Name: 从猪肾和小鼠肝脏中提取和纯化FAHD1蛋白 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-18T13:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 7 s
Description: 学习从猪肾和小鼠肝脏中提取和纯化FAHD1蛋白的方法，保持其生理构象与催化活性。该技术可推广至其他蛋白质研究，为抗体开发及药理学抑制剂研究提供高质量组织来源蛋白。

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作者非常感谢艾丝·厄兹图尔克（Ayse Öztürk）和伊娃·阿尔贝蒂尼（Eva Albertini）提供的技术协助。用于生成肝组织的小鼠由奥地利因斯布鲁克大学生物医学衰老研究所（地址：奥地利因斯布鲁克市伦韦格10号，邮编6020）的皮德·詹森-杜尔大学副教授兼博士（Univ.-Doz. Dr. Pidder Jansen-Dürr）负责监管饲养。

<ol><li>Pircher, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+FAH+domain-containing+protein+1+%28FAHD1%29+as+oxaloacetate+decarboxylase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification of FAH domain-containing protein 1 (FAHD1) as oxaloacetate decarboxylase.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (11), 6755-6762 (2015).</li>
<li>Pircher, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+human+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+Domain-containing+Protein+1+%28FAHD1%29+as+a+novel+mitochondrial+acylpyruvase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification of human Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-containing Protein 1 (FAHD1) as a novel mitochondrial acylpyruvase.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (42), 36500-36508 (2011).</li>
<li>Kang, T. -W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence+surveillance+of+pre-malignant+hepatocytes+limits+liver+cancer+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Senescence surveillance of pre-malignant hepatocytes limits liver cancer development.</a> Nature. 479 (7374), 547-551 (2011).</li>
<li>Hong, H., Seo, H., Park, W., Kim, K. K. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence%2C+structure+and+function-based+classification+of+the+broadly+conserved+FAH+superfamily+reveals+two+distinct+fumarylpyruvate+hydrolase+subfamilies%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Sequence, structure and function-based classification of the broadly conserved FAH superfamily reveals two distinct fumarylpyruvate hydrolase subfamilies.</a> Environmental Microbiology. 22 (1), 270-285 (2020).</li>
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<li>Weiss, A. K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+cellular+senescence+by+eukaryotic+members+of+the+FAH+superfamily+-+A+role+in+calcium+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Ageing+and+Development%22%5BJournal%5D)">Regulation of cellular senescence by eukaryotic members of the FAH superfamily - A role in calcium homeostasis.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 190, 111284(2020).</li>
<li>Petit, M., Koziel, R., Etemad, S., Pircher, H., Jansen-Dürr, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+oxaloacetate+decarboxylase+FAHD1+inhibits+mitochondrial+electron+transport+and+induces+cellular+senescence+in+human+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Gerontology%22%5BJournal%5D)">Depletion of oxaloacetate decarboxylase FAHD1 inhibits mitochondrial electron transport and induces cellular senescence in human endothelial cells.</a> Experimental Gerontology. 92, 7-12 (2017).</li>
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<li>Mizutani, H., Kunishima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification%2C+crystallization+and+preliminary+X-ray+analysis+of+the+fumarylacetoacetase+family+member+TTHA0809+from+Thermus+thermophilus+HB8%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+F+Structural+Biology+and+Crystallization+Communications%22%5BJournal%5D)">Purification, crystallization and preliminary X-ray analysis of the fumarylacetoacetase family member TTHA0809 from Thermus thermophilus HB8.</a> Acta Crystallographica Section F Structural Biology and Crystallization Communications. 63 (9), 792-794 (2007).</li>
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<li>Sørensen, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silver+staining+of+proteins+on+electroblotting+membranes+and+intensification+of+silver+staining+of+proteins+separated+by+polyacrylamide+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Silver staining of proteins on electroblotting membranes and intensification of silver staining of proteins separated by polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Analytical Biochemistry. 304 (1), 33-41 (2002).</li>
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<li>Rosano, G. L., Morales, E. S., Ceccarelli, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+tools+for+recombinant+protein+production+in+Escherichia+coli%3A+A+5-year+update%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%3A+A+Publication+of+the+Protein+Society%22%5BJournal%5D)">New tools for recombinant protein production in Escherichia coli: A 5-year update.</a> Protein Science: A Publication of the Protein Society. 28 (8), 1412-1422 (2019).</li>
</ol>

作者无竞争性财务利益。

实验方案中的关键步骤 
必须遵循蛋白质操作的通用准则，例如在冰上操作，并保持适中的 pH 和盐浓度条件。使用蛋白酶抑制剂有助于该方法的实施，而强烈建议使用蛋白酶体抑制剂。反复冻融样品可能导致蛋白质沉淀（至少部分沉淀），因此初始蛋白裂解液（步骤 2）的任何解冻分装样品都应连续处理，不得中断。通常建议在解冻后进行离心和过滤，以去除微小沉淀物。
从组织中获得的初始蛋白裂解液仍含有大量非蛋白质成分。可使用离子交换层析柱对裂解液进行澄清。即使目标提取蛋白不与离子交换柱结合，流出液通常也比上样溶液更澄清，便于后续步骤处理。这一点在从小鼠肾脏中提取FAHD1的过程中得到了验证（见图5A）。
方法的局限性与改进 
本方案描述了一种从组织中提取FAHD1的实验方法。基于该策略，可衍生出从其他组织中提取FAHD蛋白（FAHD1、FAHD2）的通用方法，但个别情况可能需要进行特定调整。该方法的内在限制在...

真核生物中含FAH结构域的蛋白1（FAHD1）具有双重功能，可作为草酰乙酸（OAA）脱羧酶（ODx）1和酰基丙酮酸水解酶（ApH）2。该蛋白定位于线粒体2，属于广泛的FAH酶超家族1,2,3,4,5,6。尽管其ApH活性仅具次要意义，但FAHD1的ODx活性参与调控三羧酸循环（TCA循环）的通量1,7,8,9。草酰乙酸不仅在三羧酸循环中的关键柠檬酸合酶反应中必需，还可作为电子传递系统中琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂，并作为出线粒体代谢物（cataplerotic metabolite）。在人脐静脉内皮细胞（HUVEC）中下调FAHD1基因表达会导致细胞增殖速率显著降低10，线粒体膜电位显著受抑，并伴随向糖酵解途径的转换。该作用模型涉及一种类似于线粒体功能障碍相关性衰老（MiDAS）11的表型8，其中线粒体内草酰乙酸水平由FAHD1的活性严格调控1,8,9。
重组蛋白更容易获得 通过 从细菌中表达与纯化12 而不是从组织中获取。然而，在细菌中表达的蛋白质可能因缺乏翻译后修饰而产生偏差，或存在其他问题（例如质粒丢失、细菌应激反应、二硫键形成异常或无法正确形成、无分泌或分泌效率低下、蛋白质聚集、蛋白酶切割等）。对于某些应用而言，需要从细胞裂解物或组织中获取蛋白质，以保留这些翻译后修饰和/或排除可能的实验假象。从组织中纯化的蛋白质有助于开发高质量的抗体，以及针对特定酶（如FAHD1）的高效且特异性的药理学抑制剂。13.
本文介绍了一系列从猪肾和小鼠肝脏中提取和纯化FAHD1的方法。所述方法需要快速蛋白液相色谱（FPLC），但其他步骤仅使用常规实验室设备。其他替代方法可参见 elsewhere14,15,16,17在总蛋白提取后，本方案包含一个检测阶段，其中讨论了硫酸铵沉淀和离子交换层析的子方案（图1）。在定义这些子步骤后，目标蛋白被提取 通过 一种结合离子交换和尺寸排阻色谱的FPLC顺序策略。根据这些指南，最终方案可针对其他目标蛋白进行个性化调整。
<img alt="图1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63333/63333fig01.jpg" /> 
图1本方案的整体策略。 从上到下：从组织中提取蛋白质。制备组织匀浆，经离心和过滤。针对每一对上清液和沉淀物来源的样品，需进行硫酸铵沉淀和离子交换色谱（FPLC）测试，以探索最佳条件。在确定这些子步骤方案后，可进行蛋白质提取。 通过 硫酸铵沉淀、离子交换层析以及在不同pH和盐浓度条件下重复进行的凝胶过滤层析（FPLC）的依次操作步骤。所有步骤均需通过Western印迹进行监控。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63333/63333fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>0.22 &amp;micro;m 滤器单元</td><td>MERCK</td><td>SLGP033RS</td><td>Millex-HP，0.22 &amp;micro;m，PES 33 mm，非无菌</td></tr><tr><td>0.45 &amp;micro;m 滤器单元</td><td>MERCK</td><td>SLHP033NS</td><td>Millex-HP，0.45 &amp;micro;m，PES 33 mm，非无菌</td></tr><tr><td>15 mL Falcon 管</td><td>VWR</td><td>734-0451</td><td>离心管</td></tr><tr><td>50 mL Falcon 管</td><td>VWR</td><td>734-0448</td><td>离心管</td></tr><tr><td>96 孔紫外微孔板</td><td>Thermo-Fischer</td><td>8404</td><td>紫外/可见光透明平底 96 孔板</td></tr><tr><td>丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液（40%，29:1 比例）</td><td>BIO-RAD</td><td>#1610147</td><td>用于灌制聚丙烯酰胺凝胶的 40% 丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液，29:1（3.3% 交联剂）</td></tr><tr><td>&amp;Auml;KTA FPLC 系统</td><td>GE Healthcare Life Sciences / Cytiva</td><td>-</td><td>使用 GE Healthcare 的 FPLC 系统；存在多种定制版本；本研究使用的是 &quot;&amp;Auml;KTA pure&quot; 系统</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15，PLGC Ultracel-PL 膜，10 kDa</td><td>MERCK</td><td>UFC901024</td><td>用于蛋白质富集的离心过滤器；10 kDa 分子量截留值；15 mL</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-4，PLGC Ultracel-PL 膜，10 kDa</td><td>MERCK</td><td>UFC801024</td><td>用于蛋白质富集的离心过滤器；10 kDa 分子量截留值；4 mL</td></tr><tr><td>硫酸铵粉末</td><td>MERCK</td><td>A4418</td><td>分子生物学级硫酸铵，&amp;ge;99.0%</td></tr><tr><td>过硫酸铵，试剂级，98%</td><td>MERCK</td><td>215589</td><td>丙烯酰胺凝胶聚合的催化剂</td></tr><tr><td>考马斯亮蓝 R 250</td><td>MERCK</td><td>1125530025</td><td>用于电泳的考马斯亮蓝 R 250（C.I. 42660），Imperial Chemical Industries PLC 商标，CAS 6104-59-2，pH 6.2（10 g/L，H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O，25 &amp;deg;C）</td></tr><tr><td>透析管纤维素膜</td><td>MERCK</td><td>D9277</td><td>用于通过透析交换缓冲液的纤维素膜</td></tr><tr><td>Eppendorf 管 1.5 mL</td><td>VWR</td><td>525-1042</td><td>微量离心管；已高压灭菌</td></tr><tr><td>HiLoad 26/600 Superdex 75 pg</td><td>GE Healthcare Life Sciences / Cytiva</td><td>28989334</td><td>HiLoad Superdex 75 pg 预装柱适用于重组蛋白的高分辨率凝胶过滤层析</td></tr><tr><td>Immun-Blot PVDF 膜</td><td>BIO-RAD</td><td>#1620177</td><td>PVDF 膜是为荧光及多重荧光应用优化的蛋白质印迹膜</td></tr><tr><td>Mini Trans-Blot 电泳转移装置</td><td>BIO-RAD</td><td>#1703930</td><td>使用 Mini Trans-Blot 装置可快速转印 Mini-PROTEAN 预制胶和手工灌胶</td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra 垂直电泳槽（用于 Mini 预制胶）</td><td>BIO-RAD</td><td>#1658004</td><td>四块胶的垂直电泳系统，包含电极组件、配套运行模块、电泳槽、带电源线的盖子以及微型电泳槽缓冲液挡板</td></tr><tr><td>Mono Q 10/100 GL</td><td>GE Healthcare Life Sciences / Cytiva</td><td>17516701</td><td>Mono Q 柱为强阴离子交换层析柱，用于蛋白质分析或小规模高分辨率纯化</td></tr><tr><td>Mono S 10/100 GL</td><td>GE Healthcare Life Sciences / Cytiva</td><td>17516901</td><td>Mono S 柱为强阳离子交换层析柱，用于蛋白质分析或小规模高分辨率纯化</td></tr><tr><td>PageRuler 预染蛋白 Marker，10 至 180 kDa</td><td>Thermo-Fischer</td><td>26616</td><td>由 10 种蓝色、橙色和绿色染色的蛋白质（10 至 180 kDa）组成的混合物，用作蛋白质电泳（SDS-PAGE）和 Western 印迹中的分子量标准</td></tr><tr><td>Pierce BCA 蛋白检测试剂盒</td><td>Thermo-Fischer</td><td>23225</td><td>一种双组分、高精度、兼容去垢剂的蛋白定量检测方法，用于测定蛋白质浓度</td></tr><tr><td>Sonifier 250；带转换器的超声波细胞破碎仪</td><td>Branson</td><td>-</td><td>新型号见 https://www.emerson.com/documents/automation/brochure-sonifier-sfx250-sfx550-cell-disruptors-homogenizers-branson-en-us-168180.pdf</td></tr><tr><td>猪抗兔免疫球蛋白/HRP（亲和纯化）</td><td>Agilent Dako</td><td>P0399</td><td>用于辣根过氧化物酶偶联的抗体可与所有类别的兔免疫球蛋白反应</td></tr><tr><td>TEMED，1,2-双(二甲氨基)乙烷，TMEDA</td><td>MERCK</td><td>T9281</td><td>TEMED（N,N,N&amp;prime;,N&amp;prime;-四甲基乙二胺）是一种可促进聚丙烯酰胺凝胶快速聚合的分子</td></tr><tr><td>管式滚轴混合器</td><td>-</td><td>-</td><td>通用试管旋转滚轴混合器；例如新型号见 https://labstac.com/de/Mixer/Roller/c/71</td></tr><tr><td>试管旋转混合器</td><td>-</td><td>-</td><td>通用试管旋转轮混合器；例如新型号见 https://labstac.com/de/Tube-Roller/p/MT123</td></tr><tr><td>ULTRA-TURRAX；T 25 digital</td><td>IKA</td><td>0003725000</td><td>新型号见 https://www.ika.com/de/Produkte-Lab-Eq/Dispergierer-Dipergiergeraet-Homogenisierer-Homogenisator-csp-177/T-25-digital-ULTRA-TURRAX-cpdt-3725000/</td></tr></tbody></table>

从猪肾和小鼠肝脏中提取与纯化fahd1蛋白

Extraction and Purification of FAHD1 Protein from Swine Kidney and Mouse Liver

富马酰乙酰乙酸水解酶结构域包含蛋白1（FAHD1）是真核生物中FAH超家族首个被鉴定的成员，在线粒体中发挥草酰乙酸脱羧酶的功能。本文介绍了一系列从猪肾和小鼠肝脏中提取与纯化FAHD1的方法，包括快速蛋白液相色谱（FPLC）离子交换层析、FPLC制备型与分析型凝胶过滤层析，以及蛋白质组学方法。在完成总蛋白提取后，依次采用硫酸铵沉淀和离子交换层析对FAHD1进行分离提取 通过 一种利用离子交换和尺寸排阻色谱的连续策略。该代表性方法可适用于其他表达水平较高的目标蛋白，并可针对其他组织进行优化。从组织中纯化获得的蛋白可用于开发高质量的抗体，以及高效且特异的药理学抑制剂。

FAHD1 蛋白采用本方案从猪肾和小鼠肝脏中提取。对于小鼠组织，需要多个器官以获得数毫克的蛋白 &#181;g 在最终纯化步骤之后。因此，本文重点介绍从猪肾脏中提取FAHD1的方法，这是一个更具代表性的实验。从小鼠肝脏中提取FAHD1的操作旨在展示本方案可能遇到的困难与潜在问题。通常建议使用目标蛋白表达水平较高的组织器官进行纯化。人类蛋白质图谱22 可能有助于在模型系统中估算表达水平，或者可以使用不同的粗组织裂解液进行初步的蛋白质印迹实验以评估这些表达水平。所有蛋白质印迹分析中使用的阳性对照均为一种带标签的重组蛋白，其分子量略高。
作为首次实验，展示了从猪肾脏中提取FAHD1的过程。组织匀浆（步骤1）和总蛋白提取（步骤2）的过程见补充图1（各步骤的说明见图注）。后续实验使用了总裂解液的十分之一 aliquot。
对该裂解液进行了一次硫酸铵沉淀实验，通过将硫酸铵以不同浓度加入裂解液中（步骤4）（图2</st...

本方案描述了如何从猪肾和小鼠肝脏中提取含延胡索酰乙酰乙酸水解酶结构域蛋白1（FAHD1）。所列出的方法可针对其他感兴趣的蛋白质进行调整，并可根据其他组织类型进行修改。

从猪肾和小鼠肝脏中提取与纯化FAHD1蛋白

富马酰乙酰乙酸水解酶结构域含蛋白1（FAHD1）是真核生物中富马酰乙酰乙酸水解酶（FAH）超家族首个被鉴定的成员，其功能为……

从细菌中纯化重组蛋白是一种成熟的方法。然而，使用这些技术时可能会遇到一些问题。因此，开发从组织中提取蛋白的方法无疑具有重要意义。该方法的主要优势在于能够以蛋白质的生理形态进行提取，包括所有可能影响其折叠和催化活性的相互作用。该方法可针对其他目标蛋白进行调整，并适用于其他组织。从组织中提取的纯化蛋白有助于高质量抗体和药理学抑制剂的开发。首先，通过将250毫升PBS与50毫摩尔氟化钠、1毫摩尔苯甲基磺酰氟、每毫升2微克抑蛋白酶肽以及1毫摩尔活化正钒酸盐混合，制备蛋白裂解缓冲液。使用0.22微米针筒滤器对溶液进行过滤。按每克组织2毫升裂解缓冲液的量准备离心管，并置于冰上。准备组织样本时，将约100毫克的组织置于放置于聚苯乙烯泡沫盒中冰上的预清洁玻璃板上进行解剖。将组织块转移至已准备好的试管中，用于后续裂解。为制备饱和硫酸铵溶液，将500毫升双蒸水加热至70摄氏度。搅拌的同时，逐渐加入硫酸铵粉末，直至不再有硫酸铵溶解为止。将此饱和溶液冷却至室温，并在4°C下过夜保存。为均质化猪肾组织，建议在冰上操作的同时，使用超声波探头对悬浮液进行超声处理。对于小鼠肝脏组织，使用电动匀浆器，并在冰上操作的同时定期用 PBS 清洗，以防止堵塞。从样品中取出 20 微升，在显微镜下检查匀浆组织的细胞是否已充分破碎。若未达到要求，则需重复匀浆步骤。在4°C条件下，以10,000 × g离心试管30分钟。收集上清液至新离心管中，并置于冰上。随后使用0.45微米和0.22微米的注射器滤器对上清液进行过滤。将上清液分装为10毫升每份，短期储存置于-20 °C，长期储存置于-80 °C。取40 µL上清液，加入10 µL 5倍浓度的SDS上样缓冲液，混匀后于95 °C煮沸10分钟，制备50 µL样品用于SDS-PAGE或Western blot分析。根据制造商说明书配制不连续的12.5%聚丙烯酰胺SDS-PAGE凝胶。进行SDS-PAGE分析时，依次在凝胶的加样孔中加入蛋白分子量标记物、5纳克人源FAHD1重组蛋白作为阳性对照、20微升待分析样品，其余加样孔中加入20微升已配制的SDS-PAGE上样缓冲液。使用SDS电泳缓冲液，在125伏电压下电泳运行SDS-PAGE凝胶。SDS-PAGE完成后，进行蛋白质印迹分析，利用抗FAHD1抗体孵育膜进行杂交检测。按照前述方法制备上清液分装样品后，可在解冻后直接进行处理，或在蛋白质提取后不冻存样品而直接进行处理。使用0.22微米滤器过滤样品，以去除解冻后可能产生的沉淀物。在冰上准备六个1.5毫升离心管，然后将250微升样品分别转移至各管中。在已准备好的离心管中配制硫酸铵的梯度稀释液，并用蛋白裂解缓冲液定容至终体积1,000 µL。将样品置于4 °C条件下，在管式旋转仪上孵育过夜。使用台式离心机，在4 °C、10,000 ×g条件下离心30分钟，然后小心地将所有上清液分别转移至新的离心管中。将所得沉淀在空气中干燥，并用1,000 µL双蒸水重悬每个沉淀。对于上一步中每一对重悬沉淀和上清液，取40 µL与10 µL五倍浓度的SDS上样缓冲液混合，在95 °C下开盖煮沸，直至大部分液体蒸发。然后将沉淀重悬于含50%二甲基亚砜的双蒸水中。将重悬沉淀物和上清液来源的样品成对上样，进行SDS-PAGE，随后进行蛋白质印迹分析。然而，以80伏电压运行凝胶3小时。使用阴离子或阳离子交换柱装配FPLC系统。用五倍柱体积的双蒸水中20%乙醇洗涤层析柱，随后用五倍柱体积的双蒸水洗涤。通过进样或使用样品泵将样品上样至柱子，并收集穿流液。用一倍柱体积的低盐缓冲液洗涤层析柱。在三个柱体积内，建立从100%低盐缓冲液到100%高盐缓冲液的线性梯度洗脱。持续收集每管1毫升的组分。梯度洗脱结束后，继续用高盐缓冲液运行，直至在相当于一个柱体积的范围内，色谱图中不再检测到与蛋白质相关的洗脱峰。将1毫升溶于0.5摩尔氢氧化钠和重蒸水中的25% SDS加入柱中以清洗层析柱。随后依次用三倍柱体积的重蒸水和三倍柱体积的20%乙醇（溶于重蒸水）洗涤层析柱。收集所有洗脱峰组分及流穿液的SDS-PAGE样品。将收集的组分在液氮中快速冷冻，并在负80摄氏度下保存。通过蛋白质印迹检测后，解冻并合并含有目标蛋白的组分，弃去其余组分。进行纯化步骤时，使用超滤离心管将蛋白质溶液体积浓缩至2毫升。依次使用 0.45 微米和 0.22 微米的注射器滤器过滤溶液，以去除任何微小沉淀物。用含 1 毫摩尔二硫苏糖醇的运行缓冲液平衡尺寸排阻色谱柱，缓冲液体积为一个柱体积。将样品加载到色谱柱上，并运行色谱系统，直至所有蛋白质均按先前所述方法洗脱出来。制备50微升样品用于之前所述的SDS-PAGE和Western印迹分析。依次用一个柱体积的双蒸水和一个柱体积的含20%乙醇的双蒸水洗涤层析柱。完成Western印迹分析后，合并所有含有FAHD1的组分。使用超滤离心过滤装置将蛋白质溶液的体积浓缩至两毫升。Western印迹筛选显示上清液中存在猪FAHD1，条带位于25千道尔顿，而带标签的阳性对照条带位于34千道尔顿。通过阴离子交换层析纯化来自裂解液的猪FAHD1，并通过洗脱去除结合蛋白。通过蛋白质印迹分析鉴定含有猪FAHD1的组分，合并并浓缩。蛋白样品经尺寸排阻层析纯化，并通过蛋白质印迹分析鉴定。猪FAHD1蛋白的产量约为1毫克，纯度达80%。Western blot 分析在流穿液中检测到小鼠 FAHD1 蛋白以及其他蛋白。将流穿液进行凝胶过滤层析。收集含有 FAHD1 的组分，合并、浓缩后进行 SDS-PAGE 分析。然而，蛋白质的得率并不高。猪源FAHD1的特异性酶活性随着纯度的提高而增加，即每单位总蛋白中FAHD1的相对含量增加。较高浓度的硫酸铵会引起微笑效应，该效应在较低电压下可得到解决。在15%浓度下，裂解液和上清液中检测到更多的蛋白质。然而，在更高浓度下，样品可能会发生沉淀而无法检测。本方案要求蛋白质具有可溶性。沉淀以及色谱所需的pH或尺寸调整的最佳条件需要经过测试并确定。当蛋白质从组织中提取而非从细菌中提取时，对酶功能的研究、蛋白质结构的探究以及抗体的开发将得到极大支持。

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科研

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生物化学

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从猪肾和小鼠肝脏中提取与纯化FAHD1蛋白

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