Name: 使用多分析物免疫珠测定法对Covid-19进行血清转换的动态监测 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: 学习使用多分析物免疫珠测定法同时检测SARS-CoV-2感染或疫苗接种后的IgA、IgM和IgG抗体滴度。该方法采用编码微球和流式多重读数仪，实现高通量血清学分析，为免疫学和疫苗开发研究提供可靠工具。

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作者感谢拉什生物标志物开发中心提供设施使用，感谢拉什生物样本库在受试者招募和生物样本处理方面的支持，以及感谢沃尔德基金会芝加哥冠状病毒评估网络（Chicago CAN）项目提供的资助，资助编号分别为SCI16（J.R.S. 和 J.A.B.）和21-00147（J.R.S. 和 J.A.B.），同时感谢Swim Across America基金会颁发的奖项（J.A.B.）。

所有受试者均在拉什大学医学中心机构审查委员会（IRB）批准的协议 ORA 20101207 框架下，签署书面知情同意书后纳入研究，并严格遵守所有机构规定的伦理研究准则。血液通过常规静脉穿刺采集至紫色真空采血管（K2EDTA）中，并按照推荐方案进行处理。所得血浆在 -80 °C 下保存，直至进行相关检测。
1. 抗原偶联微球的制备
<ol>
	<li>选择三个不同小瓶的磁性微球，每个小瓶具有独特的微球区域，记录所用每个小瓶的微球编号和批号信息。 
	注意：以下步骤将针对每种不同的微球区域分别进行。微球对光敏感，应避免长时间暴露于光照下。在洗涤步骤中，注意不要扰动微球。若发生扰动，需额外静置60秒以完成分离。</li>
	<li>使用前将微球储备液涡旋振荡60秒，并超声处理5分钟，以解离聚集的微球。</li>
	<li>将1.0 × 106个微球转移至1.5 mL低蛋白结合力的微量离心管中。</li>
	<li>将离心管插入磁力分离器中，静置60秒使微球分离。在保持离心管仍处于磁力分离器中的情况下，小心移除上清液，避免扰动微球沉淀。</li>
	<li>从磁力分离器中取出离心管，加入100 µL高效液相色谱级水重悬微球，涡旋振荡30秒。将离心管重新放回磁力分离器中静置60秒，随后移除上清液。重复此洗涤步骤两次。</li>
	<li>从磁力分离器中取出离心管，加入90 µL 100 mM 磷酸二氢钠缓冲液（pH 6.2，活化缓冲液），涡旋振荡30秒，重悬已洗涤的微球。</li>
	<li>向微球中加入10 µL 50 mg/mL Sulfo-NHS（用活化缓冲液稀释），轻轻涡旋10秒；再加入10 µL 50 mg/mL EDC溶液（用活化缓冲液稀释），轻轻涡旋10秒。室温（RT）孵育20分钟，每隔10分钟轻轻涡旋混匀一次。</li>
	<li>用50 mM MES缓冲液（pH 5.0，偶联缓冲液）替代高效液相色谱/质谱级水，重复步骤1.4–1.5的洗涤操作，共洗涤两次。</li>
	<li>从磁力分离器中取出离心管，加入100 µL偶联缓冲液重悬微球，涡旋振荡30秒，立即加入所需量的目标蛋白。</li>
	<li>用偶联缓冲液将总体积调至150 µL，涡旋振荡30秒混匀偶联反应体系，在室温下旋转孵育2小时。 
	注意：本实验中所定义的检测方法采用以下蛋白浓度进行偶联：Spike S1：5 µg；核衣壳蛋白：5 µg；膜蛋白：12.5 µg。</li>
	<li>用磷酸盐缓冲盐水（PBS）含1%山羊血清白蛋白和0.01%吐温-20（封闭缓冲液）替代高效液相色谱/质谱级水，重复步骤1.4的洗涤操作，共洗涤两次。将洗涤后的微球用含0.05%叠氮化钠的100 µL封闭缓冲液重悬，涡旋振荡30秒。 
	&#8203;注意：在进行后续任何操作前，需让微球在封闭缓冲液中充分封闭至少6小时。</li>
	<li>使用自动细胞计数仪或血球计数板对回收的微球数量进行计数，并记录实测的微球浓度。</li>
	<li>将偶联完成的微球置于4 °C避光冷藏保存。</li>
</ol>
2. 实验步骤
<ol>
	<li>检测性能（基础方案）
	<ol>
		<li>将偶联微球通过涡旋振荡30秒重新悬浮，并超声处理约60–90秒。</li>
		<li>从各自的管中取出所需量的每种微球胶体，并将微球胶体混合至一个新的1.5 mL微量离心管中。</li>
		<li>将试管插入磁性分离器中，静置60秒使微球沉淀。试管仍置于磁性分离器中时，小心移除上清液，避免扰动微球沉淀。</li>
		<li>将微球从分离器中取出，加入100 µL含1%牛血清白蛋白和0.01%吐温-20的磷酸盐缓冲液（检测缓冲液），涡旋振荡30秒。将试管放回磁性分离器中，静置60秒使微球沉淀。重复此洗涤步骤（即步骤2.1.3–2.1.4）两次。</li>
		<li>通过加入适量检测缓冲液，调整3重检测工作用微球混合物的浓度，使每种目标物的最终浓度为每1 µL含100个微球。</li>
		<li>将步骤2.1.5制备的微球混合物各12.5 µL加入384孔板的每个孔中，或各25 µL加入96孔板的每个孔中。</li>
		<li>用检测缓冲液将血浆/血清样本稀释500倍。根据所需滴定度制备标准品。</li>
		<li>加入12.5 µL检测缓冲液作为空白样本，并将各稀释后的样本或标准品分别加入384孔样本板的指定孔中；或在96孔样本板中，每孔加入25 µL空白、稀释样本或标准品。</li>
		<li>用铝封膜或铝箔覆盖板孔，在设定为700 rpm的板式振荡器上室温孵育1小时。 
		注：稀释曲线的示意图见表1。</li>
		<li>按照步骤2.1.11所述，用检测缓冲液将抗人检测抗体（二抗溶液）配制成4 µg/mL的工作浓度。</li>
		<li>将山羊抗人IgM与Super Bright 436（SB）偶联物/山羊抗人IgA与藻红蛋白（PE）偶联物检测抗体配制成4 µg/mL；或山羊抗人IgM与SB偶联物/山羊抗人IgG与PE偶联物检测抗体配制成4 µg/mL。 
		注：对于384孔板，每孔需12.5 µL配制好的二抗溶液；对于96孔板，每孔需25 µL。</li>
		<li>将板置于磁性分离器上，快速洗涤后用力倒置在生物危害容器上方以去除孔内液体。保持板倒置状态，用力在厚叠的纸巾上敲击数次。</li>
		<li>每孔加入100 µL检测缓冲液，通过如前所述的强力倒置方式从生物危害容器上方去除液体。重复此步骤（2.1.12–2.1.13）共两次洗涤。将所有使用过的纸巾丢弃至生物危害容器中。</li>
		<li>向384孔板的每孔加入12.5 µL二抗工作液，或向96孔板的每孔加入25 µL。用铝封膜或铝箔覆盖板孔，在设定为700 rpm的板式振荡器上室温孵育30分钟。</li>
		<li>重复洗涤步骤2.1.12–2.1.13。</li>
		<li>向384孔板的每孔加入75 µL检测缓冲液，或向96孔板的每孔加入100 µL。用铝封膜或铝箔覆盖板孔，在设定为700 rpm的板式振荡器上室温孵育5分钟。</li>
		<li>根据仪器操作手册，取60 µL反应混合物使用仪器分析仪进行检测。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>样本捕获孵育时间的优化
	<ol>
		<li>按照第2.1节所述步骤操作，在步骤2.1.9中分别采用30分钟、60分钟和120分钟的孵育时间。 
		注：孵育可在不同的板上分别进行，或在步骤2.1.6暂停，直至达到所需孵育时间后再继续进行步骤2.1.9。</li>
		<li>根据制造商推荐的方法，取60 µL检测混合物在分析仪上进行板读数。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>二抗浓度的优化
	<ol>
		<li>按照第2.1节详细描述进行本实验，但对二抗工作液（步骤2.1.10–2.1.11配制）中试剂的终浓度作如下调整： 
		山羊抗人（或兔）IgM SB偶联检测抗体浓度分别为8、4、2、1和0.5 µg/mL。 
		山羊抗人（或兔）IgA PE偶联检测抗体浓度分别为8、4、2、1和0.5 µg/mL。 
		山羊抗人（或兔）IgG PE偶联检测抗体浓度分别为8、4、2、1和0.5 µg/mL。 
		山羊抗人（或兔）IgG PE偶联/山羊抗人（或兔）IgM SB偶联检测抗体浓度分别为8、4、2、1和0.5 µg/mL。 
		&#8203;山羊抗人（或兔）IgA PE偶联/山羊抗人（或兔）IgM SB偶联检测抗体浓度分别为8、4、2、1和0.5 µg/mL。</li>
		<li>根据制造商推荐的方法，取60 µL检测混合物在分析仪上进行板读数。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>二抗孵育时间的优化
	<ol>
		<li>按照第2.1节所述进行本实验，在步骤2.1.14中分别设置15分钟、30分钟、60分钟和120分钟的孵育时间。</li>
		<li>根据制造商推荐的方法，取60 µL检测混合物在分析仪上进行板读数。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用优化后的双通道检测法评估受试者样本
	<ol>
		<li>在完成新冠疫苗（即第二剂）接种后的第-21天、第-11天、第-1/0天、第+14天、第+28天、第+60天、第+90天和第+120天，采集受试者的血浆样本（n = 4）。 
		注：第0天表示疫苗接种完成的时间点。</li>
		<li>使用基础方案（第2.1节）对所有样本进行检测，采用IgG/IgM或IgA/IgM双通道检测法。</li>
		<li>将各特异性免疫球蛋白及检测的实验结果归一化至其观察到的最大中位荧光强度（MFI）值。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Tighe, P. J., Ryder, R. R., Todd, I., Fairclough, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ELISA+in+the+multiplex+era%3A+potentials+and+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics+-+Clinical+Applications%22%5BJournal%5D)">ELISA in the multiplex era: potentials and pitfalls.</a> Proteomics - Clinical Applications. 9, 406-422 (2015).</li>
<li>Baker, H. N., Murphy, R., Lopez, E., Garcia, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+a+capture+ELISA+to+a+Luminex+xMAP+assay+using+a+multiplex+antibody+screening+method%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Conversion of a capture ELISA to a Luminex xMAP assay using a multiplex antibody screening method.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e4084(2012).</li>
<li>Powell, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multiplex+microsphere-based+immunoassay+increases+the+sensitivity+of+siv-specific+antibody+detection+in+serum+samples+and+mucosal+specimens+collected+from+rhesus+macaques+infected+with+SIVmac239%5BTitle%5D)+AND+%22BioResearch+Open+Access%22%5BJournal%5D)">A multiplex microsphere-based immunoassay increases the sensitivity of siv-specific antibody detection in serum samples and mucosal specimens collected from rhesus macaques infected with SIVmac239.</a> BioResearch Open Access. 2 (3), 171-178 (2013).</li>
<li>Volpetti, F., Garcia-Cordero, J., Maerkl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+platform+for+high-throughput+multiplexed+protein+quantitation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A microfluidic platform for high-throughput multiplexed protein quantitation.</a> PLoS One. 10 (2), 0117744(2015).</li>
<li>Rabi, F. A., Al Zoubi, M. S., Kasasbeh, G. A., Salameh, D. M., Al-Nasser, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+and+coronavirus+disease+2019%3A+What+we+know+so+far%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 and coronavirus disease 2019: What we know so far.</a> Pathogens. 9 (3), 231(2020).</li>
<li>Asif, M., Xu, Y., Xiao, F., Sun, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+of+COVID-19%2C+vitality+of+emerging+technologies+and+preventive+measures%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Engineering+Journal%22%5BJournal%5D)">Diagnosis of COVID-19, vitality of emerging technologies and preventive measures.</a> Chemical Engineering Journal. 423, Lausanne, Switzerland. 130189(2021).</li>
<li>La Marca, A., Capuzzo, M., Paglia, T., Roli, L., Trenti, T., Nelson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Testing+for+SARS-CoV-2+%28COVID-19%29%3A+a+systematic+review+and+clinical+guide+to+molecular+and+serological+in-vitro+diagnostic+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+Biomedicine+Online%22%5BJournal%5D)">Testing for SARS-CoV-2 (COVID-19): a systematic review and clinical guide to molecular and serological in-vitro diagnostic assays.</a> Reproductive Biomedicine Online. 41 (3), 483-499 (2020).</li>
<li>Armbruster, D. A., Pry, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limit+of+blank%2C+limit+of+detection+and+limit+of+quantitation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Clinical+Biochemist.+Reviews%22%5BJournal%5D)">Limit of blank, limit of detection and limit of quantitation.</a> The Clinical Biochemist. Reviews. 29, Suppl 1 49-52 (2008).</li>
<li>Tarhoni, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+circulating+tumor-associated+autoantibodies+and+clinical+outcomes+in+advanced-stage+NSCLC+patients+receiving+PD-1%2F-L1+directed+immune+checkpoint+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Relationship between circulating tumor-associated autoantibodies and clinical outcomes in advanced-stage NSCLC patients receiving PD-1/-L1 directed immune checkpoint inhibition.</a> Journal of Immunological Methods. 490, 112956(2021).</li>
<li>Deeks, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+tests+for+identification+of+current+and+past+infection+with+SARS-CoV-2%5BTitle%5D)+AND+%22The+Cochrane+Database+of+Systematic+Reviews%22%5BJournal%5D)">Antibody tests for identification of current and past infection with SARS-CoV-2.</a> The Cochrane Database of Systematic Reviews. 6, 013652(2020).</li>
<li>Mahalingam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Landscape+of+humoral+immune+responses+against+SARS-CoV-2+in+patients+with+COVID-19+disease+and+the+value+of+antibody+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Heliyon%22%5BJournal%5D)">Landscape of humoral immune responses against SARS-CoV-2 in patients with COVID-19 disease and the value of antibody testing.</a> Heliyon. 7 (4), 06836(2021).</li>
<li>Ruano-Gallego, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multiplex+antigen+microarray+for+simultaneous+IgG+and+IgM+detection+against+SARS-CoV-2+reveals+higher+seroprevalence+than+reported%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A multiplex antigen microarray for simultaneous IgG and IgM detection against SARS-CoV-2 reveals higher seroprevalence than reported.</a> Microbial Biotechnology. 14 (3), 1228-1236 (2021).</li>
<li>Shah, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IgG+and+IgM+antibody+formation+to+spike+and+nucleocapsid+proteins+in+COVID-19+characterized+by+multiplex+immunoblot+assays%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">IgG and IgM antibody formation to spike and nucleocapsid proteins in COVID-19 characterized by multiplex immunoblot assays.</a> BMC Infectious Diseases. 21 (1), 325(2021).</li>
<li>Gambino, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+a+rapid+immunochromatographic+test+with+a+chemiluminescence+immunoassay+for+detection+of+anti-SARS-CoV-2+IgM+and+IgG%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemia+Medica+%28Zagreb%29%22%5BJournal%5D)">Comparison of a rapid immunochromatographic test with a chemiluminescence immunoassay for detection of anti-SARS-CoV-2 IgM and IgG.</a> Biochemia Medica (Zagreb). 30 (3), 030901(2020).</li>
<li>Algaissi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+S1+and+N-based+serological+assays+reveal+rapid+seroconversion+and+induction+of+specific+antibody+response+in+COVID-19+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 S1 and N-based serological assays reveal rapid seroconversion and induction of specific antibody response in COVID-19 patients.</a> Scientific Reports. 10, 16561(2020).</li>
<li>Chiereghin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+the+evaluation+of+serological+assays+for+the+diagnosis+of+SARS-CoV-2+infection+and+COVID-19%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Public+Health%22%5BJournal%5D)">Recent advances in the evaluation of serological assays for the diagnosis of SARS-CoV-2 infection and COVID-19.</a> Frontiers in Public Health. 8, 620222(2020).</li>
<li>Nicol, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+SARS-CoV-2+serological+tests+for+the+diagnosis+of+COVID-19+through+the+evaluation+of+three+immunoassays%3A+Two+automated+immunoassays+%28Euroimmun+and+Abbott%29+and+one+rapid+lateral+flow+immunoassay+%28NG+Biotech%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Virology%3A+The+Official+Publication+of+the+Pan+American+Society+for+Clinical+Virology%22%5BJournal%5D)">Assessment of SARS-CoV-2 serological tests for the diagnosis of COVID-19 through the evaluation of three immunoassays: Two automated immunoassays (Euroimmun and Abbott) and one rapid lateral flow immunoassay (NG Biotech).</a> Journal of Clinical Virology: The Official Publication of the Pan American Society for Clinical Virology. 129, 104511(2020).</li>
<li>Butt, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+multiplex+serology+to+serolomics-A+novel+approach+to+the+antibody+response+against+the+SARS-CoV-2+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">From multiplex serology to serolomics-A novel approach to the antibody response against the SARS-CoV-2 proteome.</a> Viruses. 13 (5), 749(2021).</li>
<li>Byrum, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((multiSero%3A+open+multiplex-ELISA+platform+for+analyzing+antibody+responses+to+SARS-CoV-2+infection%5BTitle%5D)+AND+%22medRxiv%22%5BJournal%5D)">multiSero: open multiplex-ELISA platform for analyzing antibody responses to SARS-CoV-2 infection.</a> medRxiv. , (2021).</li>
<li>Dobano, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+sensitive+and+specific+multiplex+antibody+assays+to+quantify+immunoglobulins+m%2C+a%2C+and+g+against+SARS-CoV-2+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Highly sensitive and specific multiplex antibody assays to quantify immunoglobulins m, a, and g against SARS-CoV-2 antigens.</a> Journal of Clinical Microbiology. 59 (2), 01731(2021).</li>
<li>Schultz, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+validation+of+a+multiplex+microsphere+immunoassay+using+dried+blood+spots+for+SARS-CoV-2+seroprevalence%3A+Application+in+first+responders+in+first+responders+in+Colorado%2C+USA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Development and validation of a multiplex microsphere immunoassay using dried blood spots for SARS-CoV-2 seroprevalence: Application in first responders in first responders in Colorado, USA.</a> Journal of Clinical Microbiology. 59 (6), 00290(2021).</li>
<li>Beavis, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+EUROIMMUN+anti-SARS-CoV-2+ELISA+assay+for+detection+of+IgA+and+IgG+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Virology%3A+The+Official+Publication+of+the+Pan+Americal+Society+for+Clinical+Virology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the EUROIMMUN anti-SARS-CoV-2 ELISA assay for detection of IgA and IgG antibodies.</a> Journal of Clinical Virology: The Official Publication of the Pan Americal Society for Clinical Virology. 129, 104468(2020).</li>
<li>Jung, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+performance+of+a+semi-quantitative+assay+for+SARS-CoV2+IgG+and+SARS-CoV2+IgM+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Clinica+Chimica+Acta%3A+International+Journal+of+Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Clinical performance of a semi-quantitative assay for SARS-CoV2 IgG and SARS-CoV2 IgM antibodies.</a> Clinica Chimica Acta: International Journal of Clinical Chemistry. 510, 790-795 (2020).</li>
</ol>

Borgia 博士是本论文所使用的血清学检测方法的发明人，该方法正在申请专利。本文仅以描述性方式呈现，未提供任何统计分析，以避免作者利益冲突可能带来的潜在偏倚。

针对SARS-CoV-2暴露后产生的免疫应答进行评估，结合基于RT-PCR的感染状态监测，已被广泛描述为明确新冠（Covid-19）康复进程、识别具有潜在治疗价值的恢复期血浆，以及在人群层面调查感染率的有效策略10,11。用于理解人体血清学转化的多种方法包括蛋白质（抗原）芯片12、免疫印迹13、快速免疫层析检测装置14以及酶联免疫吸附测定（ELISA）15,16,17。上述每种技术均可通过微小调整，分别检测多种免疫球蛋白同种型。然而，这些方法难以被实际改造以实现多种同种型的并行分析（如本论文所述），因而其在基于人群的大规模检测策略中的应用受到成本和通量的限制。其中部分应用还可提供将多种抗原水平进行平行叠加检测的机会，形式包括原始格式或改进格式，例如多重ELISA18,19。最后，免疫磁珠平台也具备并行检测多种抗原水平的潜力20,21，但除非使用近期具备“双通道”检测能力的仪器，否则每项检测通常仅限于单一表位（即免疫球蛋白同种型）。
本报告列举了一项案例研究中的实验方案，该研究采用仪器的“双通道”模式，通过免疫磁珠检测法对新冠疫苗接种者的血清转化过程中多个表位进行可靠检测。该方法采用人工实验设计，展现出优异的精密度（%CV 值通常 &#60;20%），若整合实验室自动化系统，性能可进一步提升。所有选定分析物和表位的检测灵敏度和动态范围均适用于常规评估。尽管 commercially-available 抗抗原 IgA 和 IgM 免疫试剂的缺乏限制了定量检测仅限于 IgG 同种型，但这一限制并不妨碍提供半定量评估，或以特定样本作为校准品进行相对评估22,23。
经过验证的免疫磁珠检测法被用于研究接种新冠疫苗人群队列中的血清转化情况。与其他类似平台相比，该系列仪器在手动操作流程中每天可检测数百名个体的血清转化，在自动化方案中则可达数千名。总体而言，这些结果证实，“双通道”方法具有足够的灵敏度，可在同一检测中并行描述多个表位，且适用于多分析物检测环境。当分别使用藻红蛋白和Super Bright 436荧光染料检测通道1和通道2时，两者灵敏度的差异可能需要设计特定实验，以确保获得可靠的分析结果。也就是说，为保持检测的动态范围能够涵盖未知样本的观测值，可能需要将通道1保留用于检测丰度较低的表位或分析物。除此之外，该检测的设计较为直观，应易于分析能力有限的实验室采用。当然，在考虑通道1与通道2之间的干扰时，应权衡这一因素，正如我们在图5中所观察到的，高丰度同种型的信号干扰可能导致在双通道检测格式下对低丰度同种型产生误导性的分析误差。当分析物浓度差异极大时，此类干扰的可能性若不在检测设计阶段妥善处理，可能成为该方法的重要局限性。
综上所述，本文介绍了一种快速检测与新冠病毒感染或疫苗接种免疫反应相关的主要免疫球蛋白亚型抗体滴度的方法。通过纵向应用该方法评估血清转化，可能提供有助于更好地管理或监测疾病进程的见解，或者为未来的新冠加强疫苗接种计划提供指导依据。

对生物样本中多种疾病相关生物标志物进行同时检测，可为病理过程提供描述性和预测性见解。尽管传统的单分析物免疫学方法（如酶联免疫吸附试验，ELISA）一直是临床和科研领域定量分析的基石，但这些技术在通量、每次检测所需的样本量以及成本效益方面存在显著局限性，严重限制了对疾病进程中常相互关联的多种生物组分的研究1。基于微球的多重检测技术因其能够整合多种检测项目，提高实验室通量，缓解样本稀缺问题，并减少重复检测以实现最大成本节约，已成为诊断和研究机构不可或缺的平台1,2,3,4。近年来，随着具备双报告分子功能的仪器问世，该多重检测能力得到了进一步增强。双报告分子功能采用两个荧光通道进行检测，增加了多重检测的维度，使得在同一分析物上检测多个表位成为可能。
严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）是当前新型冠状病毒病2019（COVID-19）大流行的致病原5。虽然在疾病初期，RT-PCR检测对于确诊感染至关重要，但血清学抗体滴度检测已被证明在准确、全面评估个体是否曾暴露于病毒或已康复、对免疫接种的应答情况，以及评估新冠疫苗接种效果等方面具有不可替代的作用6,7。
本报告阐述了利用基于流式、多重读取的双报告系统，检测针对多种SARS-CoV-2病毒抗原的血清学转化的方法。具体而言，该方法可同时检测三种SARS-CoV-2抗原（包括刺突蛋白S1、核衣壳蛋白和膜（又称基质）糖蛋白）的两种抗体亚型（配置为IgG/IgM或IgA/IgM）。该方法为纵向监测血清学转化提供了理想平台，并为抗击新冠疫情提供了有力工具。

<table><tbody><tr><td>384孔黑色侧壁聚苯乙烯微孔板</td><td>Thermo Fisher</td><td>12-565-346</td><td></td></tr><tr><td>活化缓冲液（0.1 M NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;，pH 6.2）</td><td>实验室自配</td><td></td><td></td></tr><tr><td>检测缓冲液（PBS，1% 牛血清白蛋白，0.01% 吐温-20）</td><td>实验室自配</td><td></td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白，热休克组分</td><td>MilliporeSigma</td><td>A-7888-50G</td><td></td></tr><tr><td>偶联缓冲液（50 mM MES，pH 5.0）</td><td>实验室自配</td><td></td><td></td></tr><tr><td>新型冠状病毒（COVID-19 M冠状病毒）重组基质蛋白（6xHis标签）</td><td>MyBioSource</td><td>MBS8574735</td><td></td></tr><tr><td>一次性移液器吸头</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDC（1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐）</td><td>Thermo Fisher</td><td>PIA35391</td><td></td></tr><tr><td>山羊白蛋白，V组分粉末</td><td>MilliporeSigma</td><td>A2514-1G</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗人IgA，R-PE标记，多克隆抗体</td><td>Thermo Fisher</td><td>OB205009</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗人IgG，R-PE标记，多克隆抗体</td><td>Thermo Fisher</td><td>OB204009</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗兔IgG，R-PE标记，多克隆抗体</td><td>Thermo Fisher</td><td>OB403009</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗人IgM，R-PE标记，多克隆抗体</td><td>Thermo Fisher</td><td>OB202009</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗人IgM，SB 436，克隆SA-DA4</td><td>Thermo Fisher</td><td>62999842</td><td></td></tr><tr><td>仪器分析仪</td><td>Luminex Corp.</td><td>INTELLIFLEX-RUO</td><td></td></tr><tr><td>低吸附微量离心管（1.5 mL）</td><td>Thermo Fisher</td><td>13-698-794</td><td></td></tr><tr><td>MagPlex-C微球，区域XXX</td><td>Luminex Corp.</td><td>MC10XXX-01</td><td></td></tr><tr><td>MES水合物（2-(N-吗啉)乙烷磺酸水合物）</td><td>MilliporeSigma</td><td>M2933</td><td></td></tr><tr><td>微孔板铝封膜</td><td>Thermo Fisher</td><td>07-200-683</td><td></td></tr><tr><td>吐温-20</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Quality Biological公司PBS，pH 7.2</td><td>Thermo Fisher</td><td>50-751-7328</td><td></td></tr><tr><td>封闭缓冲液（PBS，1% 山羊血清白蛋白，0.01% 吐温-20）</td><td>实验室自配</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SARS-CoV-2（2019-nCoV）核衣壳蛋白（His标签）</td><td>Sino Biologicals</td><td>40588-V08B</td><td></td></tr><tr><td>SARS-CoV-2（2019-nCoV）刺突蛋白（S1亚基，His标签）</td><td>Sino Biologicals</td><td>40591-V08H</td><td></td></tr><tr><td>SARS-CoV-2（2019-nCoV）刺突蛋白RBD抗体，兔多克隆抗体</td><td>Sino Biologicals</td><td>40592-T62</td><td></td></tr><tr><td>SARS-CoV-2（2019-nCoV）核衣壳抗体，兔单克隆抗体</td><td>Sino Biologicals</td><td>40588-R0004</td><td></td></tr><tr><td>SARS-CoV-2（COVID-19）膜蛋白抗体（IN），兔多克隆抗体</td><td>ProSci</td><td>10-516</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-NHS（N-羟基琥珀酰亚胺磺酸盐）</td><td>Thermo Fisher</td><td>PIA39269</td><td></td></tr><tr><td>洗涤缓冲液（PBS，0.01% 吐温-20）</td><td>实验室自配</td><td></td><td></td></tr><tr><td>水，LC/MS级</td><td>Thermo Fisher</td><td>W-64</td><td></td></tr></tbody></table>

使用多指标免疫磁珠检测法对新冠血清转化进行动态监测

Dynamic Monitoring of Seroconversion using a Multianalyte Immunobead Assay for Covid-19

用于同时检测多种生物标志物的多重技术已存在数十年；然而，针对同一分析物上多个表位进行评估的方法仍然有限。本报告描述了一种用于血清学检测的多重免疫磁珠法的开发与优化过程，该方法可检测与SARS-CoV-2感染或疫苗接种免疫反应相关的常见免疫球蛋白同种型（如IgA、IgM和IgG）。实验采用基于流式、具备双通道功能的多重荧光读数仪完成。优化内容主要包括分析物捕获时间、检测抗体浓度以及检测抗体孵育时间。通过“双通道”模式，分别对IgG/IgM或IgA/IgM血清型组合建立了分析性能特征（如检测范围（包括定量下限和上限）以及批内和批间精密度）。对于大多数应用而言，IgG捕获时间为30分钟、IgM为60分钟、IgA为120分钟，可在检测性能与通量之间实现良好平衡。检测抗体在4 µg/mL浓度下孵育30分钟时表现最佳，且推荐用于常规应用，因其整体表现出优异的精密度（变异系数百分比（%CV）≤ 20%）和灵敏度。IgG同种型在各检测项目（Spike S1、核衣壳蛋白和膜糖蛋白）中的动态范围跨越多个数量级，支持在临床应用中以1:500稀释比例进行可靠的滴度评估。最后，将优化后的方案应用于4名完成SARS-CoV-2疫苗接种程序的受试者Spike S1血清转化监测。在此队列中，Spike S1特异性IgG水平在第二剂接种后14天达到峰值，其信号强度远高于IgM或IgA同种型（约高出40倍）。值得注意的是，我们观察到Spike S1特异性IgG滴度的衰减速率存在高度个体差异，主要取决于受试者自身因素，这将成为后续研究的主题。

本文介绍了一种便捷的方法，可同时监测针对SARS-CoV-2感染或疫苗接种所引发的免疫反应中两种免疫球蛋白亚型（IgA、IgM或IgG）抗体滴度的动态变化。该“多重分析物新冠免疫反应检测组”采用基于编码微球的三种间接免疫测定法，使用具备“双通道”功能的流式多重读数仪进行检测。

用于同时检测多种生物标志物的多重技术已存在数十年；然而，用于评估多个表位的方法……

我们今天演示的方法为评估与 COVID-19 感染或疫苗接种相关的抗体血清转化提供了高通量解决方案，适用于常规分析。有趣的是，该方法使我们能够在同一分析物上评估多个表位。该技术在生物科学领域具有广泛应用，包括细胞信号传导研究和免疫应答监测。今天为您演示该技术的是我实验室的博士后研究员 Dr.Imad Tarhoni。首先，选择三种具有不同微球区域的磁性微球小瓶，记录每瓶所用微球的编号和批号信息。随后，将选定的微球储备液涡旋振荡 60 秒，并超声处理 5 分钟。将1.0 × 10⁶个磁珠转移至一个1.5毫升低蛋白结合微离心管中，并将该管插入磁力架，静置60秒以使磁珠分离。保持管子仍在磁力架中，小心移除上清液，避免扰动磁珠沉淀。将离心管从磁力架上取下，加入100微升HPLC级水重悬磁珠，涡旋振荡30秒。再次将离心管放回磁力架中静置60秒，然后移去上清液。重复该洗涤步骤两次。最后一次洗涤后，将试管从磁力架上取下，加入90 µL pH 6.2的活化缓冲液，涡旋振荡30秒，重悬洗涤后的微球。接着，依次加入10 µL浓度为50 mg/mL的anhydroxy-sulfosuccinamide和10 µL浓度为50 mg/mL的EDC溶液，每次加入后涡旋振荡10秒。随后，将微球在室温下孵育20分钟，每隔10分钟轻柔涡旋一次。孵育后，按照前述方法，用50毫摩尔的MES或偶联缓冲液（pH 5.0）将微球洗涤两次，重复洗涤共两次。完成后，将试管从磁力分离器上取下，加入100微升偶联缓冲液，涡旋振荡30秒使微球重悬，随后立即向试管中加入所需量的蛋白质。用偶联缓冲液将总体积调至150微升，涡旋混匀30秒。然后将离心管在室温下旋转孵育2小时。孵育结束后，用PBS封闭缓冲液洗涤微球两次，并将洗涤后的微球重悬于100微升含有0.05%叠氮化钠的封闭缓冲液中，涡旋混匀30秒。使用自动细胞计数器统计回收的微球数量，并记录观察到的微球浓度。为保证检测性能，将偶联微球通过涡旋振荡30秒重悬，并超声处理60至90秒。随后，从相应的离心管中取出所需量的每种微球胶体，并将这些微球胶体混合至一个新的1.5毫升微量离心管中。接下来，将试管插入磁力架中，静置60秒以使磁珠分离。试管仍置于磁力架中时，小心移除上清液，避免扰动磁珠沉淀。从磁力架中取出试管后，将磁珠重悬于100 µL的检测缓冲液中。将试管涡旋振荡30秒，然后放入磁力分离器中60秒，以分离微珠。重复洗涤两次。接下来，通过加入适量的检测缓冲液，调节三重工作微球混合物的浓度，使每种目标微球的最终浓度为每1微升含100个微球。将25微升微球混合物分装至96孔板的每个孔中。用检测缓冲液将血浆或血清样本稀释500倍，并根据所需滴定度制备标准品样本。每孔加入25微升检测缓冲液作为空白样本，并将各稀释后的样本或标准品分别加入96孔样本板的指定孔中。完成后，用铝封膜或封口膜覆盖酶标板，置于设定为每分钟700转的酶标板摇床上，室温孵育一小时。根据论文所述，用检测缓冲液配制抗人检测抗体或二抗溶液，浓度为每微升4微克。将酶标板置于磁力分离架上快速洗涤，然后用力将酶标板倒置在生物危害容器上方，以彻底去除孔中的液体。保持酶标板倒置，用力将板在一团厚实的纸巾上敲击。然后，每孔加入 100 µL 检测缓冲液进行洗涤，并用力将板倒置在生物危害容器上方以去除液体。重复洗涤两次。最后一次洗涤后，将所有使用过的纸巾丢弃至生物危害容器中。随后，向96孔板的每个孔中加入25 µL二抗工作液，并用铝箔纸覆盖，在700 rpm的平板摇床中孵育。孵育30分钟后，用检测缓冲液将各孔洗涤两次，方法同前。然后，向96孔板的每个孔中加入100 µL检测缓冲液。用铝箔纸覆盖板子，在室温下于板式摇床上孵育5分钟。根据仪器系统操作手册，使用仪器分析仪分析60 µL样品。为优化样本捕获孵育时间，将反应板分别孵育 30、60 和 120 分钟。孵育结束后，在分析仪上检测 60 微升的反应混合物。针对刺突蛋白 S1、膜蛋白抗体和核衣壳蛋白，采用 1:5 系列稀释法建立七点标准曲线进行评估。通过在酶标板上进行板内精密度测试，评估检测的精密度，以变异系数百分比、标准差和平均值进行计算。对于板间精密度，每项检测分别制备了三批不同的微球试剂。计算了使用标准品和人血浆样本进行检测时的各项精密度参数。在孵育120分钟时，刺突蛋白S1、膜蛋白和核衣壳抗体的IgG滴度对应的平均中位荧光强度值达到最佳，表明一抗结合动力学较快。双通道检测中二抗浓度优化结果显示，所有浓度下信号均处于线性测量范围，具有较宽的动态范围。不同二抗孵育时间下的检测信号以及各孵育时间的信号变化详情如下所示。在双通道检测的特异性评估中，空白对照与单一报告通道之间几乎未观察到交叉信号干扰。在展示 COVID-19 疫苗接种后血清转化事件的示例中，观察到的刺突蛋白 S1 IgA 和 IgM 水平较 IgG 同种型滴度约低 40 倍。该方法对于监测免疫功能低下个体对疫苗的应答具有重要意义。这将使我们能够确定这些患者是否真正通过这些疫苗接种获得了保护。

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使用多分析物免疫珠测定法对Covid-19进行血清转换的动态监测

本视频介绍了一种使用荧光磁性微珠或微球的免疫分析技术，该微珠或微球偶联了不同抗原，可同时检测血清样本中的多种抗体亚型。该检测方法有助于了解感染期间或接种疫苗后的血清学转化过程。...

多分析物免疫珠检测：一种基于流式技术的免疫分析方法，用于同时检测人血清样本中的多种抗体亚型

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开发唾液抗体多重免疫分析法以检测人类对环境病原体的暴露

采用一种用于基于微球的多重检测的流式分析系统，该系统提供双报告信号读出，用于开发多重血清学和抗体中和检测方法，可同时检测SARS-CoV-2的中和性IgG和IgM抗体。...

一种用于多重微球流式分析系统的快速、多重双报告基因IgG和IgM SARS-CoV-2中和检测方法

本文所述方案介绍了HiBiT-受体结合域蛋白复合物的制备方法及其在快速、灵敏检测SARS-CoV-2抗体中的应用。...

基于HiBiT生物报告系统的SARS-CoV-2受体结合域抗体检测

SARS-CoV-2, 受体结合域, 抗体检测, HiBiT, 生物报告系统, 免疫分析, 发光检测, 血清学检测, 病毒中和抗体, 体外检测

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一种用于1型糖尿病、乳糜泻和新冠肺炎的高通量多重筛查方法

采用三通道双报告荧光流式分析系统，建立了一种基于微球的多重免疫测定方法，可同时检测血清样本中针对多种引起欧洲和北美莱姆病的Borrelia物种抗原所产生的IgG和IgM抗体。...

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通过多重双报告基因策略对病毒颗粒表面蛋白表位进行分析

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沙特吉达不同疫情阶段健康献血者中针对IgG抗体水平的COVID-19血清流行率检测

我们介绍一种基于无细胞合成生物学原理和点印迹技术的新型免疫检测平台，可用于定制化检测人和动物血清中的抗体反应。...

无细胞点印迹法作为一种实用且可灵活调整的免疫检测平台，用于检测人和动物血清中的抗体反应

多重荧光免疫测定正成为血清学检测的参考方法。然而，其应用受限于复杂且耗时的微球-分析物偶联过程。本报告介绍了一种半自动化、可重复的多重微球偶联方案，其效果与标准方法相当，但显著缩短了获得结果所需的时间。...

一种用于检测虫媒病毒抗体反应的多重血清学检测方法

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