快速将重建的细胞骨架封装到巨大单层囊泡内

近年来，将物质包裹在细胞尺寸的脂双层囊泡中已被证明是体外重建实验的一种有效方法。我们所介绍的这一方法将极大地促进合成细胞研究中的细胞骨架重建。利用该方法，我们能够以高产率制备出尺寸异质的巨型单层脂质体。

与传统的cDICE技术相比，囊泡生成时间显著缩短。我们可以将从复杂的、同时发生的细胞过程中分离出的无细胞转录-翻译系统进行封装，以研究分子通路。该方法可用于组装最小化的原始细胞，进而构建具有功能的合成细胞。

通过将二油酰基-磷脂酰胆碱、胆固醇和罗丹明PE转移至一个15毫升玻璃小瓶中，开始制备油-脂混合物。然后，在小瓶中加入0.5毫升氯仿。另取一个15毫升离心管，用移液器加入7.2毫升硅油和1.8毫升矿物油，并以每分钟3,200转的速度涡旋混合10秒。

然后，将油混合物加入含有脂质和氯仿混合物的小瓶中，以每分钟 3,200 转的速度涡旋振荡 10 至 15 秒，直至形成的脂质-油混合物略显浑浊，因为脂质在油中未完全溶解。接下来，在室温下使用超声功率为 80 瓦、工作频率为 40 千赫兹的浴式超声仪对脂质-油分散液超声处理 30 分钟。若不立即使用，可将脂质-油混合物在 4 摄氏度下保存 24 小时。

为制备囊泡，使用安装在台式搅拌器上的黑色树脂3D打印轴，以每分钟1,200转的速度进行组装。然后，将由透明树脂制成的3D打印连续液滴界面交叉封装（cDICE）腔室安装在黑色树脂轴上。在球状肌动蛋白缓冲液（G缓冲液）中配制1至10微摩尔的肌动蛋白溶液，并加入10% ATO 488标记的肌动蛋白。

开始肌动蛋白聚合时，将纤维状肌动蛋白聚合缓冲液（即F缓冲液）加入冰上的肌动蛋白溶液中，然后将溶液保持在冰上，以减缓肌动蛋白聚合速度，直至加入交联剂。为制备肌动蛋白结合蛋白（ABPs），从1.75毫克/毫升的fascin储备液中取出1.57微升fascin，分装至另一微量离心管中。接下来，在肌动蛋白溶液中加入7.5%的密度梯度介质，以在外部和内部水相之间形成密度梯度，促进巨大单层囊泡（GUVs）的沉降。

然后，向 chamber 中加入 700 微升 200 毫摩尔的葡萄糖溶液作为外相溶液。向 chamber 中加入足够的脂质-油混合物，直至 chamber 体积的 60% 至 80% 被填充。脂质-油混合物与外相溶液之间将形成一个界面。

通过将ABP转移至肌动蛋白溶液中，制备肌动蛋白-ABP混合液。然后，使用常规的100至1,000微升移液器，将700微升脂质-油混合液转移至肌动蛋白-ABP混合液中。上下吹打八次，以生成直径为7至100微米的细胞大小的脂质单层乳化液滴。

使用相同的100至1,000微升移液器将全部乳液注入旋转腔室中。液滴在穿过油-外相溶液界面的脂质单层时，会获得第二层脂质，从而形成GUVs。操作完成后，将腔室从搅拌台上取下，并通过将腔室倾斜放入废液容器中，弃去大部分脂质-油混合物。

将腔室的盖子朝内握住，打开腔室盖，并将腔室略微向内倾斜。含有GUVs的外部溶液与脂质-油混合物之间的界面将从腔室盖所在位置的开口处可见。使用移液器吸取足量含有GUVs的外部溶液，并将50至300微升的外部溶液加入96孔板中，以获得适当的GUVs密度。

为了成像GUVs，将96孔板放置在配备油浸60倍物镜的倒置显微镜载物台上。在图像处理软件ImageJ Fiji中打开感兴趣的图像序列，并确定信号强度最高的图像。按住Control Shift C以打开亮度和对比度窗口，然后点击重置选项卡。

在 ImageJ Fiji 菜单中，进入“分析”和“设置比例尺”选项，输入每个图像像素对应的实际物理距离和单位。完成后，依次点击“图像”、“堆栈”和“3D 投影”按钮，以从 Z 堆栈重建三维图像。将投影方法设置为“亮度投影点”，切片间距设为 0.5 µm，并勾选“插值”选项。

其余设置采用默认选项并采集图像。代表性图像显示了封装有fascin-肌动蛋白束的罗丹明PE标记GUVs的共聚焦图像。将肌动蛋白结合蛋白转移至肌动蛋白溶液后，应立即加入脂质-油混合物并生成脂质单层液滴，整个过程应在数秒内完成，以避免在封装前形成肌动蛋白网络。

我们已采用这种改进的cDICE技术来研究不同肌动蛋白网络交联蛋白在组织肌动蛋白网络中的作用。我们预期该方法将有助于其他研究人员探索其他细胞骨架蛋白的调控机制。