Name: 使用带有可更换盖子的乳腺成像窗口进行纵向活体腔内显微镜检查 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: 了解使用可更换盖乳腺成像窗口进行纵向活体腔内显微镜检查的方法。该技术可在数周内对小鼠乳腺组织进行长期成像，研究健康发育和肿瘤进展中的细胞动态变化。

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本工作得到了佛兰德斯研究基金会（博士研究生基础研究基金 11L7222N，授予 M.C.）、勃林格殷格翰基金会（博士研究生奖学金，授予 C.L.G.J.S.）、欧洲分子生物学组织（EMBO）博士后奖学金（基金号 ALTF 1035-2020，授予 C.L.G.J.S.）以及约瑟夫·施泰纳博士奖（授予 J.v.R）的支持。

本文所述所有操作均按照国际动物护理与使用委员会（IACUC）和鲁汶大学（KU Leuven）的指南进行，并在已批准的项目申请P160/2020的框架内实施。在执行本方案之前，请与机构兽医审查镇痛策略，并根据机构指南给予术前和术后镇痛处理。
1. R.MIW 的制备（预计耗时：2 h）
注意：在构建 R.MIW 时，建议寻找擅长加工钛等硬质材料的本地制造商，因为这需要特殊的工具和专业知识。专门从事钛合金假体设计与制造的车间通常具备生产 R.MIW 部件所需的设备和技术能力。
<ol>
	<li>将 R.MIW 的盖子外侧朝上放置在无菌表面上（盖子的臂部朝下倾斜；图 1A）。</li>
	<li>在盖子整个边缘涂抹氰基丙烯酸酯粘合胶，然后小心地将一个直径为 10 mm 的圆形玻璃盖玻片放置在盖子顶部。 
	注意：在手术过程中，务必额外准备一个带有玻璃盖玻片的备用盖子。</li>
	<li>使用无菌木棒调整玻璃盖玻片的位置，并施加一定压力使其压紧，以确保玻璃盖玻片与盖子框架之间形成气密性密封。确保盖子臂部上的孔未被玻璃盖玻片覆盖。</li>
	<li>将盖子和 R.MIW 放入密闭的培养皿中，浸入 80% 乙醇中至少 30 分钟进行消毒。 
	注意：避免将盖子在 80% 乙醇中浸泡超过 1 小时，以防氰基丙烯酸酯粘合胶溶解。</li>
	<li>使用浸有丙酮的棉签清除玻璃盖玻片上多余的氰基丙烯酸酯粘合胶。</li>
	<li>将盖子和 R.MIW 储存在无菌环境中，直至后续使用。 
	注意：R.MIW 框架和盖子可保存在无菌管或无菌袋中，最长不超过 1 周。重新开始实验时，务必在继续操作前检查玻璃盖玻片是否仍牢固地附着在盖子上。</li>
</ol>
2. 手术准备（预计耗时：15 分钟）
注意：进行 R.MIW 植入操作时，可使用任何品系的雌性小鼠（>3.5 周龄）。
<ol>
	<li>使用无菌手套以保持无菌状态，并对所有将与小鼠接触的物品进行灭菌。用清水和温和的肥皂清洗手术器械，自然晾干，用铝箔纸包裹，确保无裸露的角或边缘，然后在高压灭菌器中以121°C、20分钟的循环程序进行灭菌 120 °C 手术前</li>
	<li>准备无菌手术平台，并用80%乙醇对表面进行消毒。 
	注意：为确保无菌环境，手术可在超净工作台中进行。</li>
	<li>打开加热垫，并用无菌洞巾覆盖垫面。将无菌器械摆放在无菌洞巾上，将R.MIW和至少两个带玻璃盖的盖玻片置于盛有无菌磷酸盐缓冲液（PBS）的培养皿中（盖上皿盖以避免外界污染）。</li>
	<li>在诱导室中使用3%异氟烷/O₂麻醉小鼠2 混合物。确保动物处于足够放松的状态，能够轻松地进行操作，并顺利转移到鼻罩上，且无任何挣扎。</li>
	<li>将小鼠从诱导室转移至麻醉鼻罩，并将异氟烷浓度降低至1.5%–2%异氟烷/O₂2 混合物。通过足部回缩试验确认麻醉完全。</li>
	<li>进行足部回缩测试时，使用指甲或钝头镊子牢固地夹住动物足部。若未观察到任何肌肉反射，则认为动物已失去意识，可进行手术准备。在操作动物前执行此测试，并在麻醉和手术过程中定期重复，以确认麻醉状态。</li>
	<li>涂抹眼膏以防止角膜脱水。</li>
	<li>剃除第4区域周围的毛发th 使用剃须刀片解剖乳腺图2A）。使用 4th 以乳头为解剖标志。使用粘性胶带去除松散的毛发。 
	注意：也可使用脱毛膏去除毛发。</li>
	<li>用 80% 乙醇或聚维酮碘消毒暴露的皮肤，并将小鼠仰卧位置于无菌手术区域，鼻部插入含 1.5% 异氟烷/O₂ 的麻醉面罩2 混合物</li>
	<li>使用纸胶带固定小鼠的前肢和后肢。 
	注意：在手术期间及术后，应尽可能将麻醉后正在恢复的小鼠置于加热垫上。</li>
	<li>使用预先裁剪好的无菌手术单或纱布覆盖小鼠，暴露手术区域。</li>
</ol>
3. R.MIW 植入（预计耗时：30 分钟）
<ol>
	<li>通过足部回缩试验确认动物是否已充分麻醉。使用精细的格拉费镊子轻轻提起皮肤，再用小型弹簧剪在第四足垫上方皮肤处做一个10–15 mm的斜向切口。th 使用第4个乳腺脂肪垫th 乳头作为定位参考点（图2A）。注意不要切割或损伤腹膜或乳腺。</li>
	<li>根据乳腺组织的宏观特征（包括淋巴结或肿瘤病灶的位置）定义感兴趣区域（ROI），并尽量使 ROI 相对于切口保持居中。</li>
	<li>使用钝性分离法沿切口线周围分离皮肤与乳腺脂肪垫及下方组织层，分离范围可达5-8 mm，以形成可容纳R.MIW支架的囊袋图2BI).</li>
	<li>使用无菌镊子夹取R.MIW，测试切口是否足够大以插入窗片。如有需要，可略微扩大切口，直至R.MIW能够放入。</li>
	<li>移除R.MIW，使用5-0丝线（编织、不可吸收）在切口周围放置荷包缝合。从切口尾端开始，缝合线置于切口边缘外侧至内侧1-2 mm处。</li>
	<li>沿切口向上移动约5 mm，将缝合线从皮下穿出至皮肤表面。沿切口边缘重复此操作，形成由5–6个环组成的环形缝合。图 2BII缝线的最终穿出点应位于距离第一个进针点约2-5 mm处。 
	注意：缝合时切勿将缝线放置得过于靠近切口边缘，以免增加皮肤撕裂的风险；若缝线距离切口边缘过远，则会增加多余皮肤与R.MIW沟槽之间发生感染的风险。</li>
	<li>将R.MIW置入切口内，使用Graefe镊子小心地将皮肤放入R.MIW的凹槽中。确保缝线的线环留在外面。</li>
	<li>拉紧荷包缝合线的线环，并通过轻柔牵拉缝线的两端，将缝线收紧至R.MIW的凹槽内图 2BIII）。用外科结扎法打结固定，并剪除多余的线头。</li>
	<li>用牙签将凡士林涂抹于R.MIW内缘，注意避免接触下方组织。使用无菌镊子或两个手指轻轻将窗框向下推，并将眼睑置入R.MIW框架中（图1B这将避免乳腺组织与R.MIW盖之间存在空气体积。</li>
	<li>将细镊子的尖端穿过盖子臂上的孔，顺时针旋转盖子以拧紧（约 5°) (图1C 和 图 2BIV).</li>
	<li>若拧紧 R.MIW 盖后仍有空气残留，可使用无菌胰岛素针头去除多余空气。将针头穿过皮肤插入乳腺组织与盖子之间的空腔，缓慢拉动针管活塞，从而在乳腺组织与 R.MIW 盖之间形成负压。</li>
	<li>术后给予皮下注射镇痛剂，如丁丙诺啡（0.1 mg/kg，用无菌0.9% NaCl稀释）。术后8小时和16小时再次皮下注射丁丙诺啡。</li>
	<li>将小鼠放回笼中恢复，并密切观察直至其完全清醒，或直接进行步骤4以立即成像。</li>
	<li>在此术后阶段，应密切监测小鼠的生命体征，包括呼吸、反应性、行为、姿势和体重，以评估是否存在不适或并发症。仔细观察窗口周围皮肤是否有炎症或坏死迹象。若无并发症发生，R.MIW 可支持在植入后数周内进行多次重复的 IVM 检测。</li>
</ol>
<img alt="小鼠手术示意图，显示窗口植入切口位置、手术步骤及缝合细节。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63326/63326fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图2"> 
图2手术操作及窗植入的概述 (A) 在第4肋间附近做一斜切口th 通过钝性解剖分离雌性小鼠的乳头及其下方的皮肤和组织。B腹股沟淋巴结和脂肪垫的形状可用于确定组织的正确方位（I）。在切口周围的皮肤上缝合一圈荷包缝合线（II），安装窗框后，将缝合线收紧并固定于窗框凹槽内，打外科结固定（III）。最后一步是将盖片插入窗框并锁定（IV）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63326/63326fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
4. 通过R.MIW进行重复活体显微镜观察
注意：此处描述的重复性活体多光子成像（IVM）策略已针对配备有电动载物台和35.8 °C黑暗气候培养箱的倒置多光子共聚焦系统进行了优化。
<ol>
	<li>使用3%异氟烷/O2混合气体在诱导室中对小鼠进行麻醉。通过足部回缩试验（见步骤2.6）确认意识丧失。在成像过程中涂抹眼膏，以防止角膜脱水。</li>
	<li>检查R.MIW框架及盖板的状况，包括缝合线的稳定性以及盖板是否存在潜在损伤。若盖板受损，可按照步骤5所述方法进行更换。</li>
	<li>将小鼠转移至预热（37 °C）的定制成像盒（图3A）中，并将小鼠头部放入鼻罩。该成像盒包含一个可适配显微镜自动载物台的框架，框架设计用于固定带有与R.MIW直径相匹配圆孔的定制嵌件（图3A）。</li>
	<li>成像盒前端连接带有鼻罩的进气口，并通过2%-3%异氟烷/O2混合气体连接至异氟烷挥发罐。出气口连接至麻醉气体回收装置，以确保气体循环并防止异氟烷在盒内积聚。成像盒可使用透明盖板封闭。</li>
	<li>将小鼠放置于嵌件上，使R.MIW位于成像盒嵌件的孔洞中（图3A）。在小鼠背部覆盖Parafilm和纸胶带，以固定小鼠并减少因呼吸引起的组织运动。</li>
	<li>用盖板封闭成像盒，并将成像盒插入显微镜载物台。</li>
	<li>在成像过程中逐步降低异氟烷剂量，以维持稳定但较浅的麻醉状态（通常为1.5%-0.8%异氟烷/O2混合气体）。</li>
	<li>在成像期间提供适当的营养支持，具体如下：
	<ol>
		<li>对于持续时间&lt;3小时的成像，皮下注射200–300 µL无菌PBS以维持水合状态。</li>
		<li>对于持续时间&gt;3小时的成像，请按以下步骤操作：
		<ol>
			<li>对于长期成像，需向小鼠输注营养物质。使用市售的无菌输注液，其中含有氨基酸和葡萄糖。将一根柔性针头插入小鼠颈部皮下，并用纸胶带固定。</li>
			<li>将装有配制好营养液的10 mL注射器连接至柔性硅胶管，并推动营养液直至液体到达管路末端。</li>
			<li>将硅胶管连接至柔性针头。将管路末端从成像盒内部穿过其中一个孔洞引出（由内向外），确保针头连接端保留在盒内。</li>
			<li>每30分钟注射50 µL输注液。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将成像盒固定在显微镜载物台上，并使用显微镜的落射荧光模式确定感兴趣区域。</li>
	<li>根据小鼠模型设置合适的显微镜参数（图3B）。可利用血管结构、胶原纤维模式（通过二次谐波成像显示）以及其他稳定的解剖结构（如腹股沟淋巴结）作为定位标志。使用倒置多光子共聚焦显微镜进行图像采集，设置为12位深度，25倍水镜，Z轴步进大小为1.0至4.0 µm（总Z轴堆栈范围为150至800 µm）。采用以下标准设置：1024 × 1024分辨率，600 Hz扫描速度，双向扫描模式。</li>
	<li>通过激发波长860 nm、检测波长425–435 nm的二次谐波生成技术可视化I型胶原纤维。不同荧光染料的激发与检测波长见表1。</li>
</ol>
表1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63326/Table1.pdf" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
<ol start="12">
	<li>在成像软件的导航模式下使用螺旋扫描功能生成大范围的概览马赛克图像，以创建组织的参考图谱（图3B）。在螺旋概览图像中定义感兴趣区域（ROI），设定上下Z平面以确定Z轴堆栈范围。点击开始按钮，获取组织的详细三维（xyz）或四维Z堆栈图像（xyzt）。 
	注意：在整个成像实验过程中应密切监测小鼠状态。对于长时间的成像过程，建议使用脉搏血氧仪和体温探针。小鼠呼吸应保持规律且节奏稳定。若小鼠出现喘息迹象，应减少异氟烷的用量。</li>
	<li>每次成像结束后，将小鼠置于加热垫上直至完全清醒。若小鼠表现出不适或活动能力下降，应延长其在加热垫上的笼养时间，并提供营养凝胶而非常规饲料。 
	注意：在两次成像间隔期间，应密切观察小鼠是否出现不适症状，如摄食和饮水减少、呼吸急促、活动减少、震颤、异常体态或毛发凌乱等。若出现明显不适症状，应遵循机构关于动物福利的指导原则，并在达到人道终点时终止实验。</li>
	<li>每次重复成像时均需重复步骤4.1–4.12，并利用概览马赛克图像在多个时间点重新定位相同的位置（图3B）。成像频率取决于研究问题及所关注生物学过程的时间特性，通常从每天两次到每周一次不等。</li>
	<li>在预定实验周期结束时，对植入R.MIW的小鼠实施安乐死：先使用异氟烷进行深度麻醉，随后行颈椎脱位。如需进一步分析，可解剖取出目标器官进行ex vivo分析。</li>
	<li>或者，可保留动物用于未来的in vivo分析。此时，使用弹簧剪剪断固定R.MIW的囊袋缝线，再用钝头镊子小心地将窗口环从小鼠皮肤上分离。清理此前固定窗口的皮肤边缘，然后采用简单的连续缝合（使用可吸收材料，如聚乙醇酸）关闭创口。</li>
	<li>皮肤缝合完成后，用两个方结（共4次打结）将起始和末端缝线固定。为尽量减少组织缺血，打结应足够松散以保证皮肤边缘的血液流通。使用聚维酮碘对伤口进行消毒，以预防炎症并促进皮肤愈合。</li>
</ol>
<img alt="小鼠荧光显微镜装置；细胞可见性、组织操作和局部处理的示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63326/63326fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3：纵向体内显微成像（IVM）工作流程。（A）典型的多日体内显微成像（IVM）实验的示意图。（B）成年乳腺内肿瘤发生区域的成像。在每次成像前，可通过低分辨率的概览马赛克扫描图像（上图）帮助在后续成像日中识别感兴趣区域。胶原蛋白I的模式（二次谐波信号，品红色）、组织结构以及用不同荧光蛋白标记的细胞分布模式（分别显示为绿色、黄色和红色）可用于精确定位相同的组织区域。比例尺分别代表1 mm（概览马赛克图像）和100 µm（下图）。（C）R26-Confetti报告基因构建体的示意图。在他莫昔芬诱导的Cre重组作用下，Confetti构建体会发生随机重组，从而表达四种荧光蛋白之一（nGFP、YFP、RFP或mCFP）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63326/63326fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
5. 成像间隔期间打开和关闭 R.MIW 的盖子
<ol>
	<li>使用无菌手套保持无菌状态，并对所有将与小鼠接触的物品进行灭菌处理。手术前对手术器械进行高压灭菌（详见步骤2）。</li>
	<li>打开加热垫，用无菌手术单覆盖垫面，并在诱导室中使用3%异氟烷/O2混合气体对小鼠进行麻醉。通过足趾回缩反射测试确认麻醉深度是否充分。</li>
	<li>将小鼠从诱导室转移至麻醉鼻罩，并将异氟烷浓度降低至1.5%-2%异氟烷/O2混合气体。</li>
	<li>将细镊子的尖端插入盖子臂部的小孔中，逆时针旋转盖子以松动。如有需要，可在观察窗上滴加预热的无菌PBS（37 °C），以帮助松动盖子。</li>
	<li>将R.MIW的盖子置于含有无菌PBS的无菌培养皿中备用。先用去离子水清洁盖子的盖玻片，再用80%乙醇处理。将盖子保存在无菌PBS中直至后续使用。</li>
	<li>通过在组织表面滴加数滴无菌PBS，防止暴露的组织干燥。</li>
	<li>在暴露的组织上施加或注射感兴趣的物质或细胞，最大使用体积为50 µL。等待数分钟，直至液体被组织吸收。或者，可使用无菌钝头镊子操作或重新定位组织，以优化特定感兴趣区域的成像条件。</li>
	<li>在R.MIW内圈边缘涂抹凡士林，注意避免接触下方组织。按照步骤3.9所述方法将盖子安装至R.MIW框架中，将细镊子尖端插入盖子臂部的小孔，顺时针旋转盖子（约5°）以拧紧。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露

R.MIW 能够对健康和病变的乳腺进行原位纵向成像&#160;并能在发育的各个阶段对乳腺进行重复可视化观察。R.MIW 设计允许在实验过程中的任意时间点打开窗口。长期对目标组织进行可视化观察可能会受到阻碍，例如盖玻片上细胞碎片的积累。在此类情况下，可在成像前或成像后立即打开 R.MIW，以清洁整个可见组织区域及窗口盖。可拆卸的盖板还允许对组织进行操作，以及局部施加特定抑制剂和治疗药物、标记染料或特定类型的细胞。
该方法克服了先前所述的乳腺皮瓣手术的局限性4,7,8,13，仅限一次成像过程，可观察分支形态发生等过程（图5），稳态组织更新（图6），或在细胞水平上的肿瘤生长（图 3B然而，与此同时，R.MIW 允许在成像间隔期间对组织进行局部操作，这使得 R.MIW 相较于先前报道的 MIW 具有显著优势。3,18 以及其他所有成像窗口20,22打开R.MIW时，必须始终维持无菌条件，以防止任何感染源的引入。能够在无菌环境中打开R.MIW，使得每次成像前均可优化成像条件，从而显著改善对目标组织的长期可视化观察。特别是在富含脂肪细胞的基质中包埋的乳腺组织，这一点尤为重要。此外，可更换的盖板 uniquely 允许局部施用治疗药物、不同类型细胞、标记染料，或进行影像引导下的显微解剖，以及无需终止活体多光子显微成像（IVM）实验即可对组织实施其他各类局部操作。例如，在研究肿瘤起始时，可在确定的IVM时间点及精确的乳腺位置，将特定的癌细胞群体直接注射至导管树或基质中，前提是该感兴趣区域（ROI）可通过R.MIW环进行通达。在研究肿瘤进展时，可在IVM过程中对特定位置、特定微环境或具有特定行为的癌细胞群体进行光标记，随后在打开R.MIW后利用荧光解剖显微镜进行显微解剖。分离得到的细胞可进一步用于下游分析，如（单细胞）mRNA测序。通过采用此方法，可实现 体内 细胞行为与分子表达谱之间的关联。R.MIW 实现的局部给药优势在于，可在治疗前和治疗后直接对组织进行成像。将小鼠从成像盒中取出，并在打开 R.MIW 盖板后进行局部给药所需的时间间隔仅需数分钟，从而能够捕捉快速作用药物的即时效应阶段。
我们证明，通过R.MIW对乳腺进行活体显微成像（IVM）可兼容多种不同的荧光报告小鼠模型。由于脂肪组织丰富的环境成像难度较大，因此建议使用亮度较高的荧光蛋白。然而，如本研究所示，在理想的成像条件下，即使亮度较低的荧光蛋白（如mCFP）也可通过R.MIW实现可视化。不可避免的是，脂肪垫会阻碍对更深层导管结构的成像，从而将成像范围限制在较表浅的导管。在每次IVM实验开始时获取一幅低分辨率的概览图像，有助于识别适合高分辨率成像的、位置足够表浅的目标导管结构。在打开R.MIW后，可通过局部组织操作、去除结缔组织或重新调整脂肪组织的位置，优化被脂肪覆盖的特定感兴趣区域（ROI）的IVM成像效果。这是相较于以往所有窗口设计的一个重要优势，因为旧式窗口不允许进行此类操作，若需观察被覆盖区域则必须完全移除窗口本身。特别是对于腹股沟淋巴结的观察，建议轻柔地去除其上方的脂肪组织，以减少光散射，实现高分辨率成像。在进行组织操作时，务必保持无菌条件，并避免出血或对组织造成严重损伤，因为这些因素可能影响IVM实验期间所研究的生物学过程。
R.MIW 由钛制成，钛是一种在临床实践中常用于替代关节或骨板等硬组织的材料。与钢制窗口相比，钛具有多种优势，包括重量轻和化学性质惰性。21最近，多种其他材料被用于制备新型成像窗口，包括柔性硅窗20与R.MIW相比，柔性窗口无需缝合即可植入，适用于几乎所有解剖位置，尤其适合柔软且脆弱的组织。由于硅胶窗口具有轻质和可变形的特性，对动物活动能力的影响极小，因此可能更适用于研究组织快速扩张与生长的实验。20相较于钛版本的另一优势在于，硅窗与其他成像方式兼容，包括磁共振成像。20,27然而，需要注意的是，物镜是针对0.17 mm玻璃盖玻片进行优化的。此外，乳腺组织容易受到呼吸运动的影响，而使用柔性窗口尤其难以限制这种运动，特别是在使用倒置显微镜时。R.MIW设计以及将R.MIW固定在成像盒嵌件中的方式可最大限度地减少呼吸伪影。因此，采用所提出的R.MIW装置获取的图像不会因呼吸伪影而发生畸变。然而，组织定位可能出现轻微漂移，这类漂移通常较为缓慢，可通过使用采集后运动校正软件进行校正。28随着IVM技术工具箱的不断扩展2,20，每个实验的具体要求最终将决定最适宜的方法 体内 目标组织的可视化。不同的窗口设计各有优缺点，需根据具体的研究问题、可用的显微成像系统、所需的空间和时间分辨率以及所研究过程的总时长，确定最适宜的技术方案。
综上所述，R.MIW 能够在数天至数周的时间内，对乳腺发育、稳态及疾病过程中的细胞动态进行高分辨率表征。

乳腺上皮是哺乳动物中一种独特的分泌器官，可产生并分泌乳汁以哺育后代。在个体整个生命周期中，乳腺会经历多轮发育与生长，伴随组织结构和功能的改变1。根据不同的发育阶段，参与组织重塑的细胞类型以及其在导管树中的位置均有所不同。
多光子活体显微镜（IVM）能够在原位且干扰最小的环境中研究乳腺细胞的动态过程体内2,3,4。为了实现对乳腺组织的可视化观察，已有多种临时性的离体或皮肤瓣成像技术被报道，适用于乳腺发育的不同阶段，包括青春期4,5,6,7、成年期2,8、哺乳期9,10,11,12以及肿瘤动态过程13,14,15。尽管这些技术能够实现对乳腺细胞动态的高时空分辨率成像，但其观察时间仅限于数小时，而大多数乳腺组织重塑过程则需要数天至数周的时间。因此，亟需能够实现对目标组织长期光学观察的技术方法。多年来，已开发出多种用于乳腺肿瘤成像的永久性成像窗15,16,17,18，其中包括钛制乳腺成像窗（MIW）2,3,19。虽然该技术在研究乳腺肿瘤生长方面非常有效，但对健康乳腺结构的可视化观察仍仅限于术后数天内。最近开发了一种柔性硅基成像窗，可实现对青春期乳腺组织连续数周的观察20。然而，乳腺组织嵌于富含脂肪细胞的脂肪垫中，会导致强烈的光散射，从而限制了乳腺导管结构的清晰成像。因此，在长时间观察乳腺组织动态过程中，始终需要更优的成像条件。无论是传统的MIW，还是柔性硅基成像窗，在手术植入后均形成封闭系统，无法在成像前对组织进行操作或优化其物理位置。因此，随着时间推移，可能难以维持对下方乳腺组织的最佳光学通路。相比之下，皮肤瓣技术可在成像过程中对组织进行优化和重新定位，并可多次重复使用皮肤瓣进行成像2。然而，通过皮肤瓣进行多次成像的前提是两次手术之间需留出足够恢复时间（至少7天），以确保皮肤充分愈合，因此该方法主要适用于研究时间尺度较长的生物学过程。此外，由于该操作具有侵入性，且伤口闭合后存在较高的感染和瘢痕形成风险，不建议频繁实施该手术。
为了克服这些局限性，即在长时间内以高频率确保最佳成像条件，同时允许对组织进行操作，研究人员设计了一种改进的钛合金材质显微成像窗（MIW），其带有可更换的盖板（R.MIW），可用于在数天至数周的时间内对健康和病变的乳腺组织进行可视化观察2（图1A、B）。R.MIW为定制化设计，可提供最佳的组织通路，使在整个活体显微成像（IVM）实验过程中均可直接操作组织，从而实现对乳腺组织在正确时间和位置上的长期动态观察。当盖合时，R.MIW形成一个密闭系统，其密封性与传统的MIW相当（图1C）。在无菌条件下打开时，R.MIW允许对局部组织进行操作以改善光学通路，同时可实现局部给药，例如信号通路抑制剂或激动剂、注射特定类型的细胞（如肿瘤细胞或免疫细胞群体），或添加组织标记染料。在成像间隔期间，可随时打开盖板，而不会对下方组织造成损伤。
<img alt="紧凑型细胞组装设计；示意图和照片细节；光谱学应用。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63326/63326fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：可更换盖板的乳腺成像窗设计。（A）乳腺成像窗可更换盖板的俯视图和侧视图，其中10 mm盖玻片被粘附于环形结构上。（B）乳腺成像窗的俯视图和侧视图，由外环和内环组成，两者之间设有凹槽，可通过荷包缝合将成像窗固定在小鼠皮肤内。外环上有一个小凹槽，用于嵌合盖板的四个凸起（臂状结构）。（C）展示盖板开合机制的示意图与实物照片。倾斜的凸起结构确保盖板牢固地固定在窗框内部。本图经 Messal 等人2。 修改。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63326/63326fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
本方案描述了可重复乳腺成像窗（R.MIW）的设计与植入手术，以及一种纵向体内显微成像（IVM）策略，用于反复观察相同的乳腺导管并实现细胞分辨率水平的可视化。R.MIW可在多种荧光报告小鼠模型中，追踪乳腺腺体不同发育阶段的细胞分裂过程及形态学变化。综上所述，R.MIW有助于在乳腺腺体发育、稳态维持及疾病过程中，对细胞动态行为进行高分辨率的表征分析。

<table><tbody><tr><td>0.9% NaCl</td><td>BD</td><td>306573</td><td>其他品牌可选</td></tr><tr><td>10 mm 圆形盖玻片</td><td>费舍尔科技</td><td>10696365</td><td>其他品牌可选</td></tr><tr><td>5-0 编织丝线缝合线</td><td>爱惜康</td><td>W580</td><td></td></tr><tr><td>80% 乙醇</td><td>自制</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>麻醉诱导箱</td><td>肯特科学</td><td>VetFlo-MSEKIT</td><td></td></tr><tr><td>布托啡诺（Vetergesic&amp;reg;）</td><td>Ecuphar</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>棉签（无菌）</td><td>费舍尔科技</td><td>13113743</td><td>其他品牌可选</td></tr><tr><td>氰基丙烯酸酯粘合剂</td><td>乐泰</td><td>NA</td><td>其他品牌可选</td></tr><tr><td>眼膏</td><td>Duratears</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>柔性蝶形针</td><td>格瑞纳生物-一</td><td>450120</td><td>其他品牌可选</td></tr><tr><td>格拉夫镊子（钝头）</td><td>精细科学工具</td><td>11051-10</td><td></td></tr><tr><td>加热垫</td><td>肯特科学</td><td>RightTemp Jr.</td><td>其他品牌可选</td></tr><tr><td>成像箱</td><td>定制</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>输注营养混合液</td><td>贝朗</td><td>Nutriflex special 70/240</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素注射器</td><td>BD</td><td>324911</td><td>其他品牌可选</td></tr><tr><td>带自动载物台的倒置多光子显微镜</td><td>徕卡显微系统</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷蒸发器</td><td>肯特科学</td><td>VetFlo-1231K</td><td></td></tr><tr><td>持针器</td><td>精细科学工具</td><td>12510-14</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm 封口膜</td><td>西格玛-奥德里奇</td><td>P7793</td><td>半透明胶带</td></tr><tr><td>tesa 纸胶带</td><td>Tesa</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>凡士林</td><td>凡士林</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>剃须刀片</td><td>费舍尔科技</td><td>11904325</td><td>其他品牌可选</td></tr><tr><td>硅胶管</td><td>Solutions Elastomeres</td><td>NA</td><td>任何日用品</td></tr><tr><td>弹簧剪（小型）</td><td>精细科学工具</td><td>15018-10</td><td></td></tr><tr><td>无菌 PBS</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>注射器（10 ml）</td><td>BD</td><td>305482</td><td>其他品牌可选</td></tr><tr><td>细镊子</td><td>精细科学工具</td><td>11413-11</td><td></td></tr><tr><td>乳腺成像窗用钛合金盖</td><td>定制</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>钛合金乳腺成像窗</td><td>定制</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>木棒牙签</td><td>费舍尔科技</td><td>NC1678836</td><td>其他品牌可选</td></tr></tbody></table>

使用可更换盖板的乳腺成像窗进行纵向活体显微成像

Longitudinal Intravital Microscopy Using a Mammary Imaging Window with Replaceable Lid

乳腺的分支结构具有高度动态性，出生后会经历多个生长和重塑阶段。活体显微成像结合皮瓣手术或成像窗植入技术已被用于研究健康乳腺在不同发育阶段的动态变化。目前大多数乳腺成像技术仅限于数小时至数天的时间范围，而乳腺的主要重塑过程通常发生在数天至数周的时间尺度上。为了研究乳腺的重塑过程，需要能够长期提供对目标组织光学通路的方法。本文介绍了一种改进型钛合金乳腺成像窗，带有可更换盖板（R.MIW），可实现对乳腺组织长达数周的高分辨率、单细胞水平的成像。重要的是，R.MIW在整个活体成像实验期间均可提供对组织的通路，因此可用于局部组织操作、标记、药物递送或图像引导下的显微解剖。综上所述，R.MIW能够实现对乳腺发育、稳态及疾病过程中细胞动态行为的高分辨率表征。

为了研究乳腺在不同发育阶段中乳腺上皮细胞的增殖动态，我们执行了本方案。R.MIW 的设计如图1所示，R.MIW 植入操作流程总结于图2。R.MIW 通过手术植入乳腺组织与皮肤之间。使用缝线将窗口环固定，并防止小鼠抓扯缝线（图2）。用于固定 R.MIW 的缝线采用不可吸收的丝线，该材料具有低致敏性、质地柔软且易于操作。R.MIW 环由钛制成，钛是生物相容性最佳的材料之一，植入后不会引发炎症或坏死21。只要遵循无菌操作条件并正确完成缝合，R.MIW 乳腺植入术的术后并发症风险较低。此外，与腹腔成像窗口植入术22不同，R.MIW 植入不会影响小鼠的生存，因为乳腺并非重要生命器官，允许按照伦理协议规定的上限进行每日成像。限制窗口植入持续时间的唯一因素是皮肤的稳态更新，通常在 4–6 周后会导致缝线自然脱落。因此，定期检查缝线的稳定性至关重要。如有需要，可在无菌条件下拆除原有缝线，并更换为新的荷包缝线（如步骤 3.5–3.8 所述），以确保窗口的稳定性。
使用多日成像方法时面临的主要挑战是在连续数天内重新定位同一感兴趣区域（ROI）。为此，可在选择ROI之前先进行一次快速的概览扫描图3B）。可利用多种组织标志物来追溯同一组织区域，包括胶原网络信号（通过二次谐波成像观察）、组织结构，以及经染料或荧光蛋白差异性或随机标记的细胞局部分布模式。图3B）。在此代表性示例中，将一个R.MIW植入到一只小鼠的第4对乳腺中 MMTV-PyMT;R26-CreERT2异质的;R26-Confetti异质的 在可触及的肿瘤形成初期，对雌性小鼠注射1.5 mg他莫昔芬以诱导随机重组，导致部分细胞中Confetti构建体发生重组。图3C）。将重组的肿瘤细胞追踪培养20天（图3B，C）。如果无法在连续几天内对同一区域的乳腺组织进行成像，可在无菌环境下打开窗口（如步骤5.1所述），进一步清理并重新定位组织，以提高可视性和图像采集质量。图3A).
利用该方法，在单细胞水平上追踪了青春期小鼠乳腺的发育过程。使用 R26-CreERT2het;R26-mTmGhet 雌性小鼠（4–6 周龄），通过 R.MIW 进行多次活体成像（IVM），这些小鼠的所有细胞均表达膜定位的 tdTomato 荧光蛋白（图 4A）23。给予小鼠低剂量他莫昔芬（0.2 mg/25 g 体重），诱导 mTmG 构建体发生随机重组，导致包括乳腺在内的多种组织中部分细胞由红色荧光转变为绿色荧光（图 4B）。在连续多天内重复观察相同的感兴趣区域（ROI），以细胞分辨率可视化乳腺内的形态学变化，包括导管延伸和分支过程（图 4C）。重要的是，这种随机细胞标记与多日活体成像相结合的方法，还可用于观察导管微环境的动态变化，例如延伸和分支导管周围间质中单个细胞的动态行为（图 4D），以及腹股沟淋巴结内的细胞动态（图 4E）。
<img alt="他莫昔芬诱导的重组、mT/mG 构建体、三维成像、Cre 表达、Z 平面显微镜。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63326/63326fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 4"> 
图 4：青春期分支形态发生的多日活体显微成像。 （A）在 4 至 6 周龄之间的 R26-CreERT2; R26-mTmG 小鼠注射低剂量他莫昔芬，诱导 Cre 介导的 R26-mTmG 等位基因重组，并在第 1、3 和 5 天进行成像，以追踪发育中乳腺的动态变化。（B）R26-mTmG 小鼠构建体的示意图，在未发生重组的情况下，导致膜定位的 tdTomato（mT）广泛表达；在 Cre 介导的重组后，mT 被切换为膜定位的 eGFP（mG）表达。（C）通过 R.MIW 对一只 6 周龄的 R26-CreERT2; R26-mTmG 雌性小鼠进行多日成像，获得的乳腺导管伸长与分支过程的三维重建图像。（D）分支顶端（上排图）和伸长分支（下排图）的单个 Z 平面图像。mT 以红色显示，mG 以青色显示，比例尺为 100 µm（A 和 B）。基质中的单个细胞用白色星号标出。请注意，信号强度经过手动增强以突出基质中的单个细胞，导致乳腺上皮细胞略微过曝。（E）通过 R.MIW 对 R26-CreERT2; R26-mTmG 雌性小鼠的腹股沟淋巴结进行成像的代表性图像，显示了整体拼接扫描图（左图）、单个 Z 平面的放大图像（右上图）以及三维重建图像（右下图）。二次谐波信号（I 型胶原）以绿色显示，mT 以红色显示，mG 以青色显示。比例尺分别为 500 µm（整体拼接图）和 100 µm（放大图像）。图 C 和 D 修改自 Messal 等人2。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63326/63326fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
同样，在成年乳腺中，所提出的R.MIW方法能够实现同一导管结构在多天内的可视化观察，且视野清晰无损。即使使用荧光信号较弱的报告模型24，例如Cdh1-mCFP（Ecadherin-mCFP）小鼠模型，也能在细胞分辨率水平上观察到导管的稳定性及细微的形态变化（图5）。需要注意的是，在组织重新定位后，第3天与第5天之间的可见度显著提高（图5）。
<img alt="活体成像示意图；小鼠设置；Cdh1-mCFP；随时间变化的胶原蛋白I可视化；实验结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63326/63326fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图5"> 
图5：成年小鼠乳腺的多日成像。 对一只成年雌性Cdh1-mCFP（青色，标记E-cadherin阳性管腔细胞表达）小鼠的乳腺导管结构进行连续多日的三维重建图像。利用胶原蛋白I信号（二次谐波生成，品红色）重新定位相同的感兴趣区域（ROI），并使用Cdh1-mCFP信号标记导管（管腔）细胞。请注意，在第3天后，通过打开R.MIW盖板并对组织重新定位，成像可见度得到改善。比例尺代表100 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63326/63326fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
为了在单细胞水平上评估乳腺上皮细胞在激素周期中的增殖异质性，采用了光转换型Kikume Green-Red（KikGR）报告小鼠模型25,26，该模型中KikGR蛋白呈泛表达。KikGR是一种明亮的荧光蛋白，经紫光照射后可由绿色转换为红色，其红/绿荧光比值可作为细胞增殖活性的替代指标2（图6A、B）。利用R.MIW方法，我们在成年乳腺导管树中对同一群细胞进行了数天的连续追踪，发现导管树中存在此前未预料到的增殖异质性（图6C）。高增殖与低增殖细胞在不同光转换区域中分布均等（图6C、D）。值得注意的是，在局部水平上，相邻细胞之间的红/绿比值表现出显著差异（图6C、D）。光转换后10天，对不同细胞红/绿比值（作为其增殖活性的替代指标）的定量分析显示，在同一导管微环境中，部分细胞的荧光稀释速率存在高度变异性（图6E）。综上，这些数据揭示了成年乳腺组织中显著的局部增殖异质性，同时伴随着整体上一致的细胞更新速率。
<img alt="细胞分裂与蛋白质降解示意图结合光转化显微镜；红/绿比值分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63326/63326fig06.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 6"> 
图6：利用KikGR小鼠模型对成年乳腺中增殖异质性进行纵向体内显微成像（IVM）。 （A）KikGR小鼠在第0天暴露于紫光前后进行成像，光转化后第2、6和10天重复成像。（B）示意图显示KikGR乳腺上皮细胞在光转化后随时间推移发生增殖（左图）和无增殖（右图）的假设结果。（C）通过R.MIW对同一乳腺区域连续成像10天。第0天对较小区域进行光转化，结果显示Kikume红色信号随时间具有相似的稀释速率，表明上皮内各区域的更新速率一致。（D）图C中标注区域的放大图像（单个Z平面）显示光转化后第6天和第10天细胞水平上的增殖异质性。比例尺代表100 µm（图C）和10 µm（图D）。（E）对三个光转化区域内随机选取的细胞（n = 48个细胞）的红/绿比值进行定量分析。高红/绿比值表明稀释速率低、增殖活性低，而低红/绿比值则表明稀释速率高、增殖活跃。图C–E已根据Messal等人的研究修改2。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63326/63326fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本方案描述了一种带有可更换盖板的新型乳腺成像窗（R.MIW）。植入R.MIW后，可通过活体显微镜对健康及病变乳腺组织在不同发育阶段进行长期、多日、细胞分辨率的成像观察。

乳腺的分支结构具有高度动态性，出生后会经历多个生长和重塑阶段。活体显微成像在……

乳腺具有高度动态性，在整个生命周期中会经历多次重塑过程。本方案可用于捕捉驱动健康与病变乳腺组织重排的细胞动态变化。我们设计的乳腺成像窗口配有可更换的盖板，能够实现对乳腺组织的长期纵向活体成像，持续时间可达数周。可更换的乳腺成像窗盖确保始终处于最佳成像条件，并可在成像间隔期间进行组织操作或给药。我们的方法不仅有助于深入了解健康乳腺腺体的生物学特性，还可让我们在单细胞水平上研究乳腺肿瘤的起始与进展。首先将乳腺成像窗的盖子置于无菌表面，并在整个盖缘周围涂抹氰基丙烯酸酯粘合剂。将一个直径10毫米的圆形玻璃盖玻片小心地放置在盖子顶部。使用无菌的木棒来定位玻璃盖玻片，并施加一定压力将其压下，以确保玻璃盖玻片与盖子框架之间形成气密性密封。确保玻璃盖玻片不遮挡盖子臂部的孔洞。将瓶盖和乳腺成像窗放入密闭的培养皿中，用80%乙醇浸泡至少30分钟进行消毒。用浸有丙酮的棉签擦去玻璃盖玻片上多余的氰基丙烯酸酯胶水。为小鼠手术做准备时，使用刀片剃除第四对乳腺周围区域的毛发。以第四个乳头作为解剖标志，使用胶带去除松散的毛发。进行足底回缩试验，以确认动物是否已充分麻醉。用精细的格拉费镊子轻轻提起皮肤，使用小型弹簧剪在第四乳腺脂肪垫上方的皮肤上做一个10至15毫米的斜切口。以第四个乳头作为定位参考点，注意避免切割或损伤腹膜或乳腺组织。使用钝性分离法沿切口线周围分离皮肤与乳腺脂肪垫及其下方的组织层，分离范围可达5至8毫米，以创建一个可容纳乳腺成像窗框架的囊腔。根据乳腺组织的宏观特征（包括淋巴结或肿瘤病灶的位置）确定感兴趣区域（ROI）。尽量使ROI相对于切口保持居中。使用无菌镊子夹取乳腺成像窗，测试切口是否足够大以插入该成像窗。如有需要，可略微扩大切口，直至乳腺成像窗能够放入。取出成像窗后，使用5-0丝线缝合线，在距离切口边缘1至2毫米处，从切口尾端开始，由皮肤外侧向内侧进行荷包缝合。沿切口向上移动约五毫米，将缝合线从切口内侧穿出至皮肤外侧。沿切口边缘重复此操作，形成由五到六个环组成的环形缝合。缝合线的最终穿出点应位于距离第一个进针点约二至五毫米处。将乳腺成像窗口置入切口内，使用格拉费镊子小心地将皮肤放入窗口的凹槽中。确保将缝线的线环留在外面。拉紧荷包缝合线的线环，并轻轻拉动缝线的两端，使缝线在乳腺成像窗口的凹槽内收紧。用外科结扎法打结并剪除多余的缝线。使用牙签将凡士林涂抹在窗口内缘，避免接触下方组织。用无菌镊子轻轻将窗口框架向下推，并将盖片置入窗口框架中。这可以避免乳腺组织与乳腺成像窗盖之间存在空气。将细镊子的尖端穿过盖子臂上的孔，顺时针旋转以拧紧盖子。如果拧紧盖子后仍有少量空气残留，可将无菌胰岛素针头穿过皮肤插入乳腺组织与盖子之间的空腔，缓慢拉动针筒活塞，从而在乳腺组织与乳腺成像窗盖之间形成真空。经过此操作后，即可清晰观察到淋巴结。检查乳腺成像窗口框架及盖片的状况，包括缝合线的稳定性以及盖片是否存在潜在损伤。将小鼠放置于嵌入板上，使乳腺成像窗口对准成像盒嵌入板上的孔洞。在小鼠背部贴上半透明纸胶带，以固定小鼠并减少因呼吸导致的组织运动。对于超过三小时的成像实验，将一根柔性针头皮下插入小鼠颈部，并用纸胶带固定。将装有营养混合液的10毫米注射器连接至柔性硅胶管，并推动注射器，使营养混合液到达管路末端。将硅胶管连接至柔性针头，每隔30分钟注入50 µL灌注溶液。盖上成像盒的盖子以封闭。然后，将成像盒固定在显微镜的载物台上。确认小鼠在成像盒内保持稳定。使用显微镜的落射荧光模式定义感兴趣区域，并应用显微镜设置。在成像软件的导航模式下使用螺旋扫描功能，生成大范围的概览拼接图像，创建组织的参考图谱。在螺旋概览图像中定义感兴趣区域，然后设定上下Z平面以确定Z轴层厚。按下“开始”按钮，获取组织的详细三维或四维Z轴堆栈图像。将细镊子的尖端穿过盖子臂部的乳腺成像窗口孔洞，逆时针旋转以松开盖子。或者，可使用无菌钝头镊子操作或重新定位组织，以优化特定感兴趣区域的成像条件。将凡士林涂抹在乳腺成像窗的内侧边缘，注意避免接触下方组织。用无菌镊子轻轻将窗口框架向下推，并将盖子放入窗口框架中。最后，将细镊子的尖端穿过盖子臂部的孔，并顺时针旋转以松动并打开盖子。对处于青春期的 Rosa26 Cre/ERT2 Rosa26-膜定位番茄-膜定位 GFP 小鼠注射低剂量他莫昔芬，诱导 Cre 介导的 Rosa26-膜定位番茄-膜定位 GFP 等位基因重组。分别在第1、3、5天对小鼠进行成像，以追踪发育中乳腺的动态变化。代表性图像显示了通过乳腺成像窗口在多天内拍摄的细长且分支状乳腺导管的三维重建结果。此处展示了分支尖端和延伸分支的单个Z平面图像。基质中的单个细胞以白色星号标出。代表性图像显示了通过乳腺成像窗口观察到的小鼠腹股沟淋巴结。二次谐波信号以绿色显示。此处展示了成年雌性E-cadherin膜定位CFP小鼠乳腺导管结构连续多日的三维重建图像。使用I型胶原蛋白的图案来重新定位相同的ROI，使用E-钙黏蛋白膜CFP信号标记导管细胞。Kikume绿色-红色小鼠在转化前第0天以及暴露于紫光后进行成像。在转化后的第2、6和10天重复进行成像。通过乳腺成像窗口对乳腺同一区域连续成像10天。在第0天对较小区域进行光转化，结果显示Kikume红色信号随时间呈现相似的稀释速率，表明上皮细胞各区域的更新速率一致。光转化后第6天和第10天，对指定区域的放大图像显示出细胞水平上的增殖异质性。光转化后10天，对不同细胞的红色与绿色荧光比值进行定量分析，结果显示在同一导管微环境中，部分细胞的稀释速率存在高度差异。该实验流程中的关键步骤是在成像过程中间打开窗口盖板。这一独特的窗口设计改善了成像条件，实现了对组织的长期纵向成像。具有可更换盖子的乳腺成像窗将有助于在小鼠乳腺肿瘤发生和进展领域，开展关于体内快速作用药物测试与筛选的新颖研究。

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Research

科研

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Biology

生物学

使用带有可更换盖子的乳腺成像窗口进行纵向活体腔内显微镜检查

通过乳腺成像窗口对Dendra2标记的肿瘤细胞进行活体光转换和追踪，是一种能够在数天时间尺度上对特定肿瘤微环境中的肿瘤细胞转移行为进行成像的技术。...

通过乳腺成像窗口实现Dendra2光转换

本方案描述了使用真空稳定成像窗口，通过多光子显微镜对完整肺组织进行长期、高分辨率、单细胞水平的实时成像技术。...

利用真空稳定成像窗实现肺部长期高分辨率活体显微成像

本方案描述了表达细胞特异性荧光标记的转基因小鼠的活体成像。活体成像提供了一种非侵入性方法，可通过植入式窗口对活体动物进行高分辨率观察，从而实现对生物学过程的显微可视化。该方法特别适用于研究纵向动态过程。...

利用转基因荧光小鼠和改良型背部皮肤折叠窗腔进行肿瘤相关血管的活体显微成像

我们介绍了一种利用倒置旋转盘共聚焦显微镜对小鼠小肠进行活体成像，以观察表达GFP标记的γδ上皮内淋巴细胞（γδ...

小鼠小肠上皮内淋巴细胞的活体成像

利用胰腺活体成像窗实现了对胰腺的体内高分辨率成像。...

在小鼠模型中通过胰腺活体成像窗口实现胰腺的稳定纵向体内细胞水平可视化

本文介绍了一种利用光学透明硅胶窗进行长期活体成像的方法，该窗口可直接粘接于目标组织/器官及皮肤上。 与其他目前常用的方法相比，这些窗口成本更低且更具灵活性，且手术植入过程对动物造成的炎症反应和不适程度较轻。...

通过透明硅胶窗进行纵向活体成像

本文所述的活体成像方法利用胶原蛋白的二次谐波生成以及代谢辅因子NAD(P)H的内源性荧光，对未标记的肿瘤微环境进行无创分割，将其划分为肿瘤、间质和血管等区域，从而实现对4D活体成像数据的深入分析。...

一种用于活体成像乳腺肿瘤微环境的无标记分割方法

本实验方案描述了一种利用激光扫描共聚焦显微镜和多光子显微镜对哺乳期小鼠乳腺进行活体成像的简便技术。...

活体乳腺组织亚细胞显微成像

该方案介绍了一种利用倒置共聚焦显微镜简化活体成像的新工具。...

简化的小动物活体成像方法用于倒置共聚焦显微镜下长期监测上皮组织动态变化

表达荧光素酶的乳腺肿瘤细胞被皮下植入小鼠体内，并通过光学成像进行可视化，以在纵向研究中无创地监测肿瘤的生长和发育。...

体内 乳腺肿瘤的生物发光成像：使用 IVIS Spectrum

了解使用可更换盖乳腺成像窗口进行纵向活体腔内显微镜检查的方法。该技术可在数周内对小鼠乳腺组织进行长期成像，研究健康发育和肿瘤进展中的细胞动态变化。

使用可更换盖板的乳腺成像窗进行纵向活体显微成像

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