从小鼠骨骼肌中分离线粒体用于呼吸测定
February 10th, 2022
在这里，我们描述了从小鼠骨骼肌中分离线粒体的详细方法，以及随后使用基于微孔板的呼吸测定通过耗氧率（OCR）分析呼吸。该管道可用于研究多种环境或遗传干预措施对线粒体代谢的影响。
这个词描述了处理小鼠骨骼肌线粒体中的呼吸分析。该协议大大减少了纯化时间，并允许同时处理多个样品。来自任何八种性别的United背景动物的线粒体可以使用该协议进行残缺，从而能够在各种实验条件下研究呼吸。
该方法适用于与线粒体功能相关的所有研究领域，包括衰老，药物测试，癌症或发育。它甚至可以适应其他组织和生物体。在手术过程中，将所有材料都放在冰上，以确保所有材料都是冷的，以保护线粒体免受损伤。
将每个样品三个50毫升烧杯放在冰上，在烧杯一中加入10毫升PBS，在烧杯二中加入10毫升10毫升10毫摩尔EDTA PBS，在烧杯三中加入四毫升IB1。用70%乙醇喷洒安乐死小鼠的右后肢以防止皮毛脱落，并将肢体贴在软木塞解剖板上，然后用胶带粘住左前肢。用无菌的一次性手术刀从膝盖到脚趾穿过皮肤做一个切口。
用齿镊子在脚踝水平夹住皮肤，并在脚踝周围用细剪刀剪开。用细尖镊子一手将皮肤从下面的肌肉组织中移开，另一只手用齿镊子将其拉上来。从脚踝到膝盖解剖所有骨骼肌，并使用细镊子和剪刀去除胫骨前肌上的所有结缔组织。
找到长指伸肌的四个远端肌腱，并将它们切开靠近它们在脚趾中的插入物。定位胫骨前远端肌腱，并将其切近踝关节下方的插入物。将胫骨前部和指长伸肌腱拉到踝关节上方，以释放松动的末端。
抓住肌腱松弛的末端，并通过向上拉动肌肉来缓解肌肉远离骨骼中肌肉组织的其余部分。切开这些肌肉的近端肌腱，尽可能靠近膝盖骨。将鼠标倒置以继续进行腓肠肌和比目鱼肌提取。
抓住肱二头肌、股骨和腓肠肌之间形成的口袋，并用细剪刀将这些肌肉分开，以观察腓肠肌近端肌腱。用细剪刀抓住并小心地切开远端跟腱。切除腓肠近端肌腱，用下面的比目鱼释放它。
仔细解剖剩余的肌肉，并将鼠标重新固定在初始位置以解剖股四头肌。丢弃脂肪组织，然后在股四头肌和股骨之间插入细镊子，将肌肉与骨骼分开。抓住股四头肌远端肌腱，并尽可能靠近膝盖骨切割肌腱。
将股四头肌向上拉，并在近端插入处用细剪刀将其释放。对左后肢重复相同的步骤。冲洗第一个烧杯中的所有肌肉，然后是两个，然后是烧杯三个。
最后，用锋利的剪刀在冰上切碎烧杯三号中的所有肌肉。将悬浮液转移到C管上，紧紧关闭，然后将其倒置到均质机的套筒上。将匀浆分成两个2毫升预冷的微量离心管，离心10分钟。
然后将上清液转移到新的预冷管中，再离心10分钟。将沉淀在500微升IB2中混合 将上清液转移到新的2毫升预冷微量离心管中，并将其标记为二号上清液或SN2。将最终的线粒体沉淀悬浮在200微升的再悬浮缓冲液中。
快速留出10微升用于蛋白质定量，并立即向剩余的线粒体悬浮液中加入10微升10%FFA BSA以防止损伤。将浓缩的线粒体悬浮液以10，500倍G在4摄氏度下离心10分钟。将线粒体沉淀悬浮在100微升具有BSA的1X偶联测定培养基，具有BSA的1X电子流测定培养基或具有BSA的1Xβ氧化培养基中，具体取决于要执行的方案。
使用相应的测定介质将这种浓缩的线粒体样品稀释至每微升0.2微克。将每孔50微升的悬浮液接种在冰上的预冷24孔微孔板中。在背景校正孔中，仅添加相应的测定培养基。
将剩余的线粒体悬浮液储存在零下80摄氏度，以测定碎片纯度。在预冷的制备离心机中旋转微孔板20分钟。同时，将剩余的测定介质加热至37摄氏度。
离心后，将微孔板放在工作台上五分钟以平衡。缓慢而小心地每孔加入450微升温热测定培养基，以避免线粒体脱落。将微孔板立即放入没有盖子的耗氧量测量仪器中，然后开始测量程序。
确保第一步是孵育10分钟，以使微孔板升温。实验完成后，取出墨盒和微孔板，关闭仪器，然后开始分析。通过连续离心获得的不同组分的一般蛋白质谱在分离的组分中显示出不同的蛋白质群体。
所有线粒体含量的存在都可以通过外线粒体膜和核样蛋白的标记物的强烈信号来证明。N级数代表原子核和未破裂的物质。SN1 或 SN2 级分中的大多数内质网、质膜或细胞质标志物突出了分离过程中获得的高纯度。
在偶联和β氧化测定中观察到ADP添加后氧消耗量增加。羰基氰化物-对三氟甲氧基苯腙加成后，耗氧量达到最高水平。低呼吸控制比确保了分离线粒体的完整性。
电子流动测定通过注射特定的底物和抑制剂单独或组合检查电子传递链复合物的活性。分离线粒体非常敏感。因此，组织缓解后的所有步骤都需要勤奋和仔细地进行，以保持其生存能力。
实验测定可以通过关键线粒体分子的确定性序列分析或使用蓝色天然聚丙烯酰胺凝胶电泳研究螺旋复合物的组装来补充。
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概述
本研究提出了一种从小鼠骨骼肌中分离线粒体的精细协议，随后通过氧气消耗率（OCR）评估分析呼吸作用。该方法允许同时处理多个样本，适用于在各种实验条件下研究线粒体代谢。
关键研究组成部分
研究领域
- 线粒体代谢
- 呼吸分析
- 环境和遗传干预
背景
- 线粒体在细胞能量调节中的重要性
- 线粒体功能在衰老、药物测试、癌症和发育中的相关性
- 线粒体研究中高效协议的需求
使用的方法
- 基于微板的呼吸测定分析
- 小鼠骨骼肌作为生物系统
- 最小化纯化时间的分离协议
主要结果
- 成功分离出高纯度的线粒体分数
- 在加入ADP后观察到氧气消耗增加
- 分离的线粒体分数中具有不同的蛋白质谱，验证了该方法
结论
- 本研究建立了一种用于线粒体分离和呼吸分析的高效协议。
- 对于专注于线粒体功能和代谢的研究领域具有重要意义。
常见问题
Executive Industry Relevance
This protocol enables direct assessment of mitochondrial bioenergetics in physiologically relevant skeletal muscle tissue, addressing a key limitation of cultured cell models that may not reflect in vivo conditions. By providing a scalable method for isolating high-purity mitochondria from mouse tissue, it supports mechanistic de-risking in target validation and preclinical studies of metabolic disease, aging, and drug response. The approach enhances predictive confidence by linking mitochondrial function to tissue-specific physiology, informing go/no-go decisions in early discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional interrogation of mitochondrial targets in native tissue context, clarifying pathway activity and target engagement.
- Operational Value: Supports hypothesis testing with quantitative oxygen consumption readouts that reflect tissue-specific mitochondrial physiology.
- Predictive Value: Increases confidence in target modulation studies by reducing artifacts associated with cell culture adaptation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates reproducible, quantitative OCR measurements suitable for assay standardization across experimental conditions.
- Operational Value: Allows parallel processing of multiple samples, increasing throughput for compound screening and genotype comparisons.
- Assay Readiness: Produces isolated mitochondria compatible with coupling, electron flow, and beta-oxidation assay media for flexible experimental design.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates study of mitochondrial response to aging, sex, genetic modifications, and pharmacological interventions in a disease-relevant system.
- Operational Value: Enables longitudinal analysis of mitochondrial function across experimental variables using a consistent isolation workflow.
- Translational Continuity: Bridges discovery findings to preclinical validation by maintaining tissue-specific mitochondrial integrity.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead optimization, providing functional mitochondrial data that informs compound progression decisions.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking by validating mitochondrial targets in physiologically relevant skeletal muscle.
- Screening: Enables assay development with standardized, high-purity mitochondrial preparations suitable for multi-well respirometric formats.
- Analytics: Delivers quantitative OCR measurements and respiratory control ratios that allow objective comparison of mitochondrial states across conditions.
- Translational Research: Connects early target modulation studies to preclinical outcomes through preserved mitochondrial function in native tissue.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable isolation platform applicable across therapeutic areas including metabolism, neurodegeneration, and oncology.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides target-confident data by reducing mechanistic ambiguity in mitochondrial function studies.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability through standardized tissue processing and simultaneous multi-sample handling.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early-stage go/no-go decisions based on tissue-specific mitochondrial responses.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of compounds targeting mitochondrial pathways in metabolic disease and aging.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue dissection, mitochondrial isolation, and respirometric assay handling.
- Dependent on access to homogenization equipment, centrifuges, and oxygen consumption measurement instrumentation.
- Necessitates cold-chain maintenance throughout isolation to preserve mitochondrial integrity and function.
- Requires standardization of muscle dissection and mincing protocols across operators and laboratories.
- Limited by the need for fresh tissue input, which constrains sample storage and batch processing flexibility.
