荧光蛋白中脯氨酸残基特异性替换为脯氨酸类似物：骨架“分子手术”如何影响折叠与稳定性

在大多数情况下，传统的定点突变技术并不适合研究脯氨酸在蛋白质中的功能作用。本文介绍了一种将脯氨酸类似物作为非天然氨基酸掺入核糖体合成蛋白质的方法，以研究脯氨酸残基对蛋白质折叠与功能的影响。用标准氨基酸替换脯氨酸是一种具有风险的方法。

引入脯氨酸类似物可实现一种分子层面的“手术”，即通过引入细微的分子改变，从而合理地影响和调控蛋白质的性质。由于脯氨酸残基在蛋白质骨架稳定性中发挥关键作用，本技术有助于阐明导致蛋白质折叠缺陷的机制，而这些缺陷正是某些人类病理状态的基础。

由脯氨酸替换所引发的蛋白质改变对酶的生物技术工程具有重要意义，并为核糖体蛋白质翻译或折叠的优化提供了机会。该方法无需特殊设备和昂贵的仪器。在向大肠杆菌培养物中添加脯氨酸类似物之前，需特别注意耗尽其中天然脯氨酸的实验步骤。

为开始生产含有天然脯氨酸的荧光蛋白，取两毫升过夜培养物接种于装有200毫升新鲜NMM培养基的两升锥形瓶中。将细胞在37摄氏度、220转/分钟的振荡摇床中培养约3.5小时。在培养期间，每隔30分钟使用分光光度计在600纳米处测定一次光密度。

当光密度达到0.7时，离心收集菌体悬液，并小心地将上清液倒入废液中。随后，用50毫升冰预冷的不含任何氨基酸的NMM培养基或不含脯氨酸的NMM培养基重悬菌体进行洗涤。再次离心菌体，并将上清液倒入废液中。

接下来，用移液器在含有氨苄青霉素但不含脯氨酸的200毫升NMM培养基中轻轻重悬细胞沉淀，置于2升的锥形瓶中，并在摇床中孵育30分钟，以确保脯氨酸完全耗尽。孵育结束后，从50毫摩尔的储备液中加入适量的L-脯氨酸或脯氨酸类似物，使细胞悬液中的终浓度为1毫摩尔。接着，从1摩尔的储备液中加入500微摩尔的IPTG以诱导目标蛋白的表达。

在37摄氏度的摇床中过夜表达目标蛋白，次日测量光密度。通过离心收集细菌细胞，并将上清液倒入废液。然后，用含有10%甘油的50毫升结合缓冲液通过小心移液洗涤细胞。

再次离心细胞，弃去上清液，将细胞沉淀置于50毫升离心管中，在-20或-80摄氏度下保存，直至后续使用。在检测荧光发射之前，先进行SDS-PAGE分析，以确保样品纯度高于95%。然后，根据在相应波长下测得的吸光度值，将每种纯化后的蛋白变体样品调整至浓度为0.3微摩尔。确保各样品的最终体积约为200微升。

将稀释后的样品在室温下平衡。一小时后，将样品转移至光程为一厘米的石英比色皿中，并使用荧光光谱仪测定样品的荧光发射光谱。为诱导变性，将每种蛋白变体的两微升300微摩尔样品加入到18微升含有8.89摩尔尿素和5.56毫摩尔DTT的1.11倍PBS缓冲液中，进行二十倍稀释。

将样品在 95 摄氏度下孵育五分钟。然后，通过加入含有 5 毫摩尔 DTT 的 1,980 微升 PBS 将样品稀释 100 倍以诱导复性，并立即转移 200 微升样品至一个 1 厘米的石英比色皿中。将石英比色皿插入合适的荧光光谱仪中，通过每三秒采集一次荧光光谱，持续监测 30 分钟的蛋白质复性过程。

将复性样品转移至1.5毫升微量离心管中，盖紧管盖，于室温避光条件下孵育，以使EGFP变体充分复性。24小时后，使用与之前相同的激发波长测定复性后蛋白样品的荧光发射，以获取荧光恢复的时间终点数据。表达天然蛋白以及含S-氟代脯氨酸和脱氢脯氨酸变体的细胞沉淀均呈现典型的亮色，表明发色团结构完整。

相比之下，含有 R-氟代脯氨酸和二氟代脯氨酸的变体保持无色，表明蛋白质发生错误折叠并以包涵体形式沉积。SDS-PAGE 分析证实了含有 R-氟代脯氨酸的蛋白质存在于不溶性组分中。而天然蛋白质以及含有 S-氟代脯氨酸和脱氢脯氨酸的变体则存在于可溶性组分中。

在液相色谱/质谱分析中，每个脯氨酸被 S-氟代脯氨酸取代时，每摩尔脯氨酸残基产生 +18 道尔顿的质量偏移，而被脱氢脯氨酸取代时则产生每残基 -2 道尔顿的质量偏移。在光吸收和发射光谱中，EGFP 的发色团吸收峰位于 488 纳米，NowGFP 位于 493 纳米。在 KillerOrange 中，发色团的吸收区域包含两个吸收带，对应于其复杂发色团的两种可能的构型和电荷状态。

此外，在相应最大吸收波长激发下记录的荧光光谱表明，这些类似物并未改变发色团的化学环境。在复性实验中，天然 EGFP 发色团的荧光部分恢复，尽管色氨酸特异性荧光在复性后更强。含脱氢脯氨酸的变体也表现出类似行为。

在含有 S-氟代脯氨酸的 EGFP 中，使用 295 纳米激发时观察到类似结果，而在 488 纳米激发时荧光恢复程度显著更高。只有 EGFP 变体表现出快速的复性动力学，其色氨酸发射恢复速度是发色团发射恢复速度的两倍。必须使用新鲜的细菌培养物及适宜的培养基。

无菌操作技术和对培养物生长的定期监测也是实验成功的重要前提。该方法适用于蛋白质工程，可用于研究其他标准氨基酸的作用，但需要相应的营养缺陷型大肠杆菌菌株和氨基酸类似物。

需要对完整蛋白质进行质谱分析，以提供分析证据，确认非经典氨基酸类似物的成功掺入。通过选择性压力掺入（SPI）方法引入脯氨酸类似物，可直接操控蛋白质主链，并在全局稳定性、核糖体翻译效率或蛋白质折叠的改善方面具有优势，有利于蛋白质的理性设计和高效生产。