改良的小鼠新生心脏在兰格多夫装置中的应用技术

该方法可在三分钟内稳定建立新生小鼠离体心脏的逆行灌注，从而将可研究的最小年龄从数周降低至出生后10天。这种分离式逆行灌注模型可在心脏发育的关键时期，利用一种可进行遗传修饰且成本较低的物种对新生心脏进行研究。

尽管该模型适用于研究新生心脏缺血-再灌注过程中的生理和药理反应，也可用于心肌细胞的分离。制备新生小鼠主动脉插管时，使用锋利的剪刀剪去26号不锈钢针头的尖端，并将末端磨钝，注意避免压扁或缩小针管内径。

然后用钝端在实验台面上以推拉动作轻轻刮擦，修整切口边缘，去除毛刺。接着，将制备好的套管连接到兰格多夫装置上，评估流速和阻力。通过收集并测量一分钟时间间隔内流过的缓冲液体积，测定套管中的流速。

为了量化克雷布斯-亨塞莱特缓冲液流动时套管两端的压力差，需测量系统在连接和不连接套管情况下的压力。然后使用以下公式计算套管阻力。接下来，从兰格多夫装置上取下26号套管，并在装置的套管插入部位连接一段高压管路。

然后将主动脉插管连接至导管的远端，并用充氧缓冲液排尽导管和插管中的空气，确保完全去除所有气泡。为防止冠状微血栓形成，使用装有26号针头的1毫升注射器，对出生10天的小鼠幼崽进行腹腔注射肝素。在继续注射任何麻醉剂之前，等待数分钟，使肝素充分循环。

接下来，将麻醉后的小鼠置于仰卧位，并在意识丧失后立即固定四肢。当动物对脚趾夹捏无反应时即开始取材，此时动物在初始解剖过程中仍保持自主呼吸。使用直剪刀在剑突下作一横向切口，横跨动物体宽，以暴露腹腔。

请助手用镊子夹住剑突，然后沿腋中线向头侧方向在两侧剪开肋骨，将胸骨和肋骨向上翻折，以暴露胸腔器官。确认上方的膈肌后，完全切开其前部。在肝上方识别膈下下腔静脉，用弯头虹膜剪将其横断，同时用虹膜镊轻轻牵拉近端血管，保持向头侧的轻微张力。

然后，使用弯头虹膜剪刀沿脊柱内表面向后剪开，同时将下腔静脉向上拉出胸腔。当心脏游离后，将剪刀尖端向前倾斜，从上方切断大血管，以完全取出心脏和肺脏。立即将标本浸入冰冻的克雷布斯-亨塞莱特缓冲液或生理盐水中。

心脏应在数秒内停止跳动。在浅的培养皿底部放置一张纸巾，以提供摩擦力，从而在插管过程中稳定心脏。用冰冷的Krebs-Henseleit缓冲液润湿纸巾，防止心脏粘附其上。

将准备好的培养皿置于解剖显微镜下并调节焦距。接着，将连接至高压延长管的主动脉套管以及一根 loosely tied 在其接头周围的 5-0 丝线一同置于解剖显微镜下。将切除的胸腔器官放置于培养皿中后，通过其白色光泽和两个叶状结构识别胸腺，并调整标本方向，使胸腺位于前上方。

接下来，使用镊子钝性分离胸腺叶，暴露大血管。然后通过识别主动脉弓的特征性分支结构来确定主动脉位置，并用精细的锐利剪刀在锁骨下动脉起始处近端横断主动脉。现在用精细的弯头珠宝镊轻轻夹住横断的主动脉，小心地用26号钝头针穿刺主动脉进行插管，注意避免损伤主动脉瓣。

使用精细的弯镊夹住套管周围的主动脉，并开始逆行灌注，以缩短缺血时间。请助手抓住预先松松结扎的缝线两端，小心地将套管周围的主动脉套入缝线内。在精细弯镊上方或下方收紧缝线，然后扎紧缝线，并确认冠状动脉血流充足。

从兰格多夫装置上断开高压管路，握住插管的接头，将钝头针从高压延长管路上取下。然后迅速将插管接头连接到装置上。当心脏以常规位置悬挂于兰格多夫装置上后，确认灌注充分。

小心地去除肺、胸腺及多余组织。然后切开右心房，使冠状窦流出液能够自由滴落。取一根5-0丝线，在末端打一个小结，将缝合针穿过一小片石蜡膜，再将石蜡膜沿缝线滑至打结的末端。

小心地将针穿过心室的顶端，并将缝线拉过心脏，直至石蜡膜紧贴心室侧壁。将针穿过Langendorff装置中充满水的加热套的开口，以便包裹并加热心脏。然后将针连接至力传感器，注意避开冠状窦滴液处。

根据舒张期张力或最低点张力描记图所示，调整缝线以施加1至2克的基线张力。然后将表面电极放置在心脏的上极和下极，以记录心电图。最后，使用24号静脉导管采集冠状窦流出液用于分析。

采用体表电极记录连续心电图，以确定固有心率和心律。所有灌注充分的心脏均以窦性心律自发搏动。该灌注策略满足了新生小鼠心脏的代谢需求，表现为乳酸生成极少、氧摄取率低以及葡萄糖消耗量少。

生理学变量的平均值，如去神经固有心率的平均值和观察到的主动脉灌注压的平均值，也被记录并计算。一些排除性标准，例如再灌注启动所需时间、心律失常持续时间以及主动脉灌注压，必须加以考虑，以确保新生动物模型制备的一致性。在建立灌注后，可进行干预操作，如给药、诱导缺血-再灌注损伤、代谢物改变或递送酶制剂以分离心肌细胞。