培养基（如进行单细胞 RNA 测序则使用 D-PBS）以终止酶反应。轻轻混匀后，在 4 °C 条件下以 600 ×g 离心 x g 5 分钟。</li>
	<li>弃去上清液，并将上清液单独保存，用于培养对照，以观察步骤1.8中所有细胞是否均被收集于沉淀中。用1 mL M199培养基（如进行单细胞RNA测序，则用D-PBS）重悬细胞沉淀。</li>
	<li>通过将10 µL台盼蓝与10 µL细胞悬液混合来评估细胞活力。使用血细胞计数板观察细胞形态并进行细胞计数。 
	&#8203;注意：此时细胞可用于蛋白质或RNA定量，或进行培养 体外 采用标准方案使用EC培养基进行培养39或者，可按照下一节所述方法进行测序文库制备。</li>
	<li>在培养时，用移液器将500 µL包被试剂加入6孔板的两个孔中，在室温下孵育30分钟进行包被。去除包被试剂后，用无菌D-PBS洗涤，将全部细胞悬液加入其中一个孔，将保留的上清液作为对照加入第二个孔。</li>
</ol>
2. 单细胞RNA测序研究的准备工作（预计时间：3-4小时）
<ol>
	<li>将步骤 1.11 的细胞储备液在 4 °C 条件下以 600 x g 离心 5 分钟。弃去上清液，使用 P1000 移液器和宽孔吸头在 1 mL 含 0.04% 牛血清白蛋白（BSA）的 D-PBS 中轻柔重悬沉淀。充分混匀以确保形成单细胞悬液。</li>
	<li>将溶液通过 40 µm 滤网以去除细胞碎片。如果仍有碎片残留，将溶液再次通过第二个滤网，收集至含有 4 mL 0.04% BSA 的 D-PBS 中。</li>
	<li>在 4 °C 条件下以 600 x g 离心 5 分钟。弃去上清液，使用带宽孔吸头的 P1000 移液器将沉淀重悬于 500 µL 含 0.04% BSA 的 D-PBS 中。充分混匀以确保形成单细胞悬液。</li>
	<li>通过将 10 µL 细胞储备液与 10 µL 台盼蓝混合来评估细胞活力。使用血细胞计数板观察细胞形态，确认是否存在无细胞团块的单细胞悬液，检查是否有组织碎片，并计算活细胞与死细胞的数量。</li>
	<li>如果细胞存在团聚或仍有碎片残留，需重复使用含 0.04% BSA 的 D-PBS 进行洗涤，或再次通过 40 µm 滤网。 
	注意：尽管此操作会降低细胞得率，但为获得最佳测序效果，确保细胞处于洁净的单细胞悬液状态至关重要。</li>
	<li>该单细胞悬液可用于单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）。</li>
</ol>
3. 空间转录组学分析（预计时间：3-4 小时）
<ol>
	<li>将异戊烷（2-甲基丁烷）加入金属罐中，并置于液氮（LN2）或干冰（LN2 更推荐使用液氮，因为其温度低于干冰。将最佳切割温度化合物（OCT）倒入已标记的塑料冷冻模具孔中，注意避免产生气泡，并去除出现的气泡。将冷冻模具置于干冰上冷却。</li>
	<li>至少截取两段冠状面的血管组织，每段长1 cm。使用长（12&#34;）镊子夹住组织，将其浸入异戊烷中直至冻结。迅速将组织浸入OCT包埋剂中，调整方向使管腔居中可见。注意去除所有气泡，尤其是紧邻组织的气泡。</li>
	<li>使用长（12&#34;）镊子夹住冷冻模具，将其固定在金属罐中。模具底部应浸入液体中，但不宜过深，以免异戊烷淹没组织。观察冷冻过程，OCT 从外向内逐渐变白，约需 1-2 分钟。</li>
	<li>将这些切片置于密封容器中，在 -80 °C 下保存，可存放长达 6 个月。 
	注意：所有样品必须始终置于干冰上，且不得超过一次冻融循环。该组织可用于组织学分析以及RNA/DNA荧光检测 原位 杂交（FISH）或空间转录组学，后者将在此进行描述。</li>
	<li>将冷冻切片机的腔室温度设置为 -20 °C，样本头温度设置为 -10 °C。将包埋于OCT中的血管切片、刀片、刷子和载玻片置于冷冻切片机中，在 -20 °C 下平衡约30分钟。在平衡期间，使用70%乙醇清洁可能接触切片的所有设备及仪器表面，包括刀片，随后用RNase去污染溶液处理。</li>
	<li>将少量OCT包埋剂滴加到圆形冷冻切片机样本块上，将样本置于其上，待其冻结前固定。将样本块放置于标本头中心位置，使用左侧的黑色长柄螺丝将其固定。切除血管周围多余的OCT包埋剂。</li>
	<li>将冷冻切片机的切片厚度设置为10 µm，切取约60个切片，并将其放入预冷的1.5 mL离心管中。这些切片将用于评估RNA质量。从冷冻切片机取出后，立即加入1 mL RNA提取试剂，涡旋振荡至切片完全溶解。</li>
	<li>加入200 µL氯仿，混匀直至溶液呈草莓奶昔状。在11,200 x g 4 °C 下离心 10 分钟。</li>
	<li>收集水相（位于白色和粉红色层上方的透明层），加入500 µL异丙醇。通过反复倒置离心管10次以上混匀，置于-80 °C环境中至少20分钟。</li>
	<li>在 11,200 离心 x 4 °C下离心10分钟。将纯化的RNA沉淀溶解于5 µL无RNase的水中。检测RNA完整性数值（RIN）。 
	注意：建议使用 RIN ≥ 7 的样本，但 RIN ≥ 6 的样本也可接受。根据所用系统不同，组织切片数量及用于溶解 RNA 的溶液体积可能需要优化，以确保最终 RNA 浓度处于 RIN 检测的有效范围内，从而实现准确的 RIN 评估。</li>
	<li>在使用商业化的组织优化或基因表达载玻片之前，应先在普通玻璃载玻片上练习正确切割和放置切片至定位标记框内。可通过在普通玻璃载玻片上绘制6.5 mm × 6.5 mm的方格，将其于冷冻切片机中冷却至-20 °C，随后将组织切片置于该捕获区域进行练习。</li>
	<li>使用防卷板切出10 µm切片，翻转后通过轻触切片周围包埋剂（OCT）使其小心展平。</li>
	<li>使用无RNase的冷冻切片机毛刷，仅利用周围的OCT包埋剂将组织切片放置于方框区域内。立即用戴手套的手指按压在捕获区域的背面，使切片融化并贴附于载玻片上。</li>
	<li>一旦切片贴附，立即将载玻片置于冷冻棒上，使切片冻结。操作时需注意避免组织折叠或组织覆盖定位框的标示边缘。必要时，可沿管腔使用刀片将组织切成两半或四等份，以确保血管切片完全置于6.5 mm × 6.5 mm的框架范围内。</li>
	<li>按照3.12–3.14步骤，将组织切成10 µm厚的切片，贴附于组织优化或基因表达载玻片上。将载玻片转移至置于干冰上的玻片邮寄盒中。在进行已发表的空间组学实验方案前，可于-80 °C保存最多4周。33,34.</li>
</ol>
4. 测序数据分析（预计耗时：最多1周，具体取决于对软件的熟悉程度）
注意：仅针对空间转录组学分析，请跳至步骤 4.8。单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）数据使用与人类 hg38 参考转录组比对的标准流程进行处理。采用 R 软件包 Seurat（v3.2.2）按照已发表的指南40分析 scRNA-seq 数据。
<ol>
	<li>使用成熟的质控指标进行筛选：去除基因数异常高的稀有细胞（可能为多重细胞）以及线粒体基因比例过高的细胞（此类细胞通常为低质量或正在死亡的细胞，常伴有线粒体污染）。</li>
	<li>使用以下方法对数据进行归一化处理 &#34;sctransform&#34;，一种相较于对数归一化可提高样本整合效果的方法。这些归一化后的数据用于降维和聚类分析，而基于基因表达水平的分析（如细胞类型分类）则使用对数归一化后的表达水平数据41.</li>
	<li>按细胞类型选择标记基因，例如 血小板内皮细胞黏附分子-1 (PECAM1）和 血管性血友病因子 (VWF用于ECs的） lumican (LUM）和 前胶原C-端肽酶增强因子 (PCOLCE成纤维细胞用） B细胞易位基因1 (BTG1）和 CD52 用于巨噬细胞， C1QA 和 C1QB 用于单核细胞，以及 肌球蛋白重链11 (MYH11）和 transgelin (TAGLN用于血管平滑肌细胞36.</li>
	<li>计算每对标志物在单细胞间的平均表达水平，从而为每种细胞类型获得一个与平均表达水平相关联的单一标志物42.</li>
	<li>对每个标记物在单细胞中的表达数据应用包含两个组分的高斯混合模型（GMM），以将细胞分为两组，即高表达该标记物和低表达该标记物。通过此方法，针对每个标记物，每个单细胞被分配至两个组分之一42.</li>
	<li>使用统计富集分析（Fisher精确检验）对标志基因集进行分析，从而为每个簇分配细胞类型。通过该方法，每个簇会获得一组p值，每个p值对应一种细胞类型。将p值最低的细胞类型分配给该簇。</li>
	<li>使用 Space Ranger 分析流程处理空间转录组数据，完成空间去条形码并生成质量控制（QC）指标，包括比对至 hg38 人类转录组的总读段数、每个点的中位 Unique Molecular Identifier（UMI）数或基因数35. 
	注意：采用 R 软件包 Seurat（v3.2.2）按照已发表的指南分析 Space Ranger 处理后的数据40.</li>
	<li>使用以下方法对数据进行归一化处理 &#34;sctransform&#34;一种相较于对数归一化更能改善下游分析的方法，尤其考虑到组织的异质性以及不同位点间计数的极高方差。</li>
</ol>

S.Z. 是 Genemo 公司的创始人兼董事会成员。

本方案详细描述了一套利用单细胞和空间分辨率对单个人体动脉组织中的内皮细胞（ECs）进行分析的技术。该实验流程中存在若干关键步骤和限制因素。转录组分析的一个关键是组织的新鲜程度和RNA的完整性。在处理前应尽可能将组织保持在冰上，以最大限度地减少RNA降解。通常情况下，尸源组织在死亡后8至14小时内进行处理。然而，建议在从供体取出组织后尽快开始细胞分离或冷冻保存操作。对于空间转录组分析，组织应保存在干冰上，并且最多只能经历一次冻融循环。为确保实验可重复，应将多个血管横截面包埋于OCT包埋剂中。在组织处理和细胞分离过程中，还应努力维持无RNase的环境。其次，血管的尺寸可能构成限制因素。对于空间转录组学分析，无论血管直径如何，实验可在总长度为1 mm的血管片段上进行。而对于用于细胞培养和单细胞RNA测序（scRNA-seq）的组织解离流程，其下限是血管过于狭窄（即直径小于1 mm），以致无法插入解剖剪刀。根据这些原则，只要血管尺寸允许充分展开，解离流程可适用于任何中等或更大尺寸的动脉或静脉；而空间转录组分析则可应用于能够完全或部分放入定位标记框架内的任何血管。
为进行单细胞转录组分析的组...

血管腔内壁的内皮细胞（ECs）是血管张力和组织灌注的关键调节者。ECs能够感知细胞外环境，并适应血流动力学和成分的变化，表现出显著的应答能力。这些动态反应通过复杂的细胞内信号网络介导，包括具有时空分辨率的转录和转录后调控。这些反应的失调与多种病理状态相关，包括但不限于心血管疾病、糖尿病和癌症1,2。
大量研究利用细胞系或动物模型来分析内皮细胞转录组。前者因其操作简便且成本较低而成为一种有用的工具。然而，长期连续培养可能导致内皮细胞出现表型改变，例如成纤维细胞样特征以及极性缺失，使其与体内真实状态脱节 体内 状态3原代细胞，例如人脐静脉内皮细胞（HUVEC），自20世纪80年代以来一直是常用选择，但其来源于发育期的血管床，该结构在成人中并不存在，因此难以完全代表成熟的内皮细胞（EC）。动物模型，尤其是小鼠模型，能更好地模拟内皮细胞的生理或病理生理环境，并可用于研究基因扰动所导致的转录组变化。可通过基于酶消化的方法从小鼠多种组织（包括主动脉、肺和脂肪组织）中分离获取小鼠内皮细胞。4,5,6,7然而，分离的细胞除非经过转化，否则不能用于多次传代6 且数量通常有限，因此需要从多只动物中合并样本5,8,9.
探索血管结构在转录组水平（尤其是单细胞分辨率下）的新技术的出现，通过揭示内皮细胞（ECs）的新功能和特性，开启了内皮生物学的新时代5, 10,11,12,13,14。Tabula Muris 研究团队建立了一个丰富的资源库，收集了来自20个不同小鼠器官的10万个细胞（包括内皮细胞）的单细胞转录组谱15，揭示了共有的内皮细胞标志基因以及具有组织间和组织内差异的独特转录组特征5,13。然而，小鼠与人类在基因组、表观基因组和转录组方面存在明显差异，尤其是在非编码区域16,17,18。上述局限性凸显了利用人类样本分析内皮细胞的重要性，以获得健康和疾病状态下内皮细胞在其原生状态中的真实图谱。
大多数内皮细胞（EC）分离方法依赖于通过匀浆、精细切割和切碎组织进行物理性解离，随后在不同时间点加入蛋白水解酶进行孵育。所使用的酶种类和反应条件因组织类型而异，从单独或联合使用胰蛋白酶到胶原酶均有涉及19,20,21。为进一步提高内皮细胞的纯度，通常还包括基于抗体的富集或纯化步骤。一般采用针对内皮细胞膜标志物（如 CD144 和 CD31）的抗体，将其偶联到磁珠后加入细胞悬液中22,23。该策略可广泛适用于从小鼠和人类多种组织中分离内皮细胞，包括本实验方案中介绍的技术。
在天然状态下，内皮细胞（ECs）与多种细胞类型相互作用，可能存在于细胞邻近性对功能至关重要的血管微环境中。尽管单细胞和单细胞核RNA测序（scRNA和snRNA-seq）研究在揭示EC异质性方面取得了重要突破，但组织解离过程会破坏组织微环境和细胞间接触，而这些因素对于理解EC生物学同样重要。空间转录组分析技术于2012年开发，并于2020年被命名为“年度方法”24，已被用于在保留多种组织空间特征的同时分析全局基因表达，包括脑组织25、肿瘤26和脂肪组织27。该技术可分为靶向型，即使用特异性结合特定RNA序列的探针，并连接亲和试剂或荧光标签，从而在亚细胞分辨率下检测特定基因28,29,30,31；也可为非靶向型32,33，通常利用空间条形码寡核苷酸捕获RNA，随后共同转化为cDNA，用于后续测序文库构建，因而具有无偏倚推断整个组织基因表达的优势。然而，目前商业化的技术尚无法在单细胞水平上实现空间分辨率。这一局限性可在一定程度上通过与scRNA-seq数据整合加以克服，最终实现在复杂组织背景下保留原始空间信息的同时，对单细胞转录组进行定位解析34。
本文描述了一种利用人肠系膜上动脉进行内皮细胞转录组分析的工作流程，该外周动脉已被用于研究血管舒张、血管重塑、氧化应激和炎症35,36,37。文中介绍了两种技术：1）通过机械解离与酶消化相结合的方法，从血管内膜中分离并富集内皮细胞，适用于单细胞转录组测序或后续的in vitro培养；2）制备动脉组织切片以进行空间转录组分析（图1）。这两种技术可独立使用，也可联合应用，以全面分析内皮细胞及其周围细胞的转录特征。此外，该工作流程可适用于任何中型或大型动脉。

<table><tbody><tr><td>1.5 mL 微型离心管</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>10 cm 培养皿</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-202</td><td></td></tr><tr><td>23G针头</td><td>BD</td><td>305145</td><td></td></tr><tr><td>2-甲基丁烷</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>AC327270010</td><td></td></tr><tr><td>40 &amp;micro;m 细胞筛</td><td>Fisher</td><td>14100150</td><td></td></tr><tr><td>4200 TapeStation 系统</td><td>安捷伦科技</td><td>G2991BA</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 离心管</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>14282300</td><td></td></tr><tr><td>6孔板</td><td>Greiner Bio-One</td><td>07-000-208</td><td></td></tr><tr><td>黏附因子</td><td>细胞应用</td><td>123-500</td><td>方案中的贴壁试剂</td></tr><tr><td>黑色石蜡</td><td></td><td></td><td>任何市售的黑色石蜡均可使用</td></tr><tr><td>经热激处理的牛血清白蛋白</td><td>Fisher</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher</td><td>BP510</td><td></td></tr><tr><td>离心</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Fisher</td><td>C607</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶D</td><td>罗氏</td><td>11088866001</td><td></td></tr><tr><td>冷冻切片机</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>冷冻切片机刷子</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-葡萄糖</td><td>Fisher</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜</td><td>Fisher</td><td>MT25950CQC</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>罗氏</td><td>4942078001</td><td>方案中源自细菌的蛋白酶</td></tr><tr><td>一次性安全手术刀</td><td>Myco 仪器设备</td><td>6008TR-10</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>14080055</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Fisher</td><td>BP2818-4</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Fisher</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>Fisher</td><td>267110</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3375-100g</td><td></td></tr><tr><td>高灵敏度 D1000 样品缓冲液</td><td>安捷伦科技</td><td>5067-5603</td><td></td></tr><tr><td>高灵敏度 D1000 胶带检测</td><td>安捷伦科技</td><td>5067-5584</td><td></td></tr><tr><td>培养箱</td><td></td><td></td><td>保持在 37 &amp;deg;C 5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>Fisher</td><td>BP26324</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher</td><td>P217-3</td><td></td></tr><tr><td>液氮</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Medium 199</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2520-10X</td><td></td></tr><tr><td>金属罐</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>显微镜</td><td>Leica</td><td></td><td>评估细胞形态</td></tr><tr><td>微血管内皮细胞培养基</td><td>细胞应用</td><td>111-500</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S271-1</td><td></td></tr><tr><td>新不伦瑞克 Innova 44/44R 轨道摇床</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>最佳切割温度化合物</td><td>Fisher</td><td>4585</td><td></td></tr><tr><td>塑料冷冻模具</td><td>Fisher</td><td>22363553</td><td></td></tr><tr><td>RNA 筛选胶带</td><td>安捷伦科技</td><td>5067-5576</td><td></td></tr><tr><td>RNA 筛选 胶带样品缓冲液</td><td>安捷伦科技</td><td>5067-5577</td><td></td></tr><tr><td>RNase ZAP</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>无RNase水</td><td>Takara</td><td>RR036B</td><td>试剂盒中的无RN酶水（2）</td></tr><tr><td>无菌 12&quot; 长柄镊子</td><td>F.S.T</td><td>91100-16</td><td></td></tr><tr><td>无菌细镊子</td><td>F.S.T</td><td>11050-10</td><td></td></tr><tr><td>无菌精细剪刀</td><td>F.S.T</td><td>14061-11</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost PLUS Gold 载玻片</td><td>Fisher</td><td>1518848</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol试剂</td><td>Fisher</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td>康宁</td><td>MT25900CI</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express 酶（1X）酚红</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>12605010</td><td>方案中的细胞解离酶</td></tr><tr><td>Visium 附件试剂盒</td><td>10X Genomics</td><td>PN-1000215</td><td></td></tr><tr><td>Visium Gateway 试剂盒，2 次反应</td><td>10X Genomics</td><td>PN-1000316</td><td></td></tr><tr><td>Visium 空间基因表达载玻片 &amp;amp; 试剂盒，4 次反应</td><td>10X Genomics</td><td>PN-1000184</td><td></td></tr></tbody></table>

分离和在转录组水平上分析人原代肠系膜动脉内皮细胞

Isolation and Profiling of Human Primary Mesenteric Arterial Endothelial Cells at the Transcriptome Level

内皮细胞（ECs）通过动态响应环境信号，在血管及全身功能中发挥关键作用。阐明ECs的转录组和表观基因组对于理解其在发育、健康和疾病中的功能至关重要，但受限于原代细胞分离的可获得性。近年来的技术进步使得EC转录组和表观基因组的高通量分析成为可能，从而鉴定出此前未知的EC亚群及其发育轨迹。尽管EC培养是研究EC功能与功能障碍的有用工具，但培养条件和多次传代可能引入外部变量，改变原代EC的特性，包括形态、表观遗传状态和基因表达程序。为克服这一局限，本文介绍了一种从供体肠系膜动脉中分离人原代EC的方法，旨在捕获其天然状态。利用特定酶对内膜层中的EC进行机械和生化解离。所获得的细胞可直接用于批量RNA测序或单细胞RNA测序，也可接种进行培养。此外，本文还描述了用于空间转录组学的人类动脉组织制备流程，特别适用于一种商业化的平台，但该方法同样适用于其他空间转录组分析技术。该方法可应用于从不同健康或疾病状态供体获取的多种血管，以深入理解内皮细胞生物学中关键的转录和表观遗传调控机制。

此处展示了使用机械法与酶解法联合分离或冷冻保存肠系膜动脉内皮细胞（ECs），以用于多种下游检测的分析流程（图1）。可通过以下步骤对肠系膜动脉中的内皮细胞进行分析：A）通过从内膜进行机械分离并结合胶原酶消化以培养细胞；B）制备单细胞悬液用于单细胞RNA测序（scRNA-seq）；或 C）将动脉横切面包埋于OCT包埋剂中，进行冷冻切片以分析空间转录组（图1 和 图2）。
<img alt="动脉组织分析流程：组织样本、内膜暴露、H&amp;E 染色、空间转录组学示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63307/63307fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 1"> 
图 ...

本方案描述了从人肠系膜动脉中分离、培养和分析内皮细胞的方法。此外，还提供了一种用于空间转录组学研究的人体动脉组织制备方法。对分离的细胞可进行蛋白质组学、转录组学及功能检测。该方案可适用于任何中型或大型动脉。

内皮细胞（ECs）通过动态响应环境信号，在血管和全身功能中发挥关键作用。阐明……

在转录组水平上表征基因表达对于理解健康和疾病状态下的细胞功能至关重要。我们的方法专注于从人类供体的肠系膜动脉中捕获血管壁关键层——内皮细胞，以进行具有单细胞和空间分辨率的转录组分析。该方法可在无需分选步骤的情况下富集血管来源的内皮细胞群体，从而避免因分选导致的细胞损失。此外，还存在其他细胞类型，可用于在组织环境中研究细胞间的相互作用。我们已利用该技术研究糖尿病和肥胖症中的动脉变化。根据血管的可获取情况，这些技术还可被重新用于探索其他脉管系统及其他疾病中的生物学过程。如果是第一次操作，有两个关键步骤需要大量练习：一是刮取，应施加适当力度以去除完整细胞，同时不剥离更深层的组织；二是冷冻切片机切片。确保切片处于低温、平整状态，并位于特制载玻片的限定范围内。本次操作演示由本实验室的两位博士后研究人员 Yingjun Luo 和 Xiaofang Tang 进行。首先用 DPBS 清洗组织。使用无菌镊子和解剖剪去除脂肪及外层结缔组织，直至血管洁净。将尺子置于培养皿外侧，测量血管长度，并拍摄记录照片。用剪刀沿纵轴剪开肠系膜动脉，以垂直打开血管腔。 使用针头将血管固定在黑色石蜡的四个角上，暴露内膜。向内膜加入一毫升预热的消化缓冲液。使用无菌手术刀，轻轻刮擦血管管腔两次。将消化缓冲液转移至离心管中。向内膜中加入1 mL消化缓冲液，轻轻吹打数次以收集剩余细胞，并将细胞悬液转移至离心管中。将细胞置于37°C孵育箱或摇床中孵育5分钟。加入 M199 培养基至细胞悬液中以终止酶促反应，并轻轻混匀。在 4°C 条件下以 600 × g 离心 5 分钟。离心结束后，移去上清液并单独保存，作为对照培养物，用于观察是否所有细胞均已被收集在沉淀中。随后，将细胞沉淀重新悬浮于 1 毫升 M199 培养基中。通过将10微升台盼蓝与10微升细胞悬液混合，评估细胞活力。使用血细胞计数板观察细胞形态并进行细胞计数。在室温下，向六孔板的两个孔中各加入500微升包被试剂，孵育30分钟，以完成包被。用无菌 DPBS 洗涤各孔后，将全部细胞储备液加入一个孔中，上清液作为对照保留并加入第二个孔中。将预先制备的细胞储备液在 4 摄氏度、600 × g 条件下离心 5 分钟。弃去上清液，用 P-1000 移液器在含 0.04% BSA 的 DPBS 中轻轻重悬沉淀。充分混匀以确保形成单细胞悬液。将溶液通过40微米细胞筛，去除细胞碎片。然后，离心悬液，并按演示操作弃去上清液。使用P-1000移液器将沉淀重悬于500微升含0.04% BSA的DPBS中，并充分混匀以确保形成单细胞悬液。如先前所述，使用台盼蓝评估细胞活力。通过血细胞计数板或自动细胞计数仪观察单细胞悬液的形态，检查是否存在组织碎片，并计算活细胞与死细胞的数量。将异戊烷加入金属罐后，置于液氮或干冰中冷却。将OCT包埋剂倒入已标记的塑料冷冻模具孔中，避免产生气泡。将冷冻模具置于干冰上冷却。沿血管长度方向至少切割两段一厘米长的冠状切片。使用12英寸镊子将组织浸入异戊烷中直至冻结。迅速将组织浸入OCT包埋剂中，调整方向使管腔居中可见。将冷冻模具置于干冰上并固定位置，观察其冷冻过程。OCT 从外向内逐渐变白，耗时约一至两分钟。将这些切片存放在密封容器中，于负80摄氏度条件下可保存长达六个月。设置冰冻切片机腔室和样本头所需的温度。将包埋在OCT中的血管切片、刀片、刷子和载玻片在冰冻切片机中于-20摄氏度平衡约30分钟。在平衡期间，使用70%乙醇清洁可能接触切片的所有设备（包括刀片）及机器，随后用RNase去污染溶液处理。通过将少量OCT包埋剂滴加到圆形冷冻切片机样本块上，并在包埋剂冻结前将样本放置其上，以固定样本。将样本块置于样本头中心后，使用左侧的黑色长柄旋紧固定。切除血管周围多余的OCT包埋剂。将冷冻切片机的切片厚度设置为10微米，切取约60个切片，并将其放入含有RNA提取试剂的预冷1.5毫升离心管中。涡旋振荡直至切片完全溶解。按照文稿中所述方法提取RNA，并将纯化后的RNA沉淀溶解于5微升无RN酶的水中。使用防卷板切出10微米厚的切片。翻转切片，并通过轻轻触碰周围OCT包埋剂的方式小心展平。用乙醇擦拭载玻片，并用手指预热捕获区域的背面。使用无RNase的冷冻切片机毛刷或直接用载玻片，仅利用周围的OCT包埋剂将组织切片放置于方框内。立即将一根手指按压在捕获区域背面，使切片融化并贴附于载玻片上。一旦切片牢固黏附，即将载玻片置于冷冻条上，使切片重新冻结。 按照先前所述方法，将10微米厚的组织切片切至组织优化或基因表达载玻片上。将载玻片转移至置于干冰上的玻片邮寄盒中。该图显示了使用所述方案培养的分离内皮细胞（ECs），呈现出典型的鹅卵石样形态，且污染细胞极少。通过免疫荧光检测细胞间连接处，确认了内皮细胞标志物血管内皮钙黏蛋白的表达。约80%的细胞CD31呈阳性，表明人肠系膜动脉内皮细胞构成了新鲜分离细胞群体的大部分。分离失败会导致细胞形态异常，可能表达间充质标志物或伸长呈成纤维细胞样状态。该图展示了采用本方案对分离的人肠系膜动脉内皮细胞（ECS）进行单细胞RNA测序后，通过均匀流形近似与投影（UMAP）方法获得的代表性聚类结果，其中使用PECAM1和VWF作为标志物，34%的细胞被聚类为内皮细胞（ECs）。高质量的RNA其RNA完整性数值（RIN）应不低于6，且28S与18S核糖体RNA条带的比值应尽可能接近2。当RNA发生降解时，这些核糖体RNA信号可能变弱或消失。苏木精和伊红染色可显示血管的形态，从而识别出感兴趣区域。基因表达信息通过与苏木精-伊红染色血管的组织空间定位进行可视化。操作组织和细胞样本时需谨慎，以保持RNA质量，尤其是在进行空间转录组分析时。将组织置于干冰上以减少 RNA 降解。同时，使用预冷的器械操作切片和组织。我们已能够探究内皮细胞基因表达的变化，包括糖尿病背景下长链非编码 RNA（LncRNA）及其与其他细胞类型的相互作用。我们可以利用空间转录组学分析技术推断出这些转录组变化的位置。

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