利用细胞外通量分析探索单个三维微组织球体的线粒体能量代谢

本方案使研究人员能够探究线粒体能量代谢及无缝球状体，从而可在多种不同细胞系、细胞数量和表型之间，以及在药物发现和癌症研究领域中的药物处理条件下进行比较。本研究提供了一套详细的实验方案，利用三维球状体探究线粒体能量代谢，相较于单层细胞实验，该模型具有更优越的生理相关性。可从透明的球状体中推导出生物学结论，并外推至体内肿瘤，进而识别可能靶向球状体肿瘤代谢的通路。

例如，在类球体生长过程中碳水化合物的利用情况。所有数据均使用Seahorse细胞外通量96仪器检测，该仪器非常灵敏。在体外实验中，将类球体在检测板中的位置摆放准确，对于获得单个类球体水平的精确数据至关重要。

使用倒置相差显微镜在4倍放大倍数下检查类球体的活性，以确保类球体结构完整、形态正常以及各样本间整体均匀。为水合传感器 cartridge，将约20毫升校准液分装至一个锥形管中。将装有校准液的锥形管置于不含二氧化碳的37摄氏度培养箱中过夜。

取出检测试剂盒中的内容。将传感器盒倒置放在工具板旁边。使用多通道P300移液器，向工具板的每个孔中加入200 µL无菌双蒸水。

将传感器 cartridge 置于工具板上方。检查每个孔中的水位是否足够高，以浸没传感器探头。将组装好的传感器 cartridge 转移至不含二氧化碳的 37 °C 培养箱中，过夜孵育。

为包被球体培养微孔板，使用无菌技术，向球体培养微孔板的每孔中加入 30 微升无菌的 0.1 毫克/毫升多聚-L-赖氨酸溶液。从球体培养微孔板的每孔中吸除溶液，将微孔板倒置，并用力轻敲滤纸以去除残留液体。用 200 微升无菌双蒸水洗涤每孔。

最后一次洗涤后，将微孔板倒置并用力轻敲滤纸，以去除残留水分。在后续使用前，让微孔板室温晾干30分钟。按照文中的描述配制XF RPMI培养基。

在检测前一小时，将添加了补充物的 XF RPMI 检测培养基预热至 37 摄氏度。同时，将包被好的球形体检测微孔板置于不含二氧化碳的 37 摄氏度培养箱中预热。从空气培养箱中取出装有校准液的锥形管和传感器微孔板。

从工具板上取下传感器盒，倒置放在工作台面上。使用P300多通道移液器吸取工具板中的水并弃去。向工具板的每个孔中加入200 µL预热的校准液。

将传感器 cartridge 置于工具板上，确保传感器充分浸没在校准液中。将组装好的传感器 cartridge 转移至无二氧化碳、37°C 的培养箱中，直至准备加载端口注射溶液。从培养箱中取出类球体培养板，在显微镜下观察类球体，以确保在进行类球体转移步骤前其结构完整。

将180微升预热的检测培养基加入至球体培养板的每个孔中，包括用于背景校正的孔。在直径7厘米的培养皿中加入3毫升检测培养基，使其部分充满。使用多通道移液器（配备宽口移液器吸头，移液体积设定为10至50微升），将球体从96孔培养板转移至培养皿中。

将带有宽孔枪头的单通道移液器调至 20 微升体积，小心吸取单个球状体。将枪头直接置于该球状体检测微孔板每个孔的正中央，利用毛细作用使球状体从移液器枪头中脱出。通过显微镜观察，将移液器中的内容物重新吹打回培养皿中，以确认操作过程是否正常。

将所有类球体转移至类球体检测微孔板后，将该微孔板置于无二氧化碳、37°C的培养箱中，孵育至少一小时。根据论文所述方法，使用完全补充的预热XF RPMI检测培养基配制每种化合物的工作储备浓度。使用经校准的P100多通道移液器，将每种化合物的工作溶液各20微升加入对应的所有加样孔中。

准备分析仪以加载传感器盒。为了获得形态良好且致密的球状体，每种细胞系均针对接种密度和培养时间进行了单独优化。在优化的接种策略下，SK-OV-3 的球状体体积约为 5.46 × 10⁷ µm³，A549 的球状体体积约为 1.45 × 10⁸ µm³。

所有类球体类型在初始接种密度与类球体体积之间均呈现线性相关关系。完美的类球体对称性具有1.0的圆度值，偏离1.0则表示圆度降低。对于所有类球体类型，氧消耗率随类球体尺寸增加而升高，并与类球体体积呈线性相关，其中MCF-7类球体的氧消耗率最高，SK-OV-3类球体的最低。

MCF-7 类球体在整个实验过程中对溶剂对照无反应。在首次注射 0.5 微克/毫升后，经过五个测量循环，MCF-7 类球体的氧消耗率在加入寡霉素后降低。在 BAM15 作用下，第二次注射前氧消耗率升高。

而鱼藤酮联合抗霉素A则降低了线粒体呼吸。本研究采用肿瘤来源的三维球状体，建立了一种精确检测基础线粒体呼吸、ADP磷酸化呼吸、质子漏呼吸、偶联效率、最大呼吸能力及备用呼吸能力的实验方案。

所有呼吸化合物均产生了预期的氧气消耗速率动力学曲线，对应所选化合物表现出每分钟每孔20至30皮摩尔氧气的平均稳定基础呼吸速率。在微孔板中类球体的位置以及化合物注射后的测量周期编号，以确保在添加不同化合物之间呼吸速率保持稳定。在利用解偶联剂探究线粒体呼吸能力时，不仅解偶联剂的浓度至关重要，还需关注其在寡霉素存在下实现呼吸解偶联的能力；在研究线粒体能量代谢的实验中，寡霉素通常先于解偶联剂加入。