使用可更换盖板的乳腺成像窗进行纵向活体显微成像

乳腺具有高度动态性，在整个生命周期中会经历多次重塑过程。本方案可用于捕捉驱动健康与病变乳腺组织重排的细胞动态变化。我们设计的乳腺成像窗口配有可更换的盖板，能够实现对乳腺组织的长期纵向活体成像，持续时间可达数周。

可更换的乳腺成像窗盖确保始终处于最佳成像条件，并可在成像间隔期间进行组织操作或给药。我们的方法不仅有助于深入了解健康乳腺腺体的生物学特性，还可让我们在单细胞水平上研究乳腺肿瘤的起始与进展。首先将乳腺成像窗的盖子置于无菌表面，并在整个盖缘周围涂抹氰基丙烯酸酯粘合剂。

将一个直径10毫米的圆形玻璃盖玻片小心地放置在盖子顶部。使用无菌的木棒来定位玻璃盖玻片，并施加一定压力将其压下，以确保玻璃盖玻片与盖子框架之间形成气密性密封。确保玻璃盖玻片不遮挡盖子臂部的孔洞。

将瓶盖和乳腺成像窗放入密闭的培养皿中，用80%乙醇浸泡至少30分钟进行消毒。用浸有丙酮的棉签擦去玻璃盖玻片上多余的氰基丙烯酸酯胶水。为小鼠手术做准备时，使用刀片剃除第四对乳腺周围区域的毛发。

以第四个乳头作为解剖标志，使用胶带去除松散的毛发。进行足底回缩试验，以确认动物是否已充分麻醉。用精细的格拉费镊子轻轻提起皮肤，使用小型弹簧剪在第四乳腺脂肪垫上方的皮肤上做一个10至15毫米的斜切口。以第四个乳头作为定位参考点，注意避免切割或损伤腹膜或乳腺组织。

使用钝性分离法沿切口线周围分离皮肤与乳腺脂肪垫及其下方的组织层，分离范围可达5至8毫米，以创建一个可容纳乳腺成像窗框架的囊腔。根据乳腺组织的宏观特征（包括淋巴结或肿瘤病灶的位置）确定感兴趣区域（ROI）。尽量使ROI相对于切口保持居中。

使用无菌镊子夹取乳腺成像窗，测试切口是否足够大以插入该成像窗。如有需要，可略微扩大切口，直至乳腺成像窗能够放入。取出成像窗后，使用5-0丝线缝合线，在距离切口边缘1至2毫米处，从切口尾端开始，由皮肤外侧向内侧进行荷包缝合。

沿切口向上移动约五毫米，将缝合线从切口内侧穿出至皮肤外侧。沿切口边缘重复此操作，形成由五到六个环组成的环形缝合。缝合线的最终穿出点应位于距离第一个进针点约二至五毫米处。

将乳腺成像窗口置入切口内，使用格拉费镊子小心地将皮肤放入窗口的凹槽中。确保将缝线的线环留在外面。拉紧荷包缝合线的线环，并轻轻拉动缝线的两端，使缝线在乳腺成像窗口的凹槽内收紧。

用外科结扎法打结并剪除多余的缝线。使用牙签将凡士林涂抹在窗口内缘，避免接触下方组织。用无菌镊子轻轻将窗口框架向下推，并将盖片置入窗口框架中。

这可以避免乳腺组织与乳腺成像窗盖之间存在空气。将细镊子的尖端穿过盖子臂上的孔，顺时针旋转以拧紧盖子。如果拧紧盖子后仍有少量空气残留，可将无菌胰岛素针头穿过皮肤插入乳腺组织与盖子之间的空腔，缓慢拉动针筒活塞，从而在乳腺组织与乳腺成像窗盖之间形成真空。

经过此操作后，即可清晰观察到淋巴结。检查乳腺成像窗口框架及盖片的状况，包括缝合线的稳定性以及盖片是否存在潜在损伤。将小鼠放置于嵌入板上，使乳腺成像窗口对准成像盒嵌入板上的孔洞。

在小鼠背部贴上半透明纸胶带，以固定小鼠并减少因呼吸导致的组织运动。对于超过三小时的成像实验，将一根柔性针头皮下插入小鼠颈部，并用纸胶带固定。将装有营养混合液的10毫米注射器连接至柔性硅胶管，并推动注射器，使营养混合液到达管路末端。

将硅胶管连接至柔性针头，每隔30分钟注入50 µL灌注溶液。盖上成像盒的盖子以封闭。然后，将成像盒固定在显微镜的载物台上。

确认小鼠在成像盒内保持稳定。使用显微镜的落射荧光模式定义感兴趣区域，并应用显微镜设置。在成像软件的导航模式下使用螺旋扫描功能，生成大范围的概览拼接图像，创建组织的参考图谱。

在螺旋概览图像中定义感兴趣区域，然后设定上下Z平面以确定Z轴层厚。按下“开始”按钮，获取组织的详细三维或四维Z轴堆栈图像。将细镊子的尖端穿过盖子臂部的乳腺成像窗口孔洞，逆时针旋转以松开盖子。

或者，可使用无菌钝头镊子操作或重新定位组织，以优化特定感兴趣区域的成像条件。将凡士林涂抹在乳腺成像窗的内侧边缘，注意避免接触下方组织。用无菌镊子轻轻将窗口框架向下推，并将盖子放入窗口框架中。

最后，将细镊子的尖端穿过盖子臂部的孔，并顺时针旋转以松动并打开盖子。对处于青春期的 Rosa26 Cre/ERT2 Rosa26-膜定位番茄-膜定位 GFP 小鼠注射低剂量他莫昔芬，诱导 Cre 介导的 Rosa26-膜定位番茄-膜定位 GFP 等位基因重组。分别在第1、3、5天对小鼠进行成像，以追踪发育中乳腺的动态变化。

代表性图像显示了通过乳腺成像窗口在多天内拍摄的细长且分支状乳腺导管的三维重建结果。此处展示了分支尖端和延伸分支的单个Z平面图像。基质中的单个细胞以白色星号标出。

代表性图像显示了通过乳腺成像窗口观察到的小鼠腹股沟淋巴结。二次谐波信号以绿色显示。此处展示了成年雌性E-cadherin膜定位CFP小鼠乳腺导管结构连续多日的三维重建图像。

使用I型胶原蛋白的图案来重新定位相同的ROI，使用E-钙黏蛋白膜CFP信号标记导管细胞。Kikume绿色-红色小鼠在转化前第0天以及暴露于紫光后进行成像。在转化后的第2、6和10天重复进行成像。

通过乳腺成像窗口对乳腺同一区域连续成像10天。在第0天对较小区域进行光转化，结果显示Kikume红色信号随时间呈现相似的稀释速率，表明上皮细胞各区域的更新速率一致。光转化后第6天和第10天，对指定区域的放大图像显示出细胞水平上的增殖异质性。

光转化后10天，对不同细胞的红色与绿色荧光比值进行定量分析，结果显示在同一导管微环境中，部分细胞的稀释速率存在高度差异。该实验流程中的关键步骤是在成像过程中间打开窗口盖板。这一独特的窗口设计改善了成像条件，实现了对组织的长期纵向成像。

具有可更换盖子的乳腺成像窗将有助于在小鼠乳腺肿瘤发生和进展领域，开展关于体内快速作用药物测试与筛选的新颖研究。