Name: 卡利内克特氏菌中神经肽的多方面质谱研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-31T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: 了解利用质谱技术对卡利内克特氏菌神经肽进行序列分析、定量检测和空间定位的完整实验流程。该方法适用于多种内源性肽类研究，有助于发现疾病生物标志物并推动肽类治疗药物开发。

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本研究得到了美国国家科学基金会（CHE-1710140 和 CHE-2108223）以及美国国立卫生研究院（NIH）R01DK071801 项目资助。A.P. 部分受 NIH 化学-生物学交叉领域培训项目（T32 GM008505）支持。N.V.Q. 部分受美国国立卫生研究院资助，该资助为国家心肺血液研究所向威斯康星大学麦迪逊分校心血管研究中心颁发的露丝·L·柯什斯坦国家研究服务奖（T32 HL007936）。L.L. 感谢 NIH 提供的 R56 MH110215、S10RR029531 和 S10OD025084 项目资助，同时也感谢威斯康星校友研究基金会和威斯康星大学麦迪逊分校药学院提供的资金支持，包括维拉斯杰出成就教授职位和查尔斯·墨尔本·约翰逊教授职位。

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作者无任何利益冲突需要披露。

准确鉴定、定量和定位神经系统中发现的神经肽和内源性肽对于理解其功能至关重要23,24。质谱技术是一种强大的分析方法，即使在基因组尚未完全测序的生物体中，也能实现上述目标。本方案展示了通过LC-ESI-和MALDI-MS联用，对从C. sapidus组织中采集的样本进行神经肽的检测、定量和定位的能力。
在进行 LC-ESI-MS 分析的样品制备过程中，必须考虑若干因素。尽管质谱（MS）是一种灵敏的技术，但神经组织中肽的浓度极低（可低至飞摩尔级别25），这构成了严重限制。必须谨慎进行样品制备，不仅要去除更丰富且具有干扰性的基质成分（如蛋白质和脂质），还需在每一步骤中尽量减少神经肽的损失26,27。例如，可通过使用抗肽吸附的微量离心管来减少样品损失。根据目标组织的组成，可采用不同的溶剂（用于...

神经系统十分复杂，需要由神经元构成的网络来在生物体内传递信号。神经系统负责协调感觉信息和生物学反应。信号传递过程中涉及复杂且错综的相互作用，需要多种不同的信号分子，如神经递质、类固醇和神经肽。由于神经肽是最多样化且效力最强的信号分子，在激活对压力及其他刺激的生理反应中发挥关键作用，因此明确其在这些生理过程中的具体功能具有重要意义。神经肽的功能与其氨基酸结构密切相关，该结构决定了其迁移性、受体相互作用及亲和力1。研究人员已采用组织化学技术（该技术尤为重要，因为神经肽可在组织的不同区域合成、储存和释放）以及电生理学方法来研究神经肽的结构与功能2,3,4，但这些方法在通量和特异性方面存在局限，难以解析神经肽庞大的序列多样性。
质谱分析法（MS）能够对神经肽的结构和丰度进行高通量分析。该分析可通过不同的质谱技术实现，最常用的是液相色谱-电喷雾电离质谱法（LC-ESI-MS）5 基质辅助激光解吸/电离质谱（MALDI-MS）6利用高精度质谱测量和串联质谱碎裂技术，质谱法能够在不依赖复杂混合物中其他组分的情况下，确定神经肽的氨基酸序列及其翻译后修饰（PTM）状态。 先验的 知识，以帮助确定其功能7,8除了定性信息外，质谱技术还能通过非标记定量（LFQ）或基于标记的方法（如同位素标记或等重标记）实现神经肽的定量分析。9LFQ 的主要优势包括操作简单、分析成本低以及样品制备步骤减少，从而可最大限度降低样品损失。然而，LFQ 的缺点在于仪器使用时间成本增加，因其需要进行多次技术重复以应对运行间变异所引起的定量误差，这也导致其对微小变化的准确量化能力下降。基于标签的方法由于可利用多种稳定同位素对多个样品进行差异标记，随后将样品混合为单一分析物并同时通过质谱分析，因而系统性变异较小。该方法还可提高通量，但同位素标签的合成或购买通常耗时且成本较高。随着多重检测水平的提高，全扫描质谱（MS1）的谱图复杂性也随之增加，导致能够被碎裂并被鉴定的独特神经肽数量减少。相反，同重元素标记在 MS1 水平不会增加谱图复杂性，但对神经肽等低丰度分析物会带来挑战。由于同重元素定量是在碎片离子质谱（MS2）水平进行的，低丰度神经肽可能无法被定量，因为更丰富的基质成分可能优先被选中进行碎裂，而被选中的离子本身丰度也可能不足以实现准确定量。而在同位素标记方法中，每一个被鉴定出的肽段均可进行定量分析。
除了鉴定和定量之外，还可通过基质辅助激光解吸电离质谱成像（MALDI-MSI）10获得分子定位信息。通过在样品表面逐点扫描激光，可将质谱数据按每个 m/z 值整合生成热图图像。在不同条件下绘制神经肽信号强度在各脑区的分布图，可为功能判定提供重要信息11。神经肽的定位尤为重要，因为其功能可能随分布位置的不同而发生变化12。
神经肽的丰度较低 体内 比其他信号分子（如神经递质）更敏感，因此需要采用高灵敏度的方法进行检测13这可以通过去除丰度较高的基质成分（如脂质）来实现11,14与常见的蛋白质组学工作流程相比，在进行神经肽分析时需要额外考虑一些因素，主要原因在于大多数神经肽组学分析省略了酶解步骤。由于多数数据分析软件的算法基于蛋白质组学数据，并依赖于通过肽段检测来推断蛋白质匹配，因此这一限制影响了可用于神经肽数据分析的软件选择。然而，诸如 PEAKS 等多种软件15 更适用于神经肽分析，因为它们 从头合成 测序能力。从提取方法到质谱数据分析，多个因素需要在神经肽分析过程中加以考虑。
本文所述方案包括样品制备和二甲基同位素标记、数据采集以及利用液相色谱-电喷雾电离质谱（LC-ESI-MS）、基质辅助激光解吸电离质谱（MALDI-MS）和基质辅助激光解吸电离质谱成像（MALDI-MSI）对神经肽进行数据分析的方法。通过多个实验的代表性结果，展示了这些方法在鉴定、定量和定位蓝蟹（Callinectes sapidus）神经肽方面的有效性与能力。为了更好地理解神经系统，通常会使用模式系统。许多生物体尚无完整的测序基因组，这限制了在肽段水平上全面发现神经肽。为应对这一挑战，本文还包括一种用于鉴定新神经肽并结合转录组挖掘以构建缺乏完整基因组信息生物体数据库的方案。此处提供的所有方案均可针对任何物种的神经肽样品进行优化，并适用于任何内源性肽段的分析。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;化学品、试剂和耗材&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2,5-二羟基苯甲酸（DHB）基质</td><td>Supelco</td><td>39319</td><td></td></tr><tr><td>乙酸</td><td>Fisher Chemical</td><td>A38S-500</td><td></td></tr><tr><td>乙腈 Optima LC/MS 级</td><td>Fisher Chemical</td><td>A955-500</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢铵</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9830</td><td></td></tr><tr><td>硼烷吡啶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179752</td><td></td></tr><tr><td>Bruker 肽段校准混合物</td><td>布鲁克道尔顿</td><td>NC9846988</td><td></td></tr><tr><td>毛细管</td><td>Polymicro</td><td>1068150019</td><td>制作纳流色谱柱（75 &amp;micro;m 内径 × 360 &amp;micro;m 外径）</td></tr><tr><td>冷冻切片机杯</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6032</td><td>任何杯子或模具均可使用</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;微量离心管</td><td>Eppendorf</td><td>30108434</td><td></td></tr><tr><td>甲醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252549</td><td></td></tr><tr><td>甲醛 - D2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>492620</td><td></td></tr><tr><td>甲酸 Optima LC/MS 级</td><td>Fisher Chemical</td><td>A117-50</td><td></td></tr><tr><td>明胶</td><td>Difco</td><td>214340</td><td>置于37 &amp;deg;C 水浴以融化</td></tr><tr><td>疏水屏障笔</td><td>Vector Labs</td><td>15553953</td><td></td></tr><tr><td>氧化铟锡（ITO）涂层玻片</td><td>Delta Technologies</td><td>CB-90IN-S107</td><td>25 mm × 75 mm × 0.8 mm（宽 × 长 × 厚）</td></tr><tr><td>LC-MS 小瓶</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>TFMSCERT5000-30LVW</td><td></td></tr><tr><td>甲醇 Optima LC/MS 级</td><td>Fisher Chemical</td><td>A456-500</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7793</td><td>疏水膜</td></tr><tr><td>pH 指示试纸</td><td>Supelco</td><td>109450</td><td></td></tr><tr><td>红磷团簇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>343242</td><td></td></tr><tr><td>反相C18材料</td><td>Waters</td><td>186002350</td><td>手动填充至纳流色谱柱</td></tr><tr><td>修正液笔</td><td>BIC</td><td>150810</td><td></td></tr><tr><td>ZipTip</td><td>Millipore</td><td>Z720070</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;仪器与工具&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>自动基质喷雾系统 - M5</td><td>HTX Technologies, LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>离心机 - 5424 R</td><td>Eppendorf</td><td>05-401-205</td><td></td></tr><tr><td>冷冻切片机- HM 550</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>956564A</td><td></td></tr><tr><td>干燥剂</td><td>Drierite</td><td>2088701</td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>WPI</td><td>501764</td><td></td></tr><tr><td>MALDI 不锈钢靶板</td><td>布鲁克道尔顿</td><td>8280781</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Lite XLS</td><td>Rainin</td><td>17014391</td><td>200 &amp;micro;L</td></tr><tr><td>Q Exactive Plus 混合四极杆-轨道阱</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>IQLAAEGAAPFALGMBDK</td><td></td></tr><tr><td>RapifleX MALDI-TOF/TOF</td><td>布鲁克道尔顿</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac - SVC100</td><td>Savant</td><td>SVC-100D</td><td></td></tr><tr><td>超声波清洗器</td><td>Bransonic</td><td>2510R-MTH</td><td>用于超声处理</td></tr><tr><td>超声波均质器</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB120110</td><td>FB120 超声波破碎仪配 CL-18 探头</td></tr><tr><td>真空泵 - Alcatel 2008 A</td><td>理想真空产品</td><td>P10976</td><td>极限压力 = 1 × 10&lt;sup&gt;-4&lt;/sup&gt; 托尔</td></tr><tr><td>涡旋混合器</td><td>康宁</td><td>6775</td><td></td></tr><tr><td>水浴锅（37°C）— Isotemp 110</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-460-10</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;数据分析软件&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Expasy</td><td>https://web.expasy.org/translate/</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlexAnalysis</td><td>布鲁克道尔顿</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlexControl</td><td>布鲁克道尔顿</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlexImaging</td><td>布鲁克道尔顿</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PEAKS Studio</td><td>Bioinformatics Solutions, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SCiLS Lab</td><td>https://scils.de/</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SignalP 5.0</td><td>https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0</td><td></td><td></td></tr><tr><td>tBLASTn</td><td>http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=tblastn&amp;&BLAST_&lt;br/&gt; 程序=tblastn&amp;amp;PAGE_&lt;br/&gt; 类型=序列比对搜索&amp;和&lt;br/&gt; 默认=开启&amp;amp;LINK_LOC&lt;br/&gt; =blasthome</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

callinectes sapidus 中神经肽的多维度质谱分析

Multi-Faceted Mass Spectrometric Investigation of Neuropeptides in Callinectes sapidus

神经肽是调节几乎所有生理和行为过程的信号分子，例如发育、繁殖、摄食以及对外部应激源的反应。然而，神经肽的生化作用机制及其种类组成和功能角色仍远未被充分阐明。这类信号分子具有极高的多样性，阻碍了对其内源性肽的鉴定与表征。此外，神经肽在突触释放后易受酶降解，且其生物活性浓度比神经递质低100至1000倍。质谱法（MS）是一种高灵敏度的分析工具，可在无需全面预知目标分子的情况下实现对分析物的鉴定、定量和定位 先验的 知识。该方法非常适合于神经肽的全局分析，并有助于发现新的肽类物质。由于此类肽在生物体内丰度低且化学性质高度多样，研究人员已从蛋白质组学技术中借鉴并优化了多种样品制备方法、质谱采集参数以及数据分析策略，以实现对神经肽的最佳表征。本文描述了从复杂生物组织中分离神经肽的方法，结合液相色谱-质谱（LC-MS）和基质辅助激光解吸/电离质谱（MALDI-MS），用于神经肽的序列鉴定、定量分析和定位研究。同时提供了一种从蓝蟹构建神经肽数据库的实验方案，美洲蓝蟹一种缺乏完整基因组信息的生物体也被纳入其中。这些工作流程可根据不同物种内源性肽的种类，结合多种仪器进行调整和应用。

样品制备和质谱分析的工作流程如图1所示。在分离神经组织后，进行匀浆、提取和脱盐以纯化神经肽样品。如果需要基于同位素标记的定量分析，则对样品进行标记并再次脱盐。最终得到的样品通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行神经肽的鉴定与定量分析。
通过蛋白质组学软件鉴定的神经肽应具有良好的肽段碎片序列覆盖率，但目前这一标准尚未在全球范围内明确定义或标准化。对于绝对鉴定，每个氨基酸都应产生一个能够提供明确鉴定和定位信息的碎片离子。此外，还必须与合成肽段进行比对，以确认各个碎片离子的强度。由于对每一个假定的鉴定结果均进行此类验证的成本过高而不可行，因此通常根据置信度来描述鉴定结果，即观测到的碎片离子越多，肽段鉴定的置信度越高。尽管图2A、B所示的两个神经肽均具有100%的序列覆盖率，并且质量误差低于设定的0.02 Da最大限值，但仅基于三个碎片离子所获得的较差碎片覆盖率（仅见于图2B</stron...

神经肽的质谱表征可提供序列、定量和定位信息。该优化的工作流程不仅适用于神经肽研究，也适用于其他内源性肽类。本文提供的实验方案描述了使用液相色谱-电喷雾电离质谱（LC-ESI-MS）、基质辅助激光解吸/电离质谱点样（MALDI-MS spotting）以及基质辅助激光解吸/电离质谱成像（MALDI-MS imaging）进行神经肽的样品制备、质谱采集、质谱分析及数据库构建。

Callinectes sapidus 中神经肽的多维度质谱分析

神经肽是信号分子，几乎调控所有生理和行为过程，如发育、繁殖、摄食以及……

内源性肽类的分析是一个尚未得到充分研究的领域，这些肽类比大多数蛋白质小，但比许多消化产生的肽段大。本方案针对基于质谱技术的工作流程中存在的空白。质谱具有高度灵敏性，既可用于靶向特定的神经肽，也可用于捕获和检测样品中多种神经肽。通过质谱法对神经肽表达进行定量和定位，可促进肽类治疗药物的开发，并发现多种疾病的神经肽生物标志物。开始神经肽提取时，从甲壳类动物中采集脑组织，用镊子立即将每份组织放入含有20微升酸化甲醇的0.6毫升离心管中。向样品中加入150微升酸化甲醇。将超声波细胞破碎仪的总处理时间设为24秒，脉冲时间为8秒，间歇时间为15秒，振幅为50%，并在冰上对样品进行匀浆。随后在4°C条件下以20,000 ×g离心20分钟。用移液器将上清液转移至离心管中，并在约35°C下用真空浓缩仪干燥。为去除盐分，将提取的组织样品重新溶解于20 µL 0.1%甲酸中。涡旋混合溶液，并在室温水浴中超声处理1分钟。取0.5微升样品滴加到pH试纸上，确认pH值小于4。在4摄氏度、20,000 ×g条件下离心30秒。在illusion溶液中配制润湿平衡洗涤液。取一支含C18树脂的10微升脱盐小柱。将脱盐小柱安装在设定为15微升的20微升移液枪上。先用润洗液抽吸洗涤三次，再用平衡溶液抽吸三次。吸取样本，上下吹打10次，随后用洗涤液洗涤3次，每次洗涤后弃去洗液。依次用乙腈浓度递增的洗脱液分别吹打10次进行洗脱。将所得神经肽在真空浓缩仪中干燥。将干燥的脱盐神经肽用五微升（5 µL）0.1%甲酸溶液重新溶解。涡旋混匀溶液，并在室温水浴中超声处理一分钟。短暂离心，2000 × g。用于点样神经肽和甲壳组织时，用移液器吸取三微升（3 µL）样品液滴至疏水膜上。用移液器将3 µL DHB基质直接滴加到样品液滴上。通过上下吹打混合溶液。取1 µL样品与基质的混合液加入MALDI不锈钢靶板的样品孔中，并用移液器吸头将混合液铺展至样品孔边缘。将一微升的等量基质混合液点样至靠近样品的孔中。将含有干燥样品点的靶板插入基质辅助激光解吸电离串联飞行时间质谱仪中。使用DHB基质时，将激光功率设为95%，选择自动最优检测器增益和智能完整样品载体移动模式。在质荷比（M/Z）200 至 3,200 范围内采集质谱图，并将每个位点的多个质谱图叠加，以提高神经肽信号的信噪比。取半杯明胶填充冷冻切片机样品杯，于室温下使其凝固。将剩余的液态明胶置于 37 摄氏度水浴中保温。从动物体内采集所需的神经组织，用镊子将组织立即浸入含有去离子水的0.6毫升离心管中，持续一秒钟。将组织置于固态明胶上方，并用液态明胶填满冷冻切片机模具的其余部分。使用镊子调整组织的位置。将冷冻切片机样品杯置于平坦的表面上，并用干冰冷冻。进行切片前准备时，通过切割去除包埋胶原的样品周围的模具，使样品与冷冻切片机模具分离。将包埋的组织固定到冷冻切片机持样器上

multi-faceted-mass-spectrometric-investigation-neuropeptides

Research

科研

JoVE Journal

Chemistry

化学

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