Name: 荧光蛋白中脯氨酸类似物对脯氨酸的残基特异换:骨架的分子手术如何影响折叠和稳定性 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-03T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: 了解将脯氨酸类似物掺入荧光蛋白以研究蛋白质折叠和功能的方法。该技术通过分子手术实现蛋白质骨架的精确修饰，无需昂贵设备即可探索脯氨酸残基对蛋白质稳定性的影响。

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本工作由德国研究基金会（催化统一系统卓越集群）资助 T.F. 和 N.B.，以及由联邦教育与研究部（BMBF 计划“HSP 2020”，TU-WIMIplus 项目 SynTUBio）资助 F.-J.S. 和 T.M.T.T.。

1. 将表达质粒导入感受态原养缺陷型 E. coli 细胞
<ol>
	<li>将每种样品质粒（pQE-80L H6-EGFP、pQE-80L H6-NowGFP 和 pQE-80L H6-KillerOrange）各 1 ng 与 50 µL 化学感受态或电感受态的原养型缺陷型 E. coli K12 衍生菌株 JM83（Addgene #50348 或 ATCC #35607）混合，按照现有方案通过热激法或电穿孔法进行转化46,47。 
	注意：表达载体 pQE-80L EGFP-H6 编码C端带有6×His标签的增强型绿色荧光蛋白（EGFP），表达载体 pQE-80L H6-NowGFP 和 pQE-80L H6-KillerOrange 分别编码N端带有6×His标签的 NowGFP48 或 KillerOrange49，均构建于 pQE-80L 质粒骨架中。所有目标基因均由受 lac 操纵子调控的细菌 T5 启动子驱动表达。以氨苄青霉素抗性作为筛选标记，colE1 作为复制起点。有关 pQE-80L 质粒的更多信息，请参见材料表。亦可使用源自 K-12 和 B 菌株的其他原养型缺陷型 E. coli 进行表达，结果应相似。经发色团成熟后，H6 标签标记的单质子化野生型蛋白（[M+H]+）的理论分子质量分别为：27,745.33 Da（EGFP-H6）、27,931.50 Da（H6-NowGFP）和 27,606.09 Da（H6-KillerOrange）。目标蛋白的一级结构见表1（His标签序列下划线标出）。NowGFP cDNA 经 Pletnev 等人51 提供并亚克隆至 pQE-80L 质粒后，通过DNA测序确认其His标签序列中含有谷氨酰胺（Q）。该残基不影响蛋白纯化或荧光蛋白的性质。</li>
	<li>将细胞在 950 µL SOC 培养基中，37 °C 下恢复培养 1 小时。</li>
	<li>取 50 µL 恢复后的菌液涂布于含葡萄糖（10 g/L）和氨苄青霉素（100 µg/mL）的LB琼脂（LA）培养基平板上（见补充材料）。</li>
	<li>将LA培养基平板在37 °C下过夜培养，或在30 °C下培养24小时。</li>
</ol>
2. 重组野生型荧光蛋白（含有经典脯氨酸）的制备及选择性压力掺入法（SPI）制备含脯氨酸类似物（S-Flp、R-Flp、Dfp、Dhp）的荧游戏副本
<ol>
	<li>营养缺陷型前体菌的过夜培养 E. coli 源自K12的JM83菌株，携带pQE-80L EGFP-H6pQE-80L H6-NowGFP，以及 pQE-80L H6-KillerOrange
	<ol>
		<li>使用无菌移液枪头或接种环从LA培养基平板上挑选单个菌落，并将菌体悬浮于5 mL的Luria-Bertani（LB）培养基中（参见 补充材料含10 g/L葡萄糖， 100 &#181;g/mL 氨苄青霉素）加入无菌的14 mL聚苯乙烯培养管中。 
		注意：建议使用新鲜转化的菌落进行接种。步骤 2.2 中所述 LA 培养基平板上的菌株可保存于 4 &#176;C 应在几天内使用。</li>
		<li>将细胞培养物在过夜培养 37 &#176;C 在200-250 rpm的摇床中震荡。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>重组EGFP-H的制备6，H6-现在GFP和H6-含天然脯氨酸的KillerOrange及含脯氨酸类似物的相应蛋白质变体
	<ol>
		<li>接种200 mL新鲜NMM培养基（7.5 mM (NH4)2SO4，50 mM K2HPO4 和 22 mM KH2PO4，8.5 mM NaCl，1 mM MgSO₄4，20 mM D-葡萄糖， 1 &#181;g/mL FeCl2, 1 &#181;g/mL CaCl2, 10 &#181;g/mL 硫胺素， 10 &#181;g/mL 生物素, 0.01 &#181;g/mL 微量元素（CuSO₄4, ZnCl2，MnCl2，（NH4)2MoO4），pH 约 7.2，含所有标准 L-氨基酸（50 mg/L）；参见 补充材料) 加入补充 100 &#181;g/mL 氨苄青霉素与2 mL过夜培养物在2 L锥形瓶中混合。 
		注意：根据蛋白质的类型，可选用其他培养基，如 MOPS 培养基52葡萄糖-矿物盐培养基53，戴维斯最低培养基54M9 最小培养基55，或 GMML56 可用于优化蛋白质产量。</li>
		<li>将细胞置于培养环境中孵育 37 &#176;C 在220 rpm的轨道摇床中振荡约3小时30分钟。</li>
		<li>在600 nm处测定光密度（OD600在分光光度计中每30分钟测定一次，直至OD600 达到约 0.7 的值。 
		注意：对于 OD600 在分光光度计中测定，比色皿的光程应为1 cm。以相应的培养基作为空白对照（&#34;零&#34;）测量。从孵育开始至 OD600 ~0.7 的值可能取决于培养液体积，3 小时 30 分钟仅为近似值。在本方案的 2.2.1–2.2.3 步骤的变体中，使用 2.1.2 步骤的培养物接种新鲜 NMM&#916;Pro 培养基（参见 补充材料) 并添加有限浓度的脯氨酸（例如 5 mg/L 而非 50 mg/L），细胞在 37°C 下过夜培养 37 &#176;C 在220 rpm的轨道摇床上。第二天，OD600 每30分钟测定一次，直至连续两次测量值之间的差异小于0.05。最大OD600 值应约为 1&#177; 0.3）。初始的有限脯氨酸浓度可根据表达菌株和培养基进行调整（参见讨论部分）。</li>
		<li>3,000 x 重力下离心细胞悬液10 min g 和 4 &#176;C.</li>
		<li>轻轻将上清液倾倒至废液容器中。</li>
		<li>洗涤步骤：将细胞重悬于50 mL预冷的NMM中&#916;AA（不含任何氨基酸，参见 补充材料）或 NMM&#916;Pro（不含脯氨酸，参见 补充材料）培养基，小心地进行移液操作。 
		注意：此洗涤步骤可使用所述的两种缓冲液中的任意一种，因为该步骤仅需去除孵育介质中残留的脯氨酸。</li>
		<li>通过沉降法将细胞与培养基分离 4 &#176;C 在离心机中以 3,000 x g 10 分钟。</li>
		<li>轻轻将上清液倾倒至废液容器中。</li>
		<li>轻轻吹打，将细胞沉淀重悬于 200 mL NMM 中&#916;Pro 培养基添加补充物 100 &#181;g/mL 将氨苄青霉素加入2-L锥形瓶中。 
		注意：可将所得细胞悬液分装为多个等体积样品，以获得相同的起始培养物，用于比较在脯氨酸（Pro）或脯氨酸类似物存在下蛋白质的表达情况（例如，分装为4份，每份50 mL，置于100 mL锥形瓶中）。</li>
		<li>37 °C。 37 &#176;C 在220 rpm的轨道摇床中&#160;以实现对 Pro 的完全耗尽。 
		注意：此步骤对于完全耗尽细胞中的Pro至关重要。</li>
		<li>加入适量的 either L-脯氨酸或 R-Flp、S-Flp、Dfp 和 Dhp，从 50 mM 储存液中添加至细胞悬液，使终浓度为 1 mM。 
		注意：通常情况下，Pro 或脯氨酸衍生物的 50 mM 原液应在使用前新鲜配制。只有当特定的天然或非天然氨基酸在水溶液中不发生水解时，才可考虑使用冷冻保存的原液。</li>
		<li>从1 M储存液中加入IPTG至终浓度为0.5 mM，以诱导目标蛋白表达。</li>
		<li>在12小时（过夜）时间内表达目标蛋白 37 &#176;C 在220 rpm的摇床中振荡。</li>
		<li>测量 OD600 第二天。 
		注意：OD600 通过测定蛋白表达后细胞数量进行定量。较低的OD600 与洗涤步骤2.2.3之前测得的数值相比，若数值降低，则表明所提供的氨基酸具有细胞毒性。此时应以最低浓度（低至0.1 mM）的所提供氨基酸重复实验。</li>
		<li>离心并在 5,000 x g 和 4 &#176;C 10 分钟后将上清液倾倒至废液容器中。</li>
		<li>洗涤步骤：用 50 mL 结合缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 8.0，150 mM NaCl，1 mM DTT）含 10% 甘油，通过轻柔吹打重悬细胞，将细胞悬液转移至 50 mL 圆锥形聚苯乙烯管中。</li>
		<li>离心并在 5,000 x g 下收集细菌细胞 g 和 4 &#176;C 10 分钟后将上清液倾倒至废液容器中。</li>
		<li>将细胞沉淀物置于50 mL锥形聚苯乙烯管中，于-20 &#176;C 或 -80 &#176;C 直至进一步使用（蛋白质纯化，见下文）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 通过固定化金属离子亲和层析（IMAC）纯化蛋白质样品的操作步骤
<ol>
	<li>细菌细胞裂解 
	注意：为防止目标蛋白降解，所有细胞裂解步骤均需在冰上或 4 °C 下进行。
	<ol>
		<li>在冰上或 4 °C 下，将细菌细胞沉淀置于 50 mL 锥形聚苯乙烯管中解冻 10–20 分钟。</li>
		<li>加入 10 mL 冰冷的结合缓冲液（参见补充材料），轻轻吹打混匀以重悬细胞沉淀。</li>
		<li>加入 100 µL 50 mg/mL 溶菌酶、100 µL 1 mg/mL DNase I、100 µL 1 mg/mL RNase A 以及 30 µL 1 M MgCl2。小心倒置细胞悬液 5 次，将封闭的管子置于冰上或 4 °C 下静置 60 分钟。 
		注意：溶菌酶通过破坏细菌细胞壁诱导化学裂解。</li>
		<li>使用超声波均质器对样品进行超声破碎（例如，在冰水混合物中对 50 mL 聚苯乙烯管进行 3 次，每次 3 分钟，脉冲 2 秒/暂停 4 秒，振幅 45%）。 
		注意：也可采用其他细胞破碎方法，例如在 14,000 psi 压力下进行 20 个循环的高压均质。如有必要，可用结合缓冲液（参见补充材料）稀释至仪器所需的最小体积。此外，也可使用蛋白提取试剂进行细胞破碎。示例参见材料表。</li>
		<li>在 18,000 xg、4 °C 条件下离心 60 分钟。</li>
		<li>记录步骤 3.1.6 中上清液的体积，并将上清液转移至新的 50 mL 聚苯乙烯管中。</li>
		<li>使用孔径为 0.45 µm 的膜过滤器澄清上清液。</li>
		<li>取“裂解液”样品用于 SDS-PAGE 分析（参见下文第 4 节）；该样品对应“可溶性蛋白组分”，即步骤 3.1.6 的上清液。</li>
		<li>根据步骤 3.1.6 测得的体积，加入等体积的 ddH2O 重悬细胞碎片，以确保后续 SDS-PAGE 分析时各样品稀释度一致。</li>
		<li>取“沉淀”样品用于 SDS-PAGE 分析（参见下文第 4 节）；该样品对应“不溶性蛋白组分”，即步骤 3.1.9 中的细胞碎片悬液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>固定化金属亲和层析（IMAC）纯化 
	注意：目标荧光蛋白的纯化可在 4 °C 或室温（RT）下进行。若选择室温操作，需等待裂解液、层析柱及所有缓冲液平衡至室温，以避免冷溶液进入温热层析柱时因溶解空气释放而产生气泡。
	<ol>
		<li>根据制造商说明，使用 1 mL 预装或自装的 IMAC FPLC（快速蛋白[或高效]液相色谱）柱纯化样品；设定最大柱压为 0.3 MPa，流速为 1 mL/min；使用结合缓冲液（参见补充材料）平衡层析柱，洗涤缓冲液（参见补充材料）进行洗涤，洗脱缓冲液（参见补充材料）洗脱目标蛋白。 
		注意：也可使用自动 FPLC 系统，通过线性咪唑浓度梯度（20–200 mM）洗脱目标蛋白。</li>
		<li>收集并合并含有荧光蛋白的洗脱组分（根据肉眼可见的绿色或橙色判断）。</li>
		<li>根据制造商说明，将合并的组分转移至透析膜（截留分子量（MWCO）为 5,000–10,000）中，并用透析缓冲液或 MS 缓冲液（参见补充材料）至少透析三次。例如，将 1 mL 样品每次用 100 mL 缓冲液透析，每轮至少 2 小时。详细方案请参考 Budisa 等人34。</li>
		<li>用 PBS 缓冲液（参见补充材料）将透析后的洗脱组分稀释 100 倍。</li>
		<li>在紫外-可见分光光度计中测定稀释样品的吸收光谱。</li>
		<li>根据朗伯-比尔定律，使用特定波长下的摩尔消光系数文献值计算蛋白浓度（EGFP 在 488 nm 处 ε488 = 55,000 cm-1·M-1，NowGFP 在 493 nm 处 ε493 = 53,600 cm-1·M-1，KillerOrange 在 514 nm 处 ε514 = 22,600 cm-1·M-1）： 
		<img alt="方程 1" src="/files/ftp_upload/63320/63320eq01.jpg" />（朗伯-比尔定律） 
		cprotein = 蛋白浓度 [mg/mL] 
		A = 特定波长下的吸光度 
		ε = 特定波长下的摩尔消光系数 [M-1·cm-1] 
		d = 比色皿光程，此处为 1 cm 
		MW = 蛋白分子量 [g/mol] 
		使用透析缓冲液（参见补充材料）作为空白（“零”）对照。</li>
		<li>取“洗脱液”样品用于 SDS-PAGE 分析（参见下文第 4 节），每孔上样 1–10 µg 蛋白（根据上一步计算结果），用于考马斯亮蓝染色凝胶。 
		注意：若使用考马斯亮蓝以外的染色方法或染料，应根据所用染色方法及染料灵敏度调整 SDS-PAGE 上样量。</li>
		<li>将蛋白样品在透析缓冲液（参见补充材料）中分装，于 -80 °C 冻存。 
		注意：在此储存条件下，蛋白样品至少可稳定保存 6 个月。实验室常用的紫外-可见及荧光分光光度计可用于测定目标蛋白的吸收光谱和荧光发射光谱。以下激发波长可用于荧光发射检测：488 nm（EGFP）、493 nm（NowGFP）和 510 nm（KillerOrange）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. SDS-PAGE 样品制备
<ol>
	<li>测定第 3 节中“洗脱液”、“裂解液”和“沉淀”样品在 280 nm 处的吸光度 A（A280nm）。通过添加适量洗脱缓冲液调节样品体积，使 A280nm = 2（最终样品体积应至少为 80 µL）。</li>
	<li>按 4:1（v/v）的比例将样品与 5× SDS 上样缓冲液混合（见补充材料），例如，取 80 µL 样品与 20 µL 5× SDS 上样缓冲液通过移液混合。</li>
	<li>将 SDS 样品置于水浴或加热块中，在 95 °C 下煮沸 5 分钟，以使蛋白质变性。</li>
	<li>让样品冷却至室温，并在上样前于微量离心机中以 13,000 ×g 离心 1 分钟。</li>
	<li>使用 5–10 µL 样品进行考马斯亮蓝染色的 SDS-PAGE。有关 SDS-PAGE 实验步骤的详细信息，请参阅57。 
	注意：根据所用染色方法和染料的灵敏度调整 SDS 样品上样量。应仔细检查 SDS-PAGE 结果，确保目标蛋白条带（对应预期分子量）中所含蛋白占总蛋白含量的 95% 以上。为此，拍摄考马斯亮蓝染色凝胶图像，并通过密度测定法比较目标分子量蛋白条带与泳道中所有其他条带（如有）的强度。可使用 ImageJ 软件进行条带强度的密度测定分析58。为实验证明目标非天然氨基酸（ncAAs）已成功掺入目标蛋白中，应采用高效液相色谱（HPLC）联用电喷雾电离飞行时间质谱（LC-ESI-TOF-MS）进行完整蛋白质质量分析，具体操作如文献所述59&#160;（参见第 5 节实验方案及其中的材料表以获取示例设备）。</li>
</ol>
5. 蛋白质变异体的荧光发射
<ol>
	<li>在实验开始前，检查 SDS-PAGE 实验结果，确保样品纯度 >95%（参见步骤 4.5 后的注释）。</li>
	<li>根据在适当波长下计算得到的吸光度值（见子步骤 3.2.5），将每种纯化后的蛋白变体样品调整至浓度为 0.3 µM，并确保最终样品体积约为 200 µL。</li>
	<li>将稀释后的样品在室温下平衡 1 小时。</li>
	<li>将样品转移至 1 cm 石英比色皿中，使用荧光分光光度计（见材料表），分别采用以下激发波长测定样品的荧光发射光谱：488 nm（用于 EGFP）、493 nm（用于 NowGFP）、510 nm（用于 KillerOrange）。</li>
</ol>
6. EGFP 变体的变性与复性
<ol>
	<li>在实验操作之前，检查 SDS-PAGE 实验的结果，以确保样品纯度符合要求。 &#62;95%（参见步骤 4.5 后的注释）</li>
	<li>为每种纯化的蛋白质变体准备两个样品 2 &#181;L 终体积，浓度为 300 &#181;M （参见步骤 3.2.4-3.2.6 中的蛋白质浓度测定）。</li>
	<li>添加 18 &#181;L 1.11× PBS缓冲液（参见 补充材料) 含 8.89 M 尿素和 5.56 mM DTT 的溶液 2 &#181;L 每种纯化后的蛋白质变体（以获得含有8 M尿素和5 mM DTT的1x PBS）以诱导变性。 
	注意：对于步骤 6.4–6.6，需分别处理每个样品。</li>
	<li>将样品在5分钟内孵育 95 &#176;C.</li>
	<li>稀释 20 &#181;L 将样品稀释100倍，通过加入 1980 &#181;L 1×PBS（参见 补充材料) 加入 5 mM DTT 以诱导复性，得到 0.3 &#181;M 最终蛋白浓度，并立即转移 200 &#181;L 将样品加入1 cm石英比色皿中。 
	注意：此处操作需迅速，因为复性过程会立即开始。</li>
	<li>将石英比色皿插入合适的荧光光谱仪中（参见 材料表）并通过每3秒采集一次荧光光谱，持续30分钟，监测样品中蛋白质的复性过程。对于每种蛋白质变体，第一个样品采用295 nm荧光激发，第二个样品采用488 nm荧光激发。</li>
	<li>将复性样品转移至1.5 mL微量离心管中，盖紧管盖，于室温避光保存24 h，以确保EGFP变体完全复性。</li>
	<li>按照步骤6.6，使用与之前相同的激发波长测定复性蛋白样品的荧光发射，以捕获荧光恢复的时间终点。</li>
</ol>

作者声明所有潜在的利益冲突。

在自然界中，对蛋白质结构和功能的操控通常源于突变，即蛋白质序列中特定位置的氨基酸身份发生替换。这种自然机制被广泛用作蛋白质工程中的生物技术手段——定点突变，并依赖于参与该过程的20种标准氨基酸。然而，脯氨酸残基的替换存在困难。由于其特殊的主链基团结构，它几乎无法与其他19种氨基酸相互替换72。例如，由于脯氨酸与最常见的二级结构（即α-螺旋和β-折叠）相容性较差，通常被认为是一种二级结构破坏者。当该残基被标准氨基酸库中的其他氨基酸取代时，这一特性很容易丧失。使用脯氨酸的化学类似物进行替换则提供了一种替代策略，可在保留母体脯氨酸残基本身主链基本特征的同时，对其特定的构象转变施加偏向性，或调节分子体积与极性。例如，可通过向细菌培养物中添加羟基脯氨酸、氟代脯氨酸、烷基化脯氨酸、脱氢脯氨酸等类似物，以及具有不同环大小的结构，从而促进含有特定脯氨酸残基修饰的蛋白质的表达。
本研究中描述的选择性压力掺入（SPI）方法可实现对目标蛋白中所有脯氨酸进行全局性、即残基特异性的替换，代之以相关的化学类似物。该方法的重要性体现在，SPI能够实现常规诱变技术无法达到的序列改变。例如，如本研究所示，该方法可产生仅含微小结构变化的目标蛋白，此类变化通常不超过一至两个原子的替换、删除或添加。这类蛋白修饰被称为“原子突变”73,74。在绿色荧光蛋白（GFP）等荧光蛋白中，此类分子干预的影响可体现在折叠速度、局部极性、蛋白堆积程度以及相关结构特征稳定性的变化上。由于对蛋白折叠及残基微环境的影响，吸收光谱和荧光特性也随之发生间接改变。与将脯氨酸突变为其他标准氨基酸残基相比，SPI所实现的分子改变通常具有更高的精确性，而后者通常会对蛋白的折叠、表达与纯化产生不利影响。
作为一种生产方法，选择性压力掺入（SPI）方法利用了氨酰-tRNA合成酶口袋对天然氨基酸化学类似物的底物耐受性。该合成酶负责准确识别氨基酸结构，而氨基酸向蛋白质中的掺入则发生在翻译过程的下游。在操作上，SPI方法中的蛋白质生产、分离与纯化过程与任何其他重组蛋白表达技术典型操作方式相同，但需对方案进行如下补充：用于替换的目标脯氨酸在发酵过程初期即被提供，以使细胞能够生长并建立完整的细胞机制。然而，细胞培养物不允许达到最大光密度，以保持细胞处于适合蛋白表达的对数生长期。在此基础上，SPI方法主要有两种变体。第一种方法是在初始培养基（化学成分明确的培养基）中调整脯氨酸浓度，使其在无外界干预的情况下自然耗尽。细胞在培养基中的脯氨酸耗尽前仍处于对数生长期，随后加入类似物，并诱导目标蛋白的表达。第二种方法则是将细胞在含脯氨酸的培养基中培养至对数生长期中期，此时需将细胞取出，并物理转移至另一种不含脯氨酸、仅含类似物的新培养基中，随后诱导目标蛋白的表达。在这两种方法中，类似物和目标蛋白的诱导试剂均被加入预先培养好的细胞中。野生型蛋白的分离与纯化操作与变异体蛋白相同。原则上，任何可用的脯氨酸营养缺陷型菌株均可作为表达宿主，但建议通过表达测试来确定最合适的宿主。此外，也可通过测试不同的化学成分明确培养基以优化蛋白产量。
对于选择性压力掺入（SPI）所用的化学类似物，需考虑一些特定要求，例如溶解度和浓度。氨基酸的代谢可利用性和细胞摄取依赖于培养基中溶解分子的数量。为提高特定化合物的溶解度，可选择偏酸性或偏碱性的条件。由于这些人工分子可能因其细胞毒性产生抑制细胞生长的效应，因此应将浓度降至最低，以避免细胞应激75。
SPI 的一个微小缺陷是，随着需要替换的位点数量增加，其掺入效率会降低。原则上，可通过定点突变减少目标生物分子中该氨基酸的出现频率来解决此问题。然而，改变蛋白质的一级结构可能会影响其结构和功能特性。
如前所述，SPI 可实现对标准氨基酸的残基特异性&#160;替换。这意味着非标准氨基酸会被插入到目标蛋白中所有标准氨基酸的位置，包括对蛋白功能或折叠至关重要的保守残基。要解决这一问题，唯一可行的方法是采用位点特异性插入技术3。在过去的几十年中，已发展出一种正交配对方法，可生成在预定位置含有修饰残基的蛋白质。该方法最常见的形式被称为终止密码子抑制。该技术基于一种经过改造的正交翻译系统，专用于将合成氨基酸位点特异性地掺入蛋白质中76。迄今为止，已有超过 200 种具有不同侧链修饰的氨基酸通过该方法被成功插入蛋白质77。然而，这些翻译系统目前仍不适用于将脯氨酸类似物插入目标蛋白。此外，由于在改造后的翻译系统中，氨酰-tRNA 合成酶通常仍存在一定的背景错配现象，因此该方法在进行微小氨基酸修饰时效率较低。
通过 SPI 方法，我们制备了多种 β-桶状荧光蛋白变体，并研究了脯氨酸被其非天然类似物取代后的影响。当脯氨酸被 R-Flp 和 Dfp 取代时，表达宿主产生了无功能的蛋白质，该效应很可能是由蛋白质错误折叠引起的。这种错误折叠可能源于 R-Flp 所促进的 C4-exo 构象，而该构象不被天然蛋白质结构所偏好27。对于 Dfp，错误折叠可能归因于脯氨酸残基处 trans-到-cis 肽键异构化速率降低27。已知该过程是蛋白质折叠动力学中的限速步骤之一，会影响 β-桶结构的形成以及后续发色团的成熟。事实上，对于 R-Flp 和 Dfp 这两种氨基酸，蛋白质表达均导致形成聚集且不溶的蛋白产物，因此无法完成发色团的形成，荧光完全丧失。然而，在使用 S-Flp 和 Dhp 的情况下，观察到正常的蛋白质成熟过程，每种类似物与蛋白质组合均获得了具有荧光的蛋白样品。尽管蛋白质的吸收和荧光特性出现了一些调节性变化，但总体上仍与野生型蛋白相近。氨基酸替换的影响在复性动力学研究中得以显现：当以 S-Flp 取代时，复性速度更快。模型研究表明，该残基可能提升 trans-到-cis 酰胺键旋转速率，并促进 C4-endo 构象的形成。这两个因素均可能有助于该残基在 EGFP 中产生有利的动力学效应。相比之下，Dhp 所产生的折叠动力学曲线与亲本蛋白最为相似。在所研究的荧光蛋白中，仅通过原子层面的微小突变即产生多样化的结果，这凸显了 SPI 制备方法在调控目标蛋白质特性方面的潜力。利用类似物取代脯氨酸所诱导的蛋白质改变，进一步对酶78,79,80&#160;和离子通道81,82 的工程化改造，以及蛋白质稳定性的通用设计具有重要意义。
SPI 方法的基本局限性在于其以“全或无”的模式将脯氨酸残基替换为相应的类似物。若能精确选择哪些脯氨酸残基应被类似物取代，而哪些应保持未修饰状态，则将具有显著优势。然而，目前尚无技术可在微生物表达宿主中实现如此精细的蛋白质生产。蛋白质的化学合成83,84以及无细胞表达系统85,86是两种可实现位点特异性脯氨酸修饰的替代方法。但这些方法操作复杂且产量较低，相较于在活细胞中进行表达仍处于劣势。迄今为止，SPI 仍是生产携带原子级突变的复杂蛋白质最为简便且稳健的方法。通过引入非天然氨基酸替代物，该方法可实现对蛋白质特性的靶向调控，本研究中通过脯氨酸替换所引起的荧光蛋白折叠及光吸收/发射性质的改变即为一例。

经典的定点突变技术可通过在DNA水平上操纵密码子，实现对现有基因编码蛋白质序列的任意置换。为了研究蛋白质折叠与稳定性，通常希望用结构相似的氨基酸替代物替换相似的氨基酸。然而，传统的蛋白质突变技术仅限于标准遗传密码子库中存在的天然氨基酸之间的结构相似替换，例如Ser/Ala/Cys、Thr/Val、Glu/Gln、Asp/Asn、Tyr/Phe。另一方面，对于色氨酸（Trp）、甲硫氨酸（Met）、组氨酸（His）或脯氨酸（Pro）等其他天然氨基酸，则缺乏此类替换手段，而这些氨基酸在蛋白质中常发挥关键的结构与功能作用1。在蛋白质高度特异的内部结构及其折叠过程的背景下，研究这些相互作用的理想方法是引入非破坏性的等排修饰。事实上，当这些天然氨基酸的等排氨基酸类似物——也称为非天然氨基酸（ncAAs）——被插入蛋白质中时，可在单个原子或原子基团（如H/F、CH2/S/Se/Te）水平上实现细微改变，这类改变被称为“原子突变”2。这种“分子手术”可产生性质发生改变的蛋白质，其性质变化仅源于单个原子或原子基团的交换，在理想情况下，这些变化可被分析并合理解释。通过这种方式，蛋白质合成在研究蛋白质折叠与结构方面的应用范围远远超出了经典的DNA突变技术。需要注意的是，通过定点突变技术产生的蛋白质通常被称为“突变体”（mutants），而含有被替换天然氨基酸的蛋白质则被称为“变体”（variants）3、“异源蛋白质”（alloproteins）4 或“蛋白质同系物”（protein congeners）5。
绿色荧光蛋白（GFP）最初在海洋生物Aequorea victoria中被发现，当暴露于紫外光至蓝光时会发出明亮的绿色荧光6,7。如今，GFP 常被用作高灵敏度的标记工具，通过荧光显微镜常规观察细胞中的基因表达和蛋白质定位。GFP 在多种生物物理8,9,10和生物医学11,12研究中也显示出重要价值，并广泛应用于蛋白质工程13,14,15。对 GFP 结构的深入分析促成了大量变异体的开发，这些变异体具有不同的稳定性和荧光发射峰值16,17。目前在细胞与分子生物学中使用的大多数 GFP 变异体在溶液和晶体状态下均为单体蛋白18。它们的主要结构特征对所有 GFP 家族成员具有普遍性，不受其系统发育来源影响，由11条β-链构成所谓的β-桶结构，一条弯曲的α-螺旋贯穿桶状结构中心，并承载发色团（图1A）。发色团的自催化成熟过程（图1B）需要其周围侧链在蛋白质中心位置精确排列；这些侧链中的许多在其他GFP变异体中高度保守19。在大多数来源于水母（如Aequorea victoria）的荧光蛋白中，发出绿光的发色团包含两个芳香环，分别是Tyr66的酚环和咪唑啉酮的五元杂环结构（图1B）。当发色团正确嵌入蛋白质基质中时，便赋予整个蛋白特征性的荧光。发色团位于结构中心，而桶状结构使其与水相环境隔离20。若发色团暴露于大量水环境中，将导致荧光猝灭，即荧光丧失21。
桶状结构的正确折叠对于保护发色团免受荧光淬灭至关重要22。脯氨酸（Pro）残基在绿色荧光蛋白（GFP）的结构组织中起着特殊作用23。由于无法支持β-链的形成，它们构成了连接环，负责维持整个蛋白质的结构稳定性。因此，在来源于Aequorea和Anthoathecata的GFP中均发现有10至15个脯氨酸残基；其中一些在其他类型的荧光β-桶蛋白中也高度保守。由于其独特的几何特征，脯氨酸预计会显著影响蛋白质的折叠特性。例如，在来源于Aequorea的GFP中，十个脯氨酸残基（图2A）中有九个形成反式肽键，仅有一个形成顺式肽键（Pro89）。Pro58是不可或缺的，即不能被其余19种标准氨基酸所替代。该残基可能负责Trp57残基的正确定位，而Trp57已被报道对发色团成熟及GFP整体折叠至关重要24。包含三个脯氨酸残基（Pro54、Pro56、Pro58）和Trp57的PVPWP片段是GFP结构中“下盖”的关键部分（见图1A）。PVPWP结构模体存在于多种蛋白质中，如细胞色素和真核电压门控钾通道25。在第75位和第89位将脯氨酸替换为丙氨酸也会严重损害蛋白质表达与折叠，并阻断发色团的成熟过程。Pro75和Pro89是“上盖”的组成部分，覆盖在发色团之上（图1A），并在11股β-桶荧光蛋白中高度保守23。这两个“盖子”能够使发色团与水性溶剂隔离，即使在稳定的三级结构部分破坏的情况下仍可维持此隔离状态26。这种特殊的分子结构可保护荧光团免受碰撞式（动态）荧光淬灭，例如由水、氧气或其他可扩散配体引起的淬灭。
为了对 GFP 结构进行分子工程改造，需要在其蛋白质的一级结构中引入氨基酸替换。研究人员已在 GFP 上进行了大量突变，获得了具有更高稳定性、快速且可靠折叠能力以及不同荧光特性的多种变体17。然而，在大多数情况下，对脯氨酸残基的突变被认为是一种高风险的方法，因为其余 19 种标准氨基酸中没有任何一种能够有效恢复脯氨酸残基特有的构象特征27。因此，人们发展出一种替代策略，即用其他基于脯氨酸的结构（称为脯氨酸类似物）来替换脯氨酸残基28。由于其独特的环状化学结构，脯氨酸表现出两种特征性的构象转变（图 1C）：1）脯氨酸环的折叠（ring puckering），这是一种快速过程，涉及主链的排列，主要影响 φ 扭转角；2）肽键的 cis/trans 异构化，这是一种较慢的过程，通过 ω 扭转角影响主链的折叠。由于该过程速度较慢，后者通常成为整个蛋白质折叠过程中的限速步骤。已有研究证实，在某些 GFP 变体的折叠过程中，围绕特定脯氨酸残基的肽键 cis/trans 异构化构成了缓慢的折叠步骤。例如，Pro89 处 cis 肽键的形成是折叠过程中的慢速步骤，因为它依赖于从 trans 到 cis 的键转变29。若将 Pro89 替换为全 trans 构型的肽环，即可消除 cis 到 trans 的异构化事件，从而实现更快的重折叠30。除了 cis/trans 异构化之外，环折叠转变也可能因主链在蛋白质内部的排列与堆积而对蛋白质折叠产生显著影响27,31。
化学修饰会改变脯氨酸残基固有的构象转变，从而影响蛋白质的折叠能力。某些脯氨酸类似物是蛋白质中脯氨酸替换的极具吸引力的候选物，因为它们可用于调控并研究蛋白质的折叠特性。例如，(4R)-氟代脯氨酸（R-Flp）、(4S)-氟代脯氨酸（S-Flp）、4,4-二氟代脯氨酸（Dfp）和3,4-脱氢脯氨酸（Dhp）是四种类似物（图1D），它们在分子体积和极性方面与脯氨酸差异极小32。同时，每种类似物表现出不同的环状折叠构型：S-Flp 稳定 C4-endo 折叠构型，R-Flp 稳定 C4-exo 折叠构型，Dfp 无明显的折叠偏好，而 Dhp 则消除折叠（图1D）33。通过在蛋白质结构中使用这些类似物，可以调控脯氨酸残基的构象转变，进而影响所获得的GFP变体的性质。
在本研究中，我们采用选择性压力掺入法（SPI，图3），将指定的一组脯氨酸类似物（图1D）引入绿色荧光蛋白（GFP）变体的结构中34。用结构最相近的类似物替换氨基酸残基，是蛋白质设计中一项应用性的生物技术理念35,36。因此，模型蛋白中脯氨酸类似物的作用体现了其作为蛋白质工程工具的潜力37。含有目标类似物的蛋白质在经过改造的E. coli菌株中进行表达，这些菌株无法自身合成脯氨酸（脯氨酸营养缺陷型），因而可被强制在蛋白质生物合成过程中接受底物替换38。这种全基因组范围内的脯氨酸替换得以实现，依赖于内源性氨酰-tRNA合成酶天然的底物灵活性39——这类关键酶负责催化tRNA与相应氨基酸之间的酯化反应40。通常如图3所示，细胞在确定培养基中培养至对数中期生长阶段。下一步，在发酵过程中使目标氨基酸在表达系统内胞内耗尽，随后由目标类似物或非天然氨基酸（ncAA）替代。然后诱导目标蛋白表达，以实现残基特异性的非天然氨基酸掺入。这种替换在整个蛋白质组范围内发生。尽管这一副作用可能对宿主菌株的生长产生不利影响，但目标蛋白的生产质量通常不受显著影响，因为在重组表达中，细胞资源主要被导向目标蛋白的合成41,42。因此，严格调控的可诱导表达系统和强启动子对于实现高效掺入至关重要43。我们的方法基于通过有义密码子实现多个残基特异性掺入非天然氨基酸（有义密码子重分配），并通过定点突变调控目标基因中脯氨酸类似物插入位点的数量44。类似的方法已在我们此前关于制备具有抗菌特性的重组肽的报告中应用45。在本研究中，我们应用SPI方法，使所有脯氨酸残基被相应的类似物取代，从而生成预期具备天然氨基酸组无法实现的独特理化性质的蛋白质。通过对所得变体的折叠行为和荧光特性进行表征，旨在展示GFP变体中原子级替换所产生的效应。

<table><tbody><tr><td>乙腈</td><td>VWR</td><td>HiPerSolv CHROMANORM ULTRA for LC-MS, 83642</td><td>需 LC-MS 级</td></tr><tr><td>丙烯酰胺与双丙烯酰胺水溶液储备液（比例 37.5:1，ROTIPHORESE Gel 30）</td><td>Carl Roth</td><td>3029.1</td><td></td></tr><tr><td>琼脂</td><td>Carl Roth</td><td>5210</td><td></td></tr><tr><td>钼酸铵 ((NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;MoO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>277908</td><td></td></tr><tr><td>过硫酸铵 (APS)</td><td>Carl Roth</td><td>9592.2</td><td>&amp;ge;98 %，p.a.，需 ACS 级</td></tr><tr><td>硫酸铵 ((NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4418</td><td></td></tr><tr><td>氨苄青霉素钠盐</td><td>Carl Roth</td><td>K029</td><td></td></tr><tr><td>生物素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4501</td><td></td></tr><tr><td>溴酚蓝</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0126</td><td></td></tr><tr><td>氯化钙 (CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td></td></tr><tr><td>考马斯亮蓝 R 250</td><td>Carl Roth</td><td>3862</td><td></td></tr><tr><td>硫酸铜 (CuSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Carl Roth</td><td>CP86.1</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;D&lt;/em&gt;-葡萄糖</td><td>Carl Roth</td><td>6780</td><td></td></tr><tr><td>1,2-双(二甲氨基)乙烷，&amp;nbsp;N,N,N',N'-四甲基乙二胺 (TEMED)</td><td>Carl Roth</td><td>2367.3</td><td>&amp;ge;99 %，p.a.，用于电泳</td></tr><tr><td>1,4-二硫苏糖醇 (DTT)</td><td>Carl Roth</td><td>6908</td><td></td></tr><tr><td>二氯甲烷 (DCM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270997</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钾 (K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Carl Roth</td><td>P749.1</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钠 (Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Carl Roth</td><td>X987</td><td></td></tr><tr><td>脱氧核糖核酸酶 I (DNase I)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5025</td><td></td></tr><tr><td>Dowex 50WX8-100（氢型）</td><td>Acros Organics / Thermo Fisher Scientific (Waltham, U.S.A.)</td><td>10731181</td><td>阳离子交换树脂</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Carl Roth</td><td>9065.1</td><td></td></tr><tr><td>甲酸</td><td>VWR</td><td>HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS, 84865</td><td>需 LC-MS 级</td></tr><tr><td>冰醋酸</td><td>Carl Roth</td><td>3738.5</td><td>100 %，p. a.</td></tr><tr><td>甘油</td><td>Carl Roth</td><td>3783</td><td></td></tr><tr><td>咪唑</td><td>Carl Roth</td><td>X998</td><td></td></tr><tr><td>盐酸 (HCl)</td><td>Merck</td><td>295426</td><td></td></tr><tr><td>氯化亚铁 (FeCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>380024</td><td></td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>Carl Roth</td><td>AE73.1</td><td></td></tr><tr><td>异丙基 &amp;beta;-&lt;em&gt;D&lt;/em&gt;-1-硫代半乳糖吡喃糖苷 (IPTG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6758</td><td></td></tr><tr><td>溶菌酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁 (MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Carl Roth</td><td>KK36.1</td><td></td></tr><tr><td>硫酸镁 (MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Carl Roth</td><td>8283.2</td><td></td></tr><tr><td>氯化锰 (MnCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63535</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-巯基乙醇</td><td>Carl Roth</td><td>4227.3</td><td></td></tr><tr><td>PageRuler 未染色蛋白 Marker</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26614</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾 (KCl)</td><td>Carl Roth</td><td>6781.3</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钾 (KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>核糖核酸酶 A (RNase A)</td><td>Carl Roth</td><td>7156</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠 (NaCl)</td><td>Carl Roth</td><td>P029</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钠 (NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Carl Roth</td><td>T879</td><td></td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠 (NaC&lt;sub&gt;12&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;25&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Carl Roth</td><td>0183</td><td></td></tr><tr><td>硫胺素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4625</td><td></td></tr><tr><td>三氟乙酸 (TFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6508</td><td></td></tr><tr><td>三羟甲基氨基甲烷盐酸盐 (Tris-HCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>857645</td><td></td></tr><tr><td>三(羟甲基)氨基甲烷 (Tris)</td><td>Carl Roth</td><td>5429</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白胨</td><td>Carl Roth</td><td>8952</td><td></td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>Carl Roth</td><td>2363</td><td></td></tr><tr><td>氯化锌 (ZnCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>229997</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;L&lt;/em&gt;-丙氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7627</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;L&lt;/em&gt;-精氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5006</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;L&lt;/em&gt;-天冬酰胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8381</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;L&lt;/em&gt;-天冬氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0884</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;L&lt;/em&gt;-半胱氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7352</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;L&lt;/em&gt;-谷氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2128</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;L&lt;/em&gt;-谷氨酰胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G3126</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;L&lt;/em&gt;-甘氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7126</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;L&lt;/em&gt;-组氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8000</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;L&lt;/em&gt;-异亮氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2752</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;L&lt;/em&gt;-亮氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L8000</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;L&lt;/em&gt;-赖氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5501</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;L&lt;/em&gt;-甲硫氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9625</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;L&lt;/em&gt;-苯丙氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2126</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;L&lt;/em&gt;-脯氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0380</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;L&lt;/em&gt;-丝氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4500</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;L&lt;/em&gt;-苏氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8625</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;L&lt;/em&gt;-色氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0254</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;L&lt;/em&gt;-酪氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3754</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;L&lt;/em&gt;-缬氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V0500</td><td></td></tr><tr><td>(4&lt;em&gt;S&lt;/em&gt;)-氟脯氨酸</td><td>Bachem</td><td>4033274</td><td>确保所有脯氨酸类似物不含脯氨酸，检查纯度。否则需增加步骤以在表达过程中消耗脯氨酸污染。</td></tr><tr><td>(4&lt;em&gt;R&lt;/em&gt;)-氟脯氨酸</td><td>Bachem</td><td>4033275</td><td>确保所有脯氨酸类似物不含脯氨酸，检查纯度。否则需增加步骤以在表达过程中消耗脯氨酸污染</td></tr><tr><td>3,4-脱氢脯氨酸</td><td>Bachem</td><td>4003545</td><td>确保所有脯氨酸类似物不含脯氨酸，检查纯度。否则需增加步骤以在表达过程中消耗脯氨酸污染</td></tr><tr><td>4,4-二氟脯氨酸</td><td>Enamine</td><td>EN400-17448</td><td>确保所有脯氨酸类似物不含脯氨酸，检查纯度。否则需增加步骤以在表达过程中消耗脯氨酸污染</td></tr><tr><td>锥形聚苯乙烯（Falcon）离心管，15 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-49B</td><td></td></tr><tr><td>锥形聚苯乙烯（Falcon）离心管，50 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>透析膜，截留分子量 (MWCO) 5,000</td><td>Spectrum Medical Industries</td><td>Spectra/Por MWCO 5000 透析膜，133198</td><td></td></tr><tr><td>金属离子亲和层析 (IMAC) 柱，1 mL，Ni-NTA</td><td>GE Healthcare</td><td>HisTrap HP，1 mL，17-5247-01</td><td></td></tr><tr><td>鲁尔锁紧注射器，5 mL</td><td>Carl Roth</td><td>EP96.1</td><td></td></tr><tr><td>鲁尔锁紧注射器，20 mL</td><td>Carl Roth</td><td>T550.1</td><td></td></tr><tr><td>鲁尔锁紧注射器，50 mL</td><td>Carl Roth</td><td>T552.1</td><td></td></tr><tr><td>微量离心管，1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td></td></tr><tr><td>培养皿（聚苯乙烯，无菌）</td><td>Carl Roth</td><td>TA19</td><td></td></tr><tr><td>pQE-80L 质粒载体</td><td>Qiagen</td><td>已不再提供</td><td>由 N-末端 pQE 载体套装替代，货号/ID：32915</td></tr><tr><td>脯氨酸营养缺陷型 &lt;em&gt;E. coli &lt;/em&gt;菌株 JM83</td><td>Addgene</td><td>50348</td><td>https://www.addgene.org/50348/</td></tr><tr><td>脯氨酸营养缺陷型 &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; 菌株 JM83</td><td>ATCC</td><td>35607</td><td></td></tr><tr><td>圆底聚苯乙烯离心管，14 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>Corning Falcon，14-959-1B</td><td></td></tr><tr><td>0.45 &amp;micro;m 聚偏氟乙烯 (PVDF) 膜注射器滤器</td><td>Carl Roth</td><td>CCY1.1</td><td></td></tr><tr><td>用于 LC-ESI-TOF-MS 的高效液相色谱 (HPLC) 柱</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Supelco Discovery BIO Wide Pore C5 HPLC 柱，3 &amp;micro;m 粒径，10 cm x 2.1 mm</td><td>配锥形 0.1 mL 玻璃内衬、螺口盖和隔垫</td></tr><tr><td>高效液相色谱自动进样瓶，1.5 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Supelco 854165</td><td></td></tr><tr><td>用于 LC-ESI-TOF-MS 的质谱仪</td><td>Agilent</td><td>Agilent 6530 Accurate-Mass QTOF</td><td></td></tr><tr><td>质谱数据分析软件</td><td>Agilent</td><td>MassHunter 定性分析软件 v. B.06.00</td><td></td></tr><tr><td>用于 1.5 mL Eppendorf 管的台式离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5427 R</td><td></td></tr><tr><td>用于 50 mL Falcon 管的制冷离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5810 R</td><td></td></tr><tr><td>快速蛋白液相色谱 (FPLC) 系统</td><td>GE Healthcare</td><td>&amp;Auml;KTA pure 25 L</td><td></td></tr><tr><td>荧光光谱仪</td><td>Perkin Elmer</td><td>LS 55</td><td></td></tr><tr><td>用于细菌细胞破碎的高压微流化器</td><td>Microfluidics</td><td>LM 系列，带 &amp;ldquo;Z&amp;rdquo; 型腔室</td><td></td></tr><tr><td>用于细菌培养的旋转摇床</td><td>Infors HT</td><td>Minitron</td><td></td></tr><tr><td>用于液相色谱 (LC) 的蠕动泵</td><td>GE Healthcare</td><td>P-1</td><td></td></tr><tr><td>用于细菌细胞破碎的超声波均质器</td><td>Omnilab</td><td>Bandelin SONOPULS HD 3200，5650182</td><td>配 MS72 探头</td></tr><tr><td>紫外-可见分光光度计</td><td>Biochrom</td><td>ULTROSPEC 2100</td><td></td></tr><tr><td>紫外-可见-近红外分光光度计</td><td>Perkin Elmer</td><td>LAMBDA 950 UV/Vis/NIR</td><td></td></tr></tbody></table>

荧光蛋白中脯氨酸残基特异性替换为脯氨酸类似物：骨架“分子手术”如何影响折叠与稳定性

Residue-Specific Exchange of Proline by Proline Analogs in Fluorescent Proteins: How "Molecular Surgery" of the Backbone Affects Folding and Stability

通过传统的定点突变技术将蛋白质中的脯氨酸（Pro）残基替换为其余19种标准氨基酸中的任意一种，通常会对蛋白质折叠产生不利影响，尤其会影响绿色荧光蛋白及其相关变体中的发色团成熟过程。一种合理的替代方法是调控蛋白质的翻译过程，使得所有脯氨酸残基被特异性地替换为相应的类似物，该方法称为选择性压力整合（selective pressure incorporation, SPI）。内置的化学修饰可作为一种“分子手术”手段，用于精细解析可测量的变化，甚至理性调控不同的蛋白质性质。 全部 Pro残基被替换 残基特异性地 通过类似物进行取代，该方法称为选择性压力掺入（SPI）。内置的化学修饰可作为一种“分子手术”手段 &#34;分子手术&#34; 以精细解析可测量的变化，甚至合理调控不同的蛋白质特性。本研究展示了SPI方法在研究脯氨酸于典型β-桶状结构组织中作用方面的有效性 &#946;-桶状结构，其序列中含有10-15个脯氨酸残基：增强型绿色荧光蛋白（EGFP）、NowGFP和KillerOrange。Pro残基位于各个β-链之间的连接区域，构成桶状支架的闭合“盖子”，从而负责将发色团与水隔离，即维持其荧光特性。 &#946;-链之间，并构成桶状支架的闭合盖子，因此负责将发色团与水隔绝，即影响其荧光特性。采用（4R-氟脯氨酸（R-Flp）、(4SS-氟代脯氨酸（S-Flp）、4,4-二氟代脯氨酸（Dfp）和3,4-脱氢脯氨酸（Dhp）的实验采用脯氨酸营养缺陷型 E. coli 菌株作为表达宿主。我们发现，含有 S-Flp 和 Dhp 的荧光蛋白具有活性（即具有荧光），而另外两种类似物（Dfp 和 R-Flp）则产生无功能且错误折叠的蛋白质。对含有 Pro 类似物的蛋白质进行紫外-可见吸收光谱和荧光发射光谱分析，结果显示仅有少量特征性变化。对 EGFP 变体的折叠动力学曲线进行分析表明，在 S-Flp 存在时重折叠过程加快，而含有 Dhp 的蛋白质的折叠过程则与野生型相似。本研究展示了 SPI 方法在原子水平上对蛋白质残基进行细微修饰的能力（“分子手术”），&#34;分子手术&#34;），可用于研究其他感兴趣的蛋白质。该研究阐明了在β桶状荧光蛋白类别中，以近似化学类似物替代脯氨酸对蛋白质折叠及光谱特性所产生的影响。 &#946;-桶状荧光蛋白

为了克服传统定点突变技术的局限性，将带有特定修饰的脯氨酸类似物引入多种荧光蛋白中。我们展示了通过以氟原子取代氢原子，或在脯氨酸残基中将单键替换为双键（“分子手术”）的方式，如何影响蛋白质的基本性质，包括其折叠过程以及与光的相互作用。

在蛋白质中，通过传统的定点突变技术将脯氨酸（Pro）残基替换为其余19种标准氨基酸中的任意一种，通常会对蛋白质折叠产生不利影响，尤其会干扰绿色荧光蛋白及其变体中的发色团成熟过程。一种合理的替代方法是调控蛋白质的翻译过程，使所有Pro残基被特异性地替换为类似物，该方法称为选择性压力掺入（selective pressure incorporation, SPI）。内置的化学修饰可作为一种“分子手术”手段，用于精细解析可测量的变化，甚至理性调控不同的蛋白质特性。本研究展示了SPI方法在研究绿色荧光蛋白（GFP）光谱变体典型β-桶状结构中脯氨酸作用方面的应用价值，这些变体在其序列中含有10至15个脯氨酸残基，包括增强型绿色荧光蛋白（EGFP）、NowGFP和KillerOrange。Pro残基位于各个β-链之间的连接区域，并构成桶状支架的闭合“盖子”，因而负责将发色团与水环境隔离，即维持其荧光特性。本研究利用一种脯氨酸营养缺陷型的大肠杆菌（E. coli）菌株作为表达宿主，分别进行了(4R)-氟代脯氨酸（R-Flp）、(4S)-氟代脯氨酸（S-Flp）、4,4-二氟代脯氨酸（Dfp）和3,4-脱氢脯氨酸（Dhp）的选择性压力掺入实验。研究发现，含有S-Flp和Dhp的荧光蛋白具有活性（即具有荧光），而另外两种类似物（Dfp和R-Flp）则导致蛋白质功能丧失并发生错误折叠。对紫外-可见吸收光谱和荧光发射谱的检测显示，含有Pro类似物的蛋白质仅有少数特征性变化。对EGFP变体折叠动力学曲线的分析表明，S-Flp的存在可加速重折叠过程，而含Dhp的蛋白质折叠过程则与野生型相似。本研究展示了SPI方法在原子水平上对蛋白质残基进行细微修饰（“分子手术”）的能力，该方法可推广应用于其他目标蛋白质的研究，同时阐明了在β-桶状荧光蛋白类别中，用近似化学类似物替换脯氨酸对蛋白质折叠和光谱特性的影响。

在大多数情况下，传统的定点突变技术并不适合研究脯氨酸在蛋白质中的功能作用。本文介绍了一种将脯氨酸类似物作为非天然氨基酸掺入核糖体合成蛋白质的方法，以研究脯氨酸残基对蛋白质折叠与功能的影响。用标准氨基酸替换脯氨酸是一种具有风险的方法。引入脯氨酸类似物可实现一种分子层面的“手术”，即通过引入细微的分子改变，从而合理地影响和调控蛋白质的性质。由于脯氨酸残基在蛋白质骨架稳定性中发挥关键作用，本技术有助于阐明导致蛋白质折叠缺陷的机制，而这些缺陷正是某些人类病理状态的基础。由脯氨酸替换所引发的蛋白质改变对酶的生物技术工程具有重要意义，并为核糖体蛋白质翻译或折叠的优化提供了机会。该方法无需特殊设备和昂贵的仪器。在向大肠杆菌培养物中添加脯氨酸类似物之前，需特别注意耗尽其中天然脯氨酸的实验步骤。为开始生产含有天然脯氨酸的荧光蛋白，取两毫升过夜培养物接种于装有200毫升新鲜NMM培养基的两升锥形瓶中。将细胞在37摄氏度、220转/分钟的振荡摇床中培养约3.5小时。在培养期间，每隔30分钟使用分光光度计在600纳米处测定一次光密度。当光密度达到0.7时，离心收集菌体悬液，并小心地将上清液倒入废液中。随后，用50毫升冰预冷的不含任何氨基酸的NMM培养基或不含脯氨酸的NMM培养基重悬菌体进行洗涤。再次离心菌体，并将上清液倒入废液中。接下来，用移液器在含有氨苄青霉素但不含脯氨酸的200毫升NMM培养基中轻轻重悬细胞沉淀，置于2升的锥形瓶中，并在摇床中孵育30分钟，以确保脯氨酸完全耗尽。孵育结束后，从50毫摩尔的储备液中加入适量的L-脯氨酸或脯氨酸类似物，使细胞悬液中的终浓度为1毫摩尔。接着，从1摩尔的储备液中加入500微摩尔的IPTG以诱导目标蛋白的表达。在37摄氏度的摇床中过夜表达目标蛋白，次日测量光密度。通过离心收集细菌细胞，并将上清液倒入废液。然后，用含有10%甘油的50毫升结合缓冲液通过小心移液洗涤细胞。再次离心细胞，弃去上清液，将细胞沉淀置于50毫升离心管中，在-20或-80摄氏度下保存，直至后续使用。在检测荧光发射之前，先进行SDS-PAGE分析，以确保样品纯度高于95%。然后，根据在相应波长下测得的吸光度值，将每种纯化后的蛋白变体样品调整至浓度为0.3微摩尔。确保各样品的最终体积约为200微升。将稀释后的样品在室温下平衡。一小时后，将样品转移至光程为一厘米的石英比色皿中，并使用荧光光谱仪测定样品的荧光发射光谱。为诱导变性，将每种蛋白变体的两微升300微摩尔样品加入到18微升含有8.89摩尔尿素和5.56毫摩尔DTT的1.11倍PBS缓冲液中，进行二十倍稀释。将样品在 95 摄氏度下孵育五分钟。然后，通过加入含有 5 毫摩尔 DTT 的 1,980 微升 PBS 将样品稀释 100 倍以诱导复性，并立即转移 200 微升样品至一个 1 厘米的石英比色皿中。将石英比色皿插入合适的荧光光谱仪中，通过每三秒采集一次荧光光谱，持续监测 30 分钟的蛋白质复性过程。将复性样品转移至1.5毫升微量离心管中，盖紧管盖，于室温避光条件下孵育，以使EGFP变体充分复性。24小时后，使用与之前相同的激发波长测定复性后蛋白样品的荧光发射，以获取荧光恢复的时间终点数据。表达天然蛋白以及含S-氟代脯氨酸和脱氢脯氨酸变体的细胞沉淀均呈现典型的亮色，表明发色团结构完整。相比之下，含有 R-氟代脯氨酸和二氟代脯氨酸的变体保持无色，表明蛋白质发生错误折叠并以包涵体形式沉积。SDS-PAGE 分析证实了含有 R-氟代脯氨酸的蛋白质存在于不溶性组分中。而天然蛋白质以及含有 S-氟代脯氨酸和脱氢脯氨酸的变体则存在于可溶性组分中。在液相色谱/质谱分析中，每个脯氨酸被 S-氟代脯氨酸取代时，每摩尔脯氨酸残基产生 +18 道尔顿的质量偏移，而被脱氢脯氨酸取代时则产生每残基 -2 道尔顿的质量偏移。在光吸收和发射光谱中，EGFP 的发色团吸收峰位于 488 纳米，NowGFP 位于 493 纳米。在 KillerOrange 中，发色团的吸收区域包含两个吸收带，对应于其复杂发色团的两种可能的构型和电荷状态。此外，在相应最大吸收波长激发下记录的荧光光谱表明，这些类似物并未改变发色团的化学环境。在复性实验中，天然 EGFP 发色团的荧光部分恢复，尽管色氨酸特异性荧光在复性后更强。含脱氢脯氨酸的变体也表现出类似行为。在含有 S-氟代脯氨酸的 EGFP 中，使用 295 纳米激发时观察到类似结果，而在 488 纳米激发时荧光恢复程度显著更高。只有 EGFP 变体表现出快速的复性动力学，其色氨酸发射恢复速度是发色团发射恢复速度的两倍。必须使用新鲜的细菌培养物及适宜的培养基。无菌操作技术和对培养物生长的定期监测也是实验成功的重要前提。该方法适用于蛋白质工程，可用于研究其他标准氨基酸的作用，但需要相应的营养缺陷型大肠杆菌菌株和氨基酸类似物。需要对完整蛋白质进行质谱分析，以提供分析证据，确认非经典氨基酸类似物的成功掺入。通过选择性压力掺入（SPI）方法引入脯氨酸类似物，可直接操控蛋白质主链，并在全局稳定性、核糖体翻译效率或蛋白质折叠的改善方面具有优势，有利于蛋白质的理性设计和高效生产。

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科研

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生物工程

荧光蛋白中脯氨酸类似物对脯氨酸的残基特异换:骨架的"分子手术"如何影响折叠和稳定性

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荧光各向异性作为研究蛋白质-蛋白质相互作用的工具

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通过非天然氨基酸的选择性压力整合及质谱与荧光蛋白分析技术构建“金色”荧光蛋白

本文描述了评估荧光蛋白对错误折叠的多聚谷氨酰胺扩展的聚集性和毒性影响的实验方案，可用于在荧光报告系统背景下快速评价一种新发现但尚未表征的荧光蛋白。...

利用酵母中多聚谷氨酰胺毒性检测评估荧光蛋白对融合伴侣的影响

本文介绍了一种利用酶促反应将蛋白质单体连接成具有可控序列的蛋白质聚合物，并将其固定在表面用于单分子力谱研究的实验方案。...

OaAEP1介导的聚合蛋白酶法合成及其在单分子力谱学中的固定

在有机相与水相溶剂的界面处，经设计的两亲性弹性蛋白样蛋白会响应环境参数，自组装形成囊泡、纤维和凝聚体等复杂的超分子结构。所述组装方案可制备具有可调控特性的蛋白膜基区室（PMBCs），实现多种货物分子的包封。...

弹性蛋白样蛋白的定向组装形成特定超分子结构及体外货物包封

本文提供了一种简单明了的实验方案，利用遗传密码子扩展技术（GCE）对Salmonella分泌的效应蛋白进行位点特异性标记，并通过直接随机光学重建显微镜（dSTORM）在HeLa细胞中成像观察分泌蛋白的亚细胞定位。...

利用遗传密码子扩展技术对细菌分泌蛋白进行超分辨率成像

动力蛋白超家族蛋白的功能依赖于与GTP水解相偶联的构象变化。本文描述了一种利用单分子FRET（smFRET）技术监测类动力蛋白GTP酶atlastin在不同核苷酸负载状态下构象动态变化的系统。...

单分子FRET成像观察动力蛋白样GTP酶Atlastin的构象动力学

了解将脯氨酸类似物掺入荧光蛋白以研究蛋白质折叠和功能的方法。该技术通过分子手术实现蛋白质骨架的精确修饰，无需昂贵设备即可探索脯氨酸残基对蛋白质稳定性的影响。

荧光蛋白中脯氨酸残基特异性替换为脯氨酸类似物：骨架“分子手术”如何影响折叠与稳定性

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