使用共聚焦显微镜以高时间分辨率记录小鼠神经肌肉接头中的钙瞬变

估算突触前钙水平是研究突触传递的关键任务。研究钙信号传导对于寻找治疗神经退行性疾病的方法也具有重要意义。该负载技术的主要优势在于染色仅针对感兴趣细胞进行。

我们的钙瞬态记录方法具有极好的时空分辨率。所介绍的配准方法可为需要使用共聚焦显微镜对快速周期性过程进行配准的神经生理学家提供帮助。在加载技术中，最具挑战性的步骤是将神经固定在移液管内。

移液管的直径必须完全匹配，因此需制作多个备用。掌握本方案中的所有步骤较为复杂，而逐一进行演示将大有帮助。首先，用细不锈钢针将耳长提肌组织以轻微拉伸的状态固定在涂有弹性体的培养皿中，并向培养皿中加入任氏液，直至完全浸没肌肉组织。

接下来，使用微电极拉制仪制备具有精细尖端的微电极，用于细胞内记录。使用无内丝的毛细管。用砂纸在锥形部位划痕后，折断微电极尖端，使尖端开口直径约为 100 微米。

然后，将尖端进行火焰抛光，直至其内径从 80 微米缩小至 12 微米。完成后，将硅胶管连接至填充移液管的一端，另一端连接无针头的注射器。在体视显微镜下，找到神经干转变为独立神经分支的位置。

用石蜡将充填移液管固定在培养皿上，然后移动移液管尖端，使其位于神经上方。用精细剪刀在靠近肌纤维处剪断神经，保留一小段神经残端，长约1毫米。随后，用一些任氏液将神经残端吸入充填移液管的尖端内，注意不要夹压神经。

完成后，将硅胶管从灌注移液管上取下。随后，使用带有长丝状针头的注射器吸取染料负载溶液。然后，将含有负载溶液的丝状针头插入灌注移液管中，并将混合物释放到神经残端上，接着将神经标本在室温避光条件下孵育30分钟。

孵育后，用新鲜的任氏液冲洗神经标本，然后将其置于玻璃烧杯中，加入50毫升任氏液，在25摄氏度下处理两小时。进行共聚焦显微镜观察时，将神经标本置于涂有硅酮弹性体的实验腔室内，并用一组不锈钢微针将其轻微拉伸并固定。随后，用任氏液充分冲洗标本。

在腔室上安装吸电极。将制备腔室固定到显微镜载物台上后，将进液和出液接头放入腔室内。开启重力驱动流动系统，以去除制备样本中的过量溶液。

完成后，将刺激用的吸电极插入电刺激器，并确保刺激后可引发肌肉收缩。然后，用含有10微摩尔筒箭毒碱的任氏液填充灌流系统，并打开灌流抽吸泵以开始灌流。在激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）软件中，选择电生理和采集模式以设置成像参数。

在任务菜单设置中，选择触发设置，使用显微镜同步脉冲触发刺激器，并将帧场触发输出设置为 OUT 1 通道。将扫描模式设为 XYT，扫描频率为 1,400 赫兹。缩放倍数应为 6.1，针孔完全打开。

确保启用连续、跨帧、双向X模式，然后将形成一帧的最短时间设为52毫秒，并以20帧采集原始视频图像。将氩激光的激发波长设为488纳米，输出功率为8%。参数设置完成后，按下实时模式按钮，以获得染料标记的神经末梢的实时预览图像。

在实时模式下，搜索感兴趣区域（ROI）以获得最佳焦距。然后，将刺激器的延迟相对于先前值减少两毫秒，并运行数据采集软件，通过将每个序列相对于前一个序列偏移两毫秒，共采集26个序列。为处理所捕获的视频，运行 Leica Application Suite X（LAS X）软件，并打开已创建的项目。

然后，单击导出并选择“另存为”，将帧以 TIF 格式保存到目标文件夹中。接着，运行 ImageJ 软件，单击文件、导入、图像序列。在打开图像序列窗口中，选择目标文件夹并打开第一帧。

在序列选项中，进入起始图像字段，并将帧编号设置为第一帧的帧号1。然后，在增量字段中，将数值设置为初始信号记录中的帧数，再点击确定。若要将拼接后的首帧生成文件保存到单独的文件夹中，请依次点击文件、保存和文件夹标签。

通过在起始图像字段中设置相应的帧编号，对19帧重复上述步骤。当所有图像获取完成后，单击文件、导入和图像序列，然后在起始图像和增量字段中进行选择。最终可看到所有帧以更高时间分辨率拼接而成的视频。

然后，将视频文件保存为 TIF 格式。要分析拼接的视频，请点击图像、堆栈、工具和堆栈排序器。接着，进入分析、工具和 ROI 管理器。

将之前保存的 TIF 文件拖放到 ImageJ 窗口中，然后展开图像以获得更好的视野。为改善图像可视化效果，请单击图像，调整亮度对比度至自动模式。通过绘制 ROI 并将该区域添加至 ROI 管理器，将背景设定在接近神经末梢的位置。

然后，点击“更多”和“多点测量”以计算背景值。将平均值复制并粘贴到电子表格程序中，然后计算平均值。

接下来，通过点击 process（处理）、main（主菜单）和 subtract（减去）来从图像序列中减去计算得到的平均值。输入获得的数值后，使用多边形线条在神经末梢周围绘制感兴趣区域（ROI），并将其添加到 ROI 管理器中。通过点击 more（更多）和 multi measure（多点测量）选项卡，测量神经末梢的瞬时强度。

然后，复制平均荧光强度值并将其粘贴到电子表格程序中，以计算信号的平均偏移量。将信号值除以平均偏移量值。用所得数值减去1，再乘以100%，随后绘制钙瞬变曲线图以确定其幅度。

在用染料加载神经标本后，大部分突触位于神经断端附近，表明荧光水平足够。经过图像处理，获得了具有理想空间和时间分辨率的钙瞬变信号。本方案中最重要的步骤之一是：在切断神经后的最初几分钟内，必须将神经断端置于含有染料的溶液中。

该方法可用于将多种染料和药物导入运动神经元。记录方案可用于评估中枢神经系统标本中树突和树突棘内的钙离子水平。我们的技术能够以良好的空间和时间分辨率记录钙信号。

研究钙瞬变是研究神经递质释放和突触可塑性调控的有力工具。