Name: 新生儿鼠心在朗根多夫制剂中的应用改良技术 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: 了解改良朗根多夫技术用于新生小鼠心脏离体灌注的方法。该技术可在三分钟内建立逆行灌注，将研究年龄缩短至出生后10天，适用于心脏发育和缺血再灌注损伤研究。

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NIH/NINDS R01NS112706 (R.L.)

本研究所有方法均获得哥伦比亚大学医学中心机构动物护理和使用委员会的批准。实验使用野生型 C57Bl/6 雄性出生后第 10 天小鼠。
1. 兰格多夫装置的准备
<ol>
	<li>为降低复杂性，在Langendorff装置中使用非循环式含氧灌注液（参见 材料表) 通过 恒定流速或恒定压力
	<ol>
		<li>使用含有 120 mmol/L NaCl、4.7 mmol/L KCl、1.2 mmol/L MgSO₄ 的克雷布斯-亨塞尔莱特缓冲液（KHB）4，1.2 mmol/L KH2PO4，1.25 mmol/L CaCl₂2，25 mmol/L NaHCO₃3,&#160;以及 pH 7.4 条件下的 11 mmol/L 葡萄糖（参见 材料表），用含 95% O₂ 的混合气体平衡2 和5% CO₂2 在朗根多夫装置内并维持在37 °C。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对于恒定流速法，保持约 2.5 mL∙min 的连续流速-1. 
	注意：鉴于出生10天（P10）小鼠心脏的平均重量约为30 mg，该流速将接近冠状动脉血流速度，约为75–80 mL/g∙min17,18.</li>
</ol>
2. 主动脉插管的制备
<ol>
	<li>使用26 G不锈钢针头（见材料表）制备新生小鼠主动脉插管。用锋利的剪刀剪去针尖，使末端变钝。注意不要压扁或缩小针腔的直径。通过在实验台面上轻轻前后刮擦钝化端，使切口边缘光滑并去除任何毛刺。 
	注意：必须去除显微毛刺和锐边，因为它们可能撕裂新生小鼠主动脉并损伤主动脉瓣。也可使用细粒度砂纸进行打磨。</li>
	<li>将制备好的插管连接至Langendorff装置，并评估流速与阻力。通过在已知时间段内收集并测量缓冲液体积来测定通过插管的流速。确保实际流速等于设定流速2.5 mL min-1。</li>
	<li>在KHB缓冲液流动条件下，按以下步骤量化插管两端的压力差。
	<ol>
		<li>测量系统在连接与未连接所制插管时的压力。</li>
		<li>将插管两端的压力差除以流速，根据欧姆定律15计算插管阻力。</li>
		<li>确保所制插管的阻力占总阻力的~16.0 ± 1.9 mmHg∙min∙mL-16。过高的阻力提示插管腔可能受损。 
		注意：示例计算：P带插管 - P无插管 = ΔP。若P带插管 = 48，P无插管 = 8，则ΔP = 40。当流速（Q）为2.5 mL min-1且ΔP为40时，利用公式R = ΔP/Q&#160; = 40 / 2.5 = 16，可得插管阻力为16 mmHg∙min∙mL-1。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>取下26 G插管，并将高压管路（见材料表）连接至Langendorff装置上的插管位置。将主动脉插管连接至管路远端。用充氧缓冲液排空管路和插管中的空气，确保所有气泡均被清除。 
	注意：以这种方式使用高压管路可使插管延伸至更远的位置，这对于在装置旁使用解剖显微镜进行主动脉插管是必要的（图1）。</li>
</ol>
3. 器官收获
<ol>
	<li>抗凝处理小鼠 通过 腹腔内（IP）注射肝素（10 kU/kg）（参见 材料表使用1 mL注射器连接26 G针头，注入肝素以防止冠状微血栓形成。在注射任何麻醉剂之前，需等待数分钟，使肝素充分循环。</li>
	<li>使用1 mL注射器配合26 G针头经腹腔注射麻醉动物。 
	注意：麻醉注射后必须密切监测动物，以避免呼吸暂停及继发性缺氧。戊巴比妥钠（70 mg/kg）是一种可靠的麻醉剂选择，因其可快速诱导镇静且不引起呼吸暂停。19,20. 可使用其他麻醉剂，前提是所用剂量不会引起呼吸暂停21研究人员应考虑其他镇静催眠药对心脏功能的影响22,23颈椎脱位作为主要的安乐死方式可能会延长插管前的缺氧和缺血时间。</li>
	<li>将小鼠置于仰卧位，并在其意识丧失后立即固定四肢。使用细规格皮下注射针固定每只肢体。&#160;一旦动物对脚趾夹捏无反应，立即开始取材；在初始解剖过程中，动物应能自主呼吸。</li>
	<li>在动物剑突下方做一横向切口，横跨动物体宽，使用直剪刀打开腹腔（参见 材料表). 
	注意：由于该手术为非存活性手术，无需采用无菌技术。
	<ol>
		<li>向上确认膈肌位置，完全切开前部。沿腋中线向头侧方向双侧切开肋骨。请助手用镊子夹住剑突并向上翻起胸骨和肋骨，以暴露胸腔器官。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在肝脏上方识别膈下下腔静脉（IVC）。用弯头虹膜剪在虹膜镊对近端血管段施加轻微前向和头侧张力的同时，横断下腔静脉（参见 材料表).
	<ol>
		<li>沿脊柱前表面使用弯头虹膜剪向后剪开，同时将下腔静脉向上并从胸腔中牵出。在游离心脏的过程中，将剪刀尖端朝向前方倾斜并切断&#160;上端的大血管，以完整移除心脏和肺。 
		&#8203;注意：该方法可实现心脏和肺的快速取出 整块地</li>
	</ol>
	</li>
	<li>立即将标本浸入冰冻的KHB或生理盐水中。心脏应在数秒内停止跳动。</li>
</ol>
4. 插管
<ol>
	<li>裁剪一张滤纸并放置在浅底培养皿底部，以提供摩擦力，帮助在插管过程中稳定心脏。用冰冻的KHB溶液润湿滤纸，防止心脏粘附其上。
	<ol>
		<li>将准备好的培养皿置于解剖显微镜下并调节焦距。将连接至高压延长管的主动脉插管以及一根松散地系在插管接头周围的5-0丝线一同置于解剖显微镜下（见材料表）。 
		注意：必须注意控制培养皿中的液体量，因充气的肺组织可能漂浮并导致离体器官移动。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将离体的胸腔器官放入培养皿中。在显微镜下，通过其白色光泽和两个叶状结构识别胸腺，并调整标本方向，使胸腺位于前上方24，以确保心脏的正确方位。</li>
	<li>使用镊子钝性分离胸腺的两叶，以暴露大血管。通过识别主动脉弓的分支特征来定位主动脉。 
	注意：右心室和肺动脉常呈现深紫色。升主动脉位于主肺动脉和右心房之间。</li>
	<li>使用精细的锐利剪刀（见材料表），在锁骨下动脉起始处近端剪断主动脉。 
	注意：若剪断位置过于靠近主动脉瓣，则可能缺乏足够的主动脉组织以固定插管；反之，若剪断位置过高，灌注液可能从一条或多条主动脉分支（如锁骨下动脉）泄漏。</li>
	<li>使用珠宝匠用精细弯头镊子（见材料表）轻轻夹住已剪断的主动脉。小心地用26 G钝头针插入主动脉，注意避免损伤主动脉瓣。用弯头精细镊子夹住插管周围的主动脉以固定位置。一旦完成对主动脉的控制，立即开始逆行灌注，以缩短缺血时间。 
	注意：心脏应开始自主搏动，并随着心肌血液排出及KHB灌注冠状动脉而逐渐变苍白。若心脏未能自发搏动、出现心室充血或颜色无变化，则提示插管位置不当。</li>
	<li>请助手拉紧先前松绑的缝线两端，小心地将主动脉缠绕固定在插管周围。根据主动脉组织长度和解剖情况，将缝线扎紧于弯头精细镊子的上方或下方（该镊子用于固定插管位置）。收紧缝线后，确认冠状动脉灌注是否充分。</li>
	<li>断开Langendorff装置上的高压管路。握住插管接头，将钝头针从高压延长管上分离，然后迅速将插管接头连接至Langendorff装置。 
	注意：操作时需小心，避免移位心脏或将空气引入插管内。</li>
	<li>当心脏以常规位置悬挂于Langendorff装置上且确认灌注充分后，仔细修剪去除肺组织、胸腺及其他多余组织。切开右心房，以便冠状窦流出液自由滴落。</li>
</ol>
5. 功能测定
<ol>
	<li>在5-0丝线缝合线（带弯曲针）的末端打一个小结。用针穿过一小片石蜡膜（2-3 mm × 2-3 mm），并将石蜡膜滑至打结端。小心地将针从心室心尖处穿入，拉动缝线使石蜡膜紧贴心室侧壁。 
	注意：石蜡膜有助于防止打结时撕裂心脏组织，并避免缝线从心室中滑脱。</li>
	<li>将针穿过Langendorff装置中注水加热套的开口。此时心脏可被包裹并加热。</li>
	<li>将针固定到力传感器（见材料表）上，注意避免冠状窦滴液。调整缝线，使基础张力达到1–2 g，以舒张期张力或张力记录中的最低点为准。 
	注意：避免将心脏从灌流插管上拉脱，或扭曲主动脉，以免影响冠状动脉灌注。</li>
	<li>将表面电极置于心脏的上极和下极，用于记录心电图。 
	注意：建议使用去除针头的小儿临时心外膜起搏导线作为柔韧的表面电极，并连接至生物放大器（见材料表）。</li>
	<li>使用24 G静脉导管采集冠状窦流出液用于分析（见材料表）。</li>
	<li>根据基尔霍夫定律25，从总系统阻力中减去插管阻力，以获得冠状动脉阻力。</li>
</ol>

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作者无任何利益冲突需要披露。

本研究描述了在离体新生小鼠心脏中成功进行主动脉插管和逆行灌注的方法。该方法尤为重要，因为它使研究人员能够克服以往因幼龄小鼠年龄小、心脏尺寸小而带来的技术障碍8。尽管该方法在设计上并不复杂，但仍需要较高的技术水平。其中，主动脉插管及固定插管位置是即使技术最熟练的研究人员也必然面临的关键挑战。新生儿期插管困难不仅源于主动脉管腔尺寸微小，升主动脉相对较短（从主动脉瓣至右锁骨下动脉起始处之间的主动脉组织）也可能使研究人员难以精确控制主动脉插管，因而需要团队成员之间仔细协调。若未能在该区域正确放置并固定插管，则可能导致实验失败。例如，插管插入过深可能损伤主动脉瓣或导致心室内插管；而插管位置过浅则可能引起灌注液从某一分支（如锁骨下动脉）外漏。此外，用力过猛的插管操作可能导致主动脉撕裂。这些不当插管所导致的后果通常表现为高流速或低灌注压1。相反，低流速或高灌注压则可能提示存在血栓、空气栓塞、插管阻塞或冠状动脉阻塞等情况1。无论病因如何，心律失常、心动过缓或心动过速均是灌注不足的表现<sup class="xr...

离体心脏制备已作为生理学、病理生理学和药理学研究的重要手段超过一个世纪。该技术起源于19世纪60年代Elias Cyon的工作，随后Oskar Langendorff改进了离体蛙心模型，采用逆向灌注方式，通过对主动脉根部加压，使含氧灌注液进入冠状动脉循环1。利用这一改进方法，Langendorff成功证明了冠状动脉循环与心脏机械功能之间的相关性2。这种离体逆向灌注心脏模型后来被命名为Langendorff技术，一直是生理学研究的核心方法之一，因其操作简便，可有效排除干扰因素，深入研究离体心脏的功能。Langendorff制备方法后续进一步被改良，使心脏能够射血（即所谓的&#34;工作心脏&#34;），并允许灌注液循环使用3。然而，主要关注的生理学终点指标始终未变，包括收缩功能、电传导、心肌代谢以及冠状动脉阻力等指标的测量4。
为了评估其原始蛙心制备中的心脏功能，朗根多夫（Langendorff）通过一根连接心尖与力传感器的缝合线，测量心室收缩在长轴方向上产生的张力。5 通过在无心室充盈的情况下对心脏施加基础张力，以此方式定量测定等长收缩。该方法的改进促使采用充满液体的球囊置入左心室。 通过 左心房评估等容收缩期间的心肌功能6为评估心脏节律和心率，可将体表导联置于心脏的两极，使研究人员能够记录心电图。然而，由于必然存在的去神经支配，可预期出现相对性心动过缓。外部起搏可用于克服这一现象，并消除实验间的心率变异。1另一项结果指标是心肌代谢，可通过测定冠状动脉灌注液和流出液中的氧含量及代谢底物含量，并计算两者之间的差值来评估。7冠状动脉流出液中乳酸的定量有助于表征缺氧、低灌注、缺血-再灌注或代谢紊乱等情况下出现的无氧代谢阶段。7.
兰根多夫的原始工作使得对心脏的离体研究成为可能 离体 哺乳动物心脏，以猫为主要研究对象5. 自20世纪中叶以来，霍华德·摩根（Howard Morgan）于1967年详细描述了“工作心脏”大鼠模型，使离体大鼠心脏的评估方法逐渐流行起来5小鼠的应用始于25年前，最初受限于技术复杂性、组织脆弱性以及小鼠心脏相对较小的尺寸。尽管小鼠研究面临诸多挑战，但其较低的成本和易于进行遗传操作的优势，显著提升了这类小鼠模型的吸引力与需求量 离体 制备。遗憾的是，该技术的应用目前仅限于成年动物，其中最年轻的实验对象为4周龄的幼年小鼠 离体 直到最近的一项研究8,9。尽管幼鼠 &#34;相对不成熟&#34; 与成年个体相比，它们作为发育生物学研究对象的用途有限，因为它们基本上已经断奶，并即将进入青春期10青春期的发生远超过心肌底物利用从葡萄糖和乳酸向脂肪酸转变的产后过渡期11因此，关于新生儿心脏代谢变化的大部分信息在历史上均源于 离体 在兔子和豚鼠等较大物种中进行研究11.
事实上，除朗根多夫（Langendorff）制备方法外，还存在其他替代方案。这些方案包括体外（in vitro）实验，但此类方法缺乏完整器官的功能性数据和生理背景；或体内（in vivo）研究，后者在技术上具有挑战性，且常受到多种混杂因素的干扰，例如必需麻醉剂对心血管和呼吸系统的影响、神经体液输入的作用、核心温度变化的后果、动物的营养状态以及底物的可利用性12,13。由于朗根多夫法能够在排除上述混杂因素的情况下，以更可控的方式对离体灌注心脏进行离体（ex-vivo）研究，因此该方法一直被视为一种强大的实验研究工具。因此，本文所介绍的技术为新生小鼠心脏的离体（ex-vivo）研究提供了一种实验方法，并有效缩短了再灌注所需的时间。
在心脏发育阶段进行研究至关重要，因为心肌成熟过程中会发生广泛的生物化学、生理学和解剖学转变。从无氧代谢向氧化磷酸化的转变、底物利用方式的改变，以及从细胞增殖向细胞肥大的过渡，是未成熟心脏中特有的动态过程11,14。发育中心脏的另一个关键特征是，在关键发育时期所遭遇的应激因素可能在新生儿心脏中引发更强烈的反应，并改变成年后对损伤的易感性15。尽管以往研究已采用新生大鼠、羔羊和兔子来建立离体灌流的新生心脏模型，但鉴于小鼠在发育生物学研究中的重要地位，建立适用于小鼠的技术十分必要16。为满足这一需求，近期已首次建立了使用出生10天小鼠的离体灌流新生小鼠心脏模型6。本文介绍了一种实现成功主动脉插管并建立离体新生小鼠心脏逆行灌流的方法。该方法可用于药理学、缺血-再灌注或代谢研究，以评估整个器官功能，也可经调整后用于心肌细胞的分离。

<table><tbody><tr><td>啮齿类动物朗根多夫装置</td><td>Radnoti</td><td>130102EZ</td><td></td></tr><tr><td>24 G 导管</td><td>BD</td><td>381511</td><td></td></tr><tr><td>1 mL 注射器组合 26 G 针头</td><td>BD</td><td>309597</td><td></td></tr><tr><td>26 G 钢针</td><td>BD</td><td>305111</td><td></td></tr><tr><td>5-0 丝线缝合线</td><td>Ethicon</td><td>S1173</td><td></td></tr><tr><td>生物放大器</td><td>ADInstruments</td><td>FE135</td><td></td></tr><tr><td>生物信号连接线</td><td>ADInstruments</td><td>MLA1515</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901-100G</td><td></td></tr><tr><td>循环加热水浴槽</td><td>Haake</td><td>DC10</td><td></td></tr><tr><td>弯头虹膜剪</td><td>Medline</td><td>MDS10033Z</td><td></td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td>Nikon</td><td>SMZ-2B</td><td></td></tr><tr><td>精细弹簧剪</td><td>Kent</td><td>INS600127</td><td></td></tr><tr><td>力传感器</td><td>ADInstruments</td><td>MLT1030/D</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-100G</td><td></td></tr><tr><td>肝素</td><td>Sagent</td><td>400-01</td><td></td></tr><tr><td>高压管路</td><td>Edwards Lifesciences</td><td>50P184</td><td></td></tr><tr><td>虹膜敷料镊</td><td>Kent</td><td>INS650915-4</td><td></td></tr><tr><td>珠宝匠式弯头精细镊</td><td>Miltex</td><td>17-307-MLTX</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911-25G</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662-25G</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506-500G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888-25G</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014-25G</td><td></td></tr><tr><td>滚压泵</td><td>Gilson</td><td>Minipuls 3</td><td></td></tr><tr><td>直头解剖剪</td><td>Kent</td><td>INS600393-G</td><td></td></tr><tr><td>临时心脏起搏导线</td><td>Ethicon</td><td>TPW30</td><td></td></tr><tr><td>宽量程力传感器</td><td>ADInstruments</td><td>MLT1030/A</td><td></td></tr></tbody></table>

改良的小鼠新生心脏在兰格多夫装置中的应用技术

Modified Technique for the Use of Neonatal Murine Hearts in the Langendorff Preparation

使用 离体 逆行灌注心脏自一百多年前 Oskar Langendorff 建立以来，一直是缺血-再灌注研究的核心方法。尽管该技术在过去25年中已应用于小鼠，但在该物种中的应用仅限于成年动物。建立一种可稳定插管新生小鼠主动脉的有效方法，将能够在心脏发育关键时期，利用一种可进行遗传修饰且成本较低的物种，系统性地研究离体逆行灌注心脏。对 Langendorff 装置进行改良，可在尽量缩短缺血时间的前提下，实现新生小鼠心脏的插管与再灌注的建立。该方法的优化需要两人协作，借助解剖显微镜和经改造的商用针头，成功完成新生小鼠主动脉的插管。采用此方法可在3分钟内可靠地建立逆行灌注。由于新生小鼠心脏组织脆弱且心室腔较小，无法使用球囊直接测量心室内压力，因此必须采用连接缝线至左心室心尖的力传感器，以量化纵向收缩张力。该方法使研究人员能够成功建立离体恒流逆行灌注新生小鼠心脏模型，从而支持对发育期心脏生物学的深入研究。 离体 重要的是，该模型将成为研究新生心脏缺血-再灌注生理学和药理学反应的有力工具。

采用出生后10天的小鼠模拟人类婴儿期的一个时间点26,27。成功分离并插管15只C57Bl/6新生小鼠心脏。心脏以2.5 mL min-1的恒定流速灌注加温且充氧的KHB溶液。检测代谢参数，包括葡萄糖摄取、耗氧量、乳酸生成，以及生理参数，如心率、灌注压和冠状动脉阻力。使用表面电极连续记录心电图，以确定其固有心率和节律（图2）。采用Langendorff所述方法测定心脏纵向轴向的收缩力28。
进行代谢评估以判断灌注是否充分。通过从灌注液的氧含量中减去冠状静脉流出液的氧含量，计算出氧提取百分比。心肌耗氧量通过冠状血流速率乘以灌注液与冠状静脉流出液之间氧含量的差值，再乘以氧的溶解度（假设在37 °C和760 mmHg条件下为24 µL/mL H2O）来确定29,</...

本方案描述了主动脉插管及逆行灌注 离体 新生小鼠心脏。采用双人操作策略，借助解剖显微镜和钝头细针，可实现可靠的插管。通过连接至左心室心尖部的力传感器，可定量测定纵向收缩张力。

离体逆行灌注心脏模型自Oskar ... 开发以来，一直是缺血-再灌注研究的核心方法

该方法可在三分钟内稳定建立新生小鼠离体心脏的逆行灌注，从而将可研究的最小年龄从数周降低至出生后10天。这种分离式逆行灌注模型可在心脏发育的关键时期，利用一种可进行遗传修饰且成本较低的物种对新生心脏进行研究。尽管该模型适用于研究新生心脏缺血-再灌注过程中的生理和药理反应，也可用于心肌细胞的分离。制备新生小鼠主动脉插管时，使用锋利的剪刀剪去26号不锈钢针头的尖端，并将末端磨钝，注意避免压扁或缩小针管内径。然后用钝端在实验台面上以推拉动作轻轻刮擦，修整切口边缘，去除毛刺。接着，将制备好的套管连接到兰格多夫装置上，评估流速和阻力。通过收集并测量一分钟时间间隔内流过的缓冲液体积，测定套管中的流速。为了量化克雷布斯-亨塞莱特缓冲液流动时套管两端的压力差，需测量系统在连接和不连接套管情况下的压力。然后使用以下公式计算套管阻力。接下来，从兰格多夫装置上取下26号套管，并在装置的套管插入部位连接一段高压管路。然后将主动脉插管连接至导管的远端，并用充氧缓冲液排尽导管和插管中的空气，确保完全去除所有气泡。为防止冠状微血栓形成，使用装有26号针头的1毫升注射器，对出生10天的小鼠幼崽进行腹腔注射肝素。在继续注射任何麻醉剂之前，等待数分钟，使肝素充分循环。接下来，将麻醉后的小鼠置于仰卧位，并在意识丧失后立即固定四肢。当动物对脚趾夹捏无反应时即开始取材，此时动物在初始解剖过程中仍保持自主呼吸。使用直剪刀在剑突下作一横向切口，横跨动物体宽，以暴露腹腔。请助手用镊子夹住剑突，然后沿腋中线向头侧方向在两侧剪开肋骨，将胸骨和肋骨向上翻折，以暴露胸腔器官。确认上方的膈肌后，完全切开其前部。在肝上方识别膈下下腔静脉，用弯头虹膜剪将其横断，同时用虹膜镊轻轻牵拉近端血管，保持向头侧的轻微张力。然后，使用弯头虹膜剪刀沿脊柱内表面向后剪开，同时将下腔静脉向上拉出胸腔。当心脏游离后，将剪刀尖端向前倾斜，从上方切断大血管，以完全取出心脏和肺脏。立即将标本浸入冰冻的克雷布斯-亨塞莱特缓冲液或生理盐水中。心脏应在数秒内停止跳动。在浅的培养皿底部放置一张纸巾，以提供摩擦力，从而在插管过程中稳定心脏。用冰冷的Krebs-Henseleit缓冲液润湿纸巾，防止心脏粘附其上。将准备好的培养皿置于解剖显微镜下并调节焦距。接着，将连接至高压延长管的主动脉套管以及一根 loosely tied 在其接头周围的 5-0 丝线一同置于解剖显微镜下。将切除的胸腔器官放置于培养皿中后，通过其白色光泽和两个叶状结构识别胸腺，并调整标本方向，使胸腺位于前上方。接下来，使用镊子钝性分离胸腺叶，暴露大血管。然后通过识别主动脉弓的特征性分支结构来确定主动脉位置，并用精细的锐利剪刀在锁骨下动脉起始处近端横断主动脉。现在用精细的弯头珠宝镊轻轻夹住横断的主动脉，小心地用26号钝头针穿刺主动脉进行插管，注意避免损伤主动脉瓣。使用精细的弯镊夹住套管周围的主动脉，并开始逆行灌注，以缩短缺血时间。请助手抓住预先松松结扎的缝线两端，小心地将套管周围的主动脉套入缝线内。在精细弯镊上方或下方收紧缝线，然后扎紧缝线，并确认冠状动脉血流充足。从兰格多夫装置上断开高压管路，握住插管的接头，将钝头针从高压延长管路上取下。然后迅速将插管接头连接到装置上。当心脏以常规位置悬挂于兰格多夫装置上后，确认灌注充分。小心地去除肺、胸腺及多余组织。然后切开右心房，使冠状窦流出液能够自由滴落。取一根5-0丝线，在末端打一个小结，将缝合针穿过一小片石蜡膜，再将石蜡膜沿缝线滑至打结的末端。小心地将针穿过心室的顶端，并将缝线拉过心脏，直至石蜡膜紧贴心室侧壁。将针穿过Langendorff装置中充满水的加热套的开口，以便包裹并加热心脏。然后将针连接至力传感器，注意避开冠状窦滴液处。根据舒张期张力或最低点张力描记图所示，调整缝线以施加1至2克的基线张力。然后将表面电极放置在心脏的上极和下极，以记录心电图。最后，使用24号静脉导管采集冠状窦流出液用于分析。采用体表电极记录连续心电图，以确定固有心率和心律。所有灌注充分的心脏均以窦性心律自发搏动。该灌注策略满足了新生小鼠心脏的代谢需求，表现为乳酸生成极少、氧摄取率低以及葡萄糖消耗量少。生理学变量的平均值，如去神经固有心率的平均值和观察到的主动脉灌注压的平均值，也被记录并计算。一些排除性标准，例如再灌注启动所需时间、心律失常持续时间以及主动脉灌注压，必须加以考虑，以确保新生动物模型制备的一致性。在建立灌注后，可进行干预操作，如给药、诱导缺血-再灌注损伤、代谢物改变或递送酶制剂以分离心肌细胞。

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Research

科研

JoVE Journal

Medicine

医学

新生儿鼠心在朗根多夫制剂中的应用改良技术

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一种用于从小鼠中分离心肌细胞的顺行灌流方法

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新生小鼠心脏巨噬细胞移植至成年小鼠

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改良的小鼠新生心脏在兰格多夫装置中的应用技术

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