即用型qPCR，用于检测 克氏锥虫 或其他致病微生物的DNA

凝胶化方案可产生即用型qPCR反应，从而减少开始运行所需的时间和步骤。该协议允许一次生产和控制qPCR反应的质量和大量，从而减少了配方计算过程中操作员错误或等分到孔中的机会。该方法可以应用于任何已经以传统冷冻形式完全优化的qPCR。

这种方法的视觉演示很重要，因为两个主要的质量控制步骤是可视化的。要制备蜜糖溶液，称取四克蜜糖在15毫升塑料管中，加入六毫升无核酸酶的水，并以最大速度涡旋直至粉末溶解。用不含核酸酶的水将最终体积制成 10 毫升，然后标记并将溶液在 2 到 8 摄氏度下储存长达六个月。

要制备海藻糖溶液，请在15毫升塑料管中称取4克海藻糖，加入6毫升无核酸酶的水，并以最大速度涡旋直至粉末溶解。然后用不含核酸酶的水将体积补足至10毫升，并通过0.2微米过滤器过滤溶液。将溶液标记并在 2 到 8 摄氏度下储存长达六个月。

要制备糖原溶液，在15毫升的管中称取两克糖原，加入6毫升无核酸酶的水，涡旋直至粉末溶解。将溶液保持在 2 到 8 摄氏度 8 到 12 小时，因为糖原的溶解会产生大量气泡。第二天，从孵育中取出溶液，用无核酸酶的水将体积补足至10毫升，并将标记的溶液在2至8摄氏度下储存长达六个月。

要制备赖氨酸溶液，在15毫升的管中称取7.5毫克赖氨酸，加入6毫升无核酸酶的水，涡旋直至粉末溶解。用不含核酸酶的水将体积补足至10毫升。通过0.2微米过滤器过滤溶液，并在2至8摄氏度下储存长达六个月。

为了制备凝胶化混合物，在50毫升塑料管中混合适当体积的储备溶液。通过将试管倒置10次来混合试剂，并将标记的溶液在2至8摄氏度下储存长达三个月。要制备用于凝胶化的qPCR预混液，请在冷藏容器中解冻试剂。

然后在1.5毫升管中混合适当体积的试剂，以制备足够的预混液用于八管条或96孔板。接下来将18.5微升凝胶化预混液移液到每个反应孔中，并将管或板置于真空箱内的导热支架中。如果使用 96 孔板，则每两个 96 孔板在烤箱中放置一个膨润土粘土袋以进行吸水。

循环完成后，检查试管或板的试剂是否正确凝胶化，确保体积明显减少到约五微升，并且用手指敲击试管或板时液体不会移动。使用前将试管或板密封并存放在 2 至 8 摄氏度下 8 至 12 小时。要使用凝胶化的qPCR，请从冰箱中取出试管条或板，然后在工作站中打开以进行样品操作。

向每个反应容器中加入15微升无核酸酶水和5微升DNA样品。密封试管或板，运行所需的实验，并进行定期数据分析。在本协议中，腔室内的温度保持在30摄氏度，而压力在910至930毫巴之间变化，接近真空。

在真空循环之后，管内的预混液体积减小，底部凝胶化，并且在敲击管子时不会溅到壁上。如果凝胶化不完全，则当敲击管子时，液体会飞溅到管壁上。此处显示了使用已发表的寡核苷酸序列进行克氏锥虫 DNA 检测。

当凝胶化未正确执行时检测同一样品会导致灵敏度下降。最关键的一步是在凝胶化之前计算试剂体积。操作员必须记住不要加水，因为在此过程中会将其移除。

如果严格遵守方案步骤，具有基本实验室和分子生物学技能的操作人员将毫不费力地执行凝胶化过程。