分离大鼠脂肪组织间充质干细胞并诱导其分化为胰岛素生成细胞
2022年8月29日
脂肪组织来源的间充质干细胞（Ad-MSCs）可能是分化为胰岛素生成细胞（IPCs）的一种潜在MSC来源。在本方案中，我们提供了分离和鉴定大鼠附睾Ad-MSCs的详细步骤，随后采用一种简单、快速的方案，由相同的大鼠Ad-MSCs诱导生成IPCs。
本实验方案的总体目标是利用简单方法分离和鉴定红色脂肪组织中的干燥间充质干细胞，并将其诱导分化为胰岛素生成细胞。间充质干细胞已在遗传学领域得到广泛应用。这些细胞可从多种来源分离获得，例如骨髓、脂肪组织和围产期组织。
它们具有优良的生物学特性，具有多向分化潜能，有望用于治疗多种疾病。脂肪组织是间充质干细胞的丰富来源。
与骨髓等其他来源相比，这些脂肪来源的间充质干细胞（MSCs）可从抽脂术获取的脂肪组织中轻松分离，且得率较高。它们可作为自体移植和异体移植的良好细胞来源。本视频展示了一种从大鼠附睾脂肪组织中分离和鉴定脂肪间充质干细胞的简单实验方案。
该方法是一种简单且高效的分离方法。分离后，我们将采用一种简单且相对短时的方案，诱导这些脂肪间充质干细胞分化为胰岛素生成细胞。我们首先通过胶原酶消化附睾脂肪以获得富含血管基质的组分，从而实现脂肪间充质干细胞的分离。
然后通过细胞贴壁生长特性、CD标志物的表达以及向多种中胚层谱系分化的能力来鉴定间充质干细胞。对动物实施麻醉，随后通过颈椎脱位法处死。用70%乙醇喷洒动物全身，并从腹部下部开始切除皮肤和肌肉组织。
然后暴露带有附睾脂肪的睾丸。轻轻剪除附睾脂肪，注意不要将血管与脂肪一同剪断。
在生物安全柜中，使用镊子和手术刀将脂肪组织切成小块。将脂肪组织转移至含有10毫升无菌PBS的离心管中。通过倾斜Falcon管45秒开始洗涤。
然后将离心管静置5分钟，使其分为两层。用10毫升注射器吸除下层的PBS。重复此洗涤步骤4至5次，直至PBS澄清。
洗涤后，将脂肪组织重悬于胶原酶溶液中，然后在摇动水浴中孵育，直至组织几乎呈均一状态。随后，将组织与胶原酶混合物涡旋振荡15秒，再离心5分钟。离心后，可观察到三层结构。
小心弃去基质血管组分上方的上清液。首先小心弃去顶部的油层，然后弃去回声层，注意不要扰动基质血管组分沉淀。将基质血管组分重悬于无菌BSA中，并再次离心5分钟。
整个离心过程完成后，将完全培养基DMEM F-12加入25平方厘米的培养瓶中。离心后，弃去上清液，并用完全培养基DMEM F-12重悬基质血管组分沉淀，然后转移至培养瓶中。
置于37°C、5%二氧化碳培养箱中。次日，去除未贴壁细胞，并更换为新鲜培养基。从分离后的次日开始，成纤维细胞样细胞将开始出现。
随着时间的推移，细胞数量和体积将逐渐增加。通过传代培养，细胞会变得更加均一。这些细胞符合所有间充质干细胞的鉴定标准。
这些细胞通过包含烟酰胺、β-巯基乙醇和艾塞那肽-4的简单方案被诱导分化为胰岛素生成细胞。在分化过程中，细胞逐渐失去成纤维细胞样的形态，形成类似簇状的结构。当使用胰岛素生成细胞时，可见呈阳性的深红色二噻腙染色，且这些胰岛素生成细胞表达多种β细胞标志物，如Pdx-1、mafA和胰岛素。
此外，当受到较高葡萄糖浓度刺激时，诱导生成的胰岛素分泌细胞在上清液中分泌更高水平的胰岛素。我们提供了一套详细、分步的方案，用于分离和鉴定脂肪间充质干细胞。同时，本文还提供了一种相对简短、简单且高效的方案，用于将脂肪间充质干细胞分化为胰岛素分泌细胞。
这为研究人员进入间充质干细胞领域并研究其向胰岛素生成细胞的分化提供了途径。
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概述
本方案概述了从大鼠附睾组织中分离和鉴定脂肪组织来源的间充质干细胞（Ad-MSCs），并进一步将其诱导分化为胰岛素生成细胞（IPCs）的步骤。所提供的方法简便，适用于实验室环境中的常规操作。
关键研究组成部分
科学领域
- 干细胞生物学
- 再生医学
- 内分泌学
背景
- 间充质干细胞（MSCs）可来源于多种组织，包括脂肪组织。
- 脂肪组织是间充质干细胞（MSCs）的丰富来源，具有良好的培养特性。
- 间充质干细胞（MSCs）具有分化为多种细胞类型的潜能，包括胰岛素生成细胞。
- 深入了解其分化过程有助于开发糖尿病治疗策略。
研究目的
- 分离并鉴定大鼠附睾来源的脂肪间充质干细胞（Ad-MSCs）。
- 建立将这些细胞诱导分化为胰岛样细胞团（IPCs）的实验方案。
- 为再生医学领域的后续研究提供一种可靠的方法。
使用的方法
- 从大鼠附睾脂肪中分离脂肪组织来源的间充质干细胞（MSCs）。
- 使用标准标志物对分离的间充质干细胞进行表征。
- 诱导分化为胰岛素生成细胞。
- 评估分化后胰岛素生成细胞的功能。
主要结果
- 成功分离出具有特征性表面标志物的脂肪间充质干细胞（Ad-MSCs）。
- 证实脂肪间充质干细胞（Ad-MSCs）可分化为胰岛样细胞簇（IPCs）。
- 功能评估显示胰岛样细胞簇（IPCs）具备胰岛素分泌能力。
- 该方案提供了从脂肪间充质干细胞（Ad-MSCs）生成胰岛样细胞簇（IPCs）的可重复方法。
结论
- 脂肪间充质干细胞是生成胰岛素产生细胞的可行来源。
- 该方案可促进糖尿病治疗的进一步研究。
- 未来的研究可探索这些胰岛素产生细胞的治疗潜力。
常见问题
行业高层相关性
脂肪来源的间充质干细胞（Ad-MSCs）为糖尿病研究中胰岛素生成细胞（IPCs）的获取提供了可再生且无伦理争议的来源。本方案提供了一种简单、可重复的方法，用于从大鼠附睾脂肪中分离和鉴定Ad-MSCs，并利用特定的生化信号诱导其分化为IPCs。该方法有助于在代谢性疾病早期治疗发现阶段进行靶点验证和机制性风险降低。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：能够探究间充质干细胞（MSC）的多向分化潜能及其向胰腺β细胞命运的谱系定向。
- 操作价值：提供经确认表达CD90、CD73和CD105的标准化脂肪来源间充质干细胞（Ad-MSCs），用于可重复的实验研究。
- 科学价值：通过葡萄糖刺激的胰岛素分泌（GSIS）和二氮杂苯染色对胰岛样细胞簇（IPCs）进行功能验证，确认其具备类似β细胞的功能特性。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：生成表达关键β细胞转录因子（Pdx-1、MafA、NKX6.1、Ins1）的胰岛样细胞簇（IPCs），可用于化合物筛选实验。
- 操作价值：利用脂肪源性间充质干细胞（Ad-MSCs）实现IPCs的可扩展化生产，用于高通量评估胰岛素分泌动态。
- 科学价值：通过使用高糖DMEM（HG-DMEM）、β-巯基乙醇、烟酰胺和艾塞那肽-4的稳定分化方案，促进实验的标准化。
转化与临床前研究
- 科学价值：通过生成在葡萄糖刺激下可增加胰岛素分泌的胰岛样细胞簇（IPCs），展示了其转化应用的相关性。
- 操作价值：为糖尿病模型中的剂量反应和功效测试提供可再生的细胞来源，支持临床前研究的连续性。
- 科学价值：在诱导生成胰岛样细胞簇（IPCs）前，通过成骨、成脂和成软骨分化验证多向分化潜能，从而降低生物学风险。
流程与工作流整合
该方法可整合到从早期靶点验证、先导物发现直至临床前评价的研究连续过程中，尤其适用于靶向β细胞替代或功能的糖尿病治疗药物开发。
- 发现生物学：利用明确的分化信号，支持对间充质干细胞（MSC）可塑性及谱系特化的假设验证。
- 筛选：实现可定量检测的胰岛样细胞（IPC）制备，输出指标包括胰岛素分泌水平和标志物表达。
- 分析：提供可量化的检测终点，包括葡萄糖刺激的胰岛素分泌（GSIS）、双硫腙染色以及胰岛β细胞标志物的qPCR，用于比较不同实验条件。
- 转化研究：通过功能性胰岛素释放检测，将体外生成的胰岛样细胞（IPC）与临床前验证相连接。
- 企业级复用：建立可重复使用的平台，从多个项目和细胞系的脂肪来源材料中生成胰岛样细胞（IPC）。
运营与企业影响
- 科学价值：通过多谱系表征和功能验证，实现对诱导性胰岛样细胞生成的预测性信心。
- 操作价值：在不同实验室之间实现脂肪源性间充质干细胞的分离与分化流程的标准化和可重复性。
- 战略价值：通过验证β细胞功能的细胞模型，为早期糖尿病治疗开发中的立项或终止决策提供依据。
- 项目组合影响：支持基于干细胞的代谢疾病干预策略的风险调整后优先排序。
实施注意事项
- 需要具备干细胞培养、分化技术以及用于免疫表型分析的流式细胞术方面的专业知识。
- 需要配备离心机、生物安全柜、培养箱以及葡萄糖刺激胰岛素分泌实验所需的设备。
- 需要对消化、洗涤和接种等操作步骤进行标准化，以确保间质血管组分的得率稳定一致。
- 在应用于不同脂肪组织部位或不同物种时，需调整分化时间和试剂浓度。
- 由于在诱导分化前需使用第3至第5代细胞以确保细胞群体的均一性和多向分化潜能，因此存在局限性。
