使用2′,7′-二氯荧光素二乙酸酯探针和流式细胞术定量穆勒胶质细胞中的活性氧物种
2022年5月13日
本文提出了一种系统化、易于操作且可重复的实验方案，用于通过2′,7′-二氯荧光素二乙酸酯探针（DCFH-DA）检测穆勒胶质细胞（MGCs）中的细胞内活性氧（ROS）。该方法利用流式细胞仪对细胞内总活性氧水平进行定量分析。本方案操作简便，适用性强，且具有良好的可重复性。
有多种方法可用于检测细胞中的活性氧（ROS）生成或氧化应激水平。其中，2'7'-二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）探针是直接测定细胞氧化还原状态最常用的技术之一。该探针具有脂溶性且本身无荧光。探针可自由穿过细胞膜，进入细胞后被胞内酯酶水解两个酯键，生成相对极性较强且无法透过细胞膜的产物。这些无荧光分子在细胞内积累，随后被活性氧氧化，生成高度荧光的二氯荧光素（DCF）。该探针的氧化反应由多种类型的活性氧共同作用所致，其荧光信号可通过流式细胞术或共聚焦显微镜进行检测。本文中，我们采用二氯荧光素二乙酸酯探针结合流式细胞术对活性氧水平进行检测与定量。将6孔板从培养箱转移至超净工作台。吸除上清液，并用PBS洗涤细胞一次。每孔加入2 mL低血清DMEM培养基，在培养箱中孵育2小时。用抗氧化剂处理细胞6小时。随后分别用活性氧诱导剂A或B处理细胞30分钟。吸除上清液，并用PBS洗涤细胞三次，以彻底去除所有刺激物。关闭超净工作台的照明灯，在避光条件下操作。每孔加入1 mL溶于无酚红DMEM的二氯荧光素二乙酸酯探针。对照组（自发荧光对照）每孔加入1 mL无酚红DMEM。将6孔板在培养箱中避光孵育30分钟。将培养板转移至冰上并送至实验室。每孔用2 mL预冷PBS洗涤细胞三次。每孔加入0.5 mL预冷的细胞解离缓冲液。使用P1000移液器轻轻吹打使细胞脱落。将细胞收集至已标记的1.5 mL离心管中。在4 °C条件下以600 × g离心5分钟。小心弃去上清液，并通过轻弹管壁使沉淀充分重悬。每管加入1 mL FACS缓冲液洗涤细胞。如有必要，可在最低强度下短暂涡旋震荡，以确保沉淀完全解离。在4 °C条件下以600 × g再次离心5分钟。重复此洗涤步骤两次，共洗涤三次。将细胞沉淀重悬于200 µL FACS缓冲液中。使用涡旋震荡器轻轻但彻底地重悬每管中的细胞沉淀。将细胞悬液转移至已标记的5 mL流式管中。将流式管置于冰上，直至上机检测。打开流式细胞仪软件，创建新实验。点击样本，将弹出试管列表。双击并重命名各试管。将自发荧光对照管置于进样臂上，仅小心地向左移动底座。点击“采集数据”，然后点击“记录数据”，并选择所需的停止条件。围绕目标细胞群绘制设门区域，排除死细胞和碎片。取出试管。点击“下一个样本”，运行基础对照样本。点击“采集数据”，然后点击“记录数据”。打开软件，使用“添加样本”按钮添加样本。点击“添加样本”。选择实验日期文件夹，点击“确定”。在工作区中双击第一个样本（本例中为自发荧光对照）。绘制多边形门以圈定目标细胞群，排除死细胞和碎片。将图形切换为直方图。在M
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概述
本研究介绍了一种利用2′,7′-二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）探针检测穆勒胶质细胞（MGCs）内活性氧（ROS）水平的实验方案。该方法设计简便、可重复，并通过流式细胞术对ROS进行定量分析。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞生物学
- 氧化应激
- 神经科学
背景
- 活性氧（ROS）在多种细胞过程中发挥关键作用。
- 活性氧的检测对于理解细胞氧化应激至关重要。
- DCFH-DA探针是检测活性氧的常用方法。
- 该实验方案强调可重复性和操作简便性。
研究目的
- 提供一种在穆勒胶质细胞中检测活性氧的明确方案。
- 实现对神经元细胞中氧化应激的定量分析。
- 促进关于活性氧在胶质细胞功能与神经生物学中作用的研究。
使用的方法
- 培养 Müller 胶质细胞以建立生物学模型。
- 用抗氧化剂和活性氧诱导剂处理细胞，以评估活性氧水平。
- 使用 DCFH-DA 探针检测活性氧，并通过流式细胞术进行定量。
- 关键步骤包括用 PBS 洗涤细胞以及在检测过程中控制光照暴露。
主要结果
- 该方案可有效测定穆勒胶质细胞中的细胞内活性氧水平。
- 流式细胞术提供了对活性氧累积的定量分析。
- 结果证实了在特定条件下使用DCFH-DA探针的可行性。
结论
- 本研究建立了一种可靠的评估胶质细胞氧化应激的方法。
- 该方案简化了活性氧（ROS）的检测，提高了研究人员的操作便利性。
- 研究结果对理解神经生物学中的氧化应激及其潜在治疗靶点具有重要意义。
常见问题
行业重要性概述
利用DCFH-DA和流式细胞术对穆勒胶质细胞中活性氧（ROS）进行定量检测，可有效评估与神经退行性疾病及视网膜疾病模型相关的氧化应激机制。该技术有助于抗氧化通路调控的早期靶点验证和机制性风险排除。可靠的ROS定量结果可为针对疾病相关体系中氧化还原稳态的候选分子研发决策提供依据。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 可在胶质细胞模型中检测抗氧化通路的激活及氧化还原调控。
- 支持对参与氧化应激和细胞防御机制的靶点进行功能验证。
- 为影响活性氧（ROS）水平的候选干预措施提供机制性风险降低依据。
筛选与检测方法开发
- 有助于制备经过验证的细胞系统，用于针对氧化应激终点的化合物筛选。
- 提供标准化的定量活性氧检测结果，适用于实验重复性和跨研究比较。
- 能够在可扩展的体系中可靠地评估抗氧化或促氧化化合物的作用。
转化与临床前研究
- 与涉及氧化应激的视网膜病变（如糖尿病性视网膜病变）相关的疾病模型相一致。
- 通过将体外活性氧（ROS）调控与临床前生物标志物策略相联系，支持转化研究的连续性。
- 基于定量的细胞学结果，指导抗氧化候选药物的风险评估与推进。
流程与工作流整合
该活性氧定量工作流程适用于从早期发现到先导化合物鉴定的阶段，可支持假设验证以及与下游筛选的整合。
- 发现生物学：提供氧化还原通路激活及细胞对氧化应激反应的定量证据。
- 筛选：提供可重复的、基于流式细胞术的活性氧（ROS）检测方法，用于化合物初筛。
- 分析：利用几何平均荧光强度，实现不同实验条件下ROS水平的统计学比较。
- 转化研究：将体外氧化应激调控与视网膜模型中与疾病相关的终点指标相联系。
- 企业级复用：建立标准化的ROS检测平台，可适配多种细胞类型及氧化还原调节剂。
运营与企业影响
- 科学价值：提高氧化还原靶向发现的预测可信度，降低机制上的模糊性。
- 操作价值：为跨团队工作流程提供标准化、可扩展且可重复的活性氧（ROS）定量方法。
- 战略价值：优化针对抗氧化通路调节剂的立项或终止决策，提升资金使用效率。
- 项目组合影响：支持针对氧化应激机制的候选分子进行风险调整后的优先级排序。
实施注意事项
- 需要具备流式细胞术操作和数据分析的专业知识。
- 需要能够使用流式细胞仪及相关分析软件。
- 要求跨团队统一设门策略和荧光定量分析流程。
- 可通过优化探针加载和对照方案，适用于其他细胞模型。
- 依赖规范的样品处理，以最大限度减少实验变异性和光诱导伪影。
