使用多指标免疫磁珠检测法对新冠血清转化进行动态监测

我们今天演示的方法为评估与 COVID-19 感染或疫苗接种相关的抗体血清转化提供了高通量解决方案，适用于常规分析。有趣的是，该方法使我们能够在同一分析物上评估多个表位。该技术在生物科学领域具有广泛应用，包括细胞信号传导研究和免疫应答监测。

今天为您演示该技术的是我实验室的博士后研究员 Dr.Imad Tarhoni。首先，选择三种具有不同微球区域的磁性微球小瓶，记录每瓶所用微球的编号和批号信息。随后，将选定的微球储备液涡旋振荡 60 秒，并超声处理 5 分钟。

将1.0 × 10⁶个磁珠转移至一个1.5毫升低蛋白结合微离心管中，并将该管插入磁力架，静置60秒以使磁珠分离。保持管子仍在磁力架中，小心移除上清液，避免扰动磁珠沉淀。

将离心管从磁力架上取下，加入100微升HPLC级水重悬磁珠，涡旋振荡30秒。再次将离心管放回磁力架中静置60秒，然后移去上清液。重复该洗涤步骤两次。

最后一次洗涤后，将试管从磁力架上取下，加入90 µL pH 6.2的活化缓冲液，涡旋振荡30秒，重悬洗涤后的微球。接着，依次加入10 µL浓度为50 mg/mL的anhydroxy-sulfosuccinamide和10 µL浓度为50 mg/mL的EDC溶液，每次加入后涡旋振荡10秒。随后，将微球在室温下孵育20分钟，每隔10分钟轻柔涡旋一次。

孵育后，按照前述方法，用50毫摩尔的MES或偶联缓冲液（pH 5.0）将微球洗涤两次，重复洗涤共两次。完成后，将试管从磁力分离器上取下，加入100微升偶联缓冲液，涡旋振荡30秒使微球重悬，随后立即向试管中加入所需量的蛋白质。

用偶联缓冲液将总体积调至150微升，涡旋混匀30秒。然后将离心管在室温下旋转孵育2小时。孵育结束后，用PBS封闭缓冲液洗涤微球两次，并将洗涤后的微球重悬于100微升含有0.05%叠氮化钠的封闭缓冲液中，涡旋混匀30秒。

使用自动细胞计数器统计回收的微球数量，并记录观察到的微球浓度。为保证检测性能，将偶联微球通过涡旋振荡30秒重悬，并超声处理60至90秒。随后，从相应的离心管中取出所需量的每种微球胶体，并将这些微球胶体混合至一个新的1.5毫升微量离心管中。

接下来，将试管插入磁力架中，静置60秒以使磁珠分离。试管仍置于磁力架中时，小心移除上清液，避免扰动磁珠沉淀。从磁力架中取出试管后，将磁珠重悬于100 µL的检测缓冲液中。

将试管涡旋振荡30秒，然后放入磁力分离器中60秒，以分离微珠。重复洗涤两次。接下来，通过加入适量的检测缓冲液，调节三重工作微球混合物的浓度，使每种目标微球的最终浓度为每1微升含100个微球。

将25微升微球混合物分装至96孔板的每个孔中。用检测缓冲液将血浆或血清样本稀释500倍，并根据所需滴定度制备标准品样本。每孔加入25微升检测缓冲液作为空白样本，并将各稀释后的样本或标准品分别加入96孔样本板的指定孔中。

完成后，用铝封膜或封口膜覆盖酶标板，置于设定为每分钟700转的酶标板摇床上，室温孵育一小时。根据论文所述，用检测缓冲液配制抗人检测抗体或二抗溶液，浓度为每微升4微克。将酶标板置于磁力分离架上快速洗涤，然后用力将酶标板倒置在生物危害容器上方，以彻底去除孔中的液体。

保持酶标板倒置，用力将板在一团厚实的纸巾上敲击。然后，每孔加入 100 µL 检测缓冲液进行洗涤，并用力将板倒置在生物危害容器上方以去除液体。重复洗涤两次。

最后一次洗涤后，将所有使用过的纸巾丢弃至生物危害容器中。随后，向96孔板的每个孔中加入25 µL二抗工作液，并用铝箔纸覆盖，在700 rpm的平板摇床中孵育。孵育30分钟后，用检测缓冲液将各孔洗涤两次，方法同前。

然后，向96孔板的每个孔中加入100 µL检测缓冲液。用铝箔纸覆盖板子，在室温下于板式摇床上孵育5分钟。根据仪器系统操作手册，使用仪器分析仪分析60 µL样品。

为优化样本捕获孵育时间，将反应板分别孵育 30、60 和 120 分钟。孵育结束后，在分析仪上检测 60 微升的反应混合物。针对刺突蛋白 S1、膜蛋白抗体和核衣壳蛋白，采用 1:5 系列稀释法建立七点标准曲线进行评估。

通过在酶标板上进行板内精密度测试，评估检测的精密度，以变异系数百分比、标准差和平均值进行计算。对于板间精密度，每项检测分别制备了三批不同的微球试剂。计算了使用标准品和人血浆样本进行检测时的各项精密度参数。

在孵育120分钟时，刺突蛋白S1、膜蛋白和核衣壳抗体的IgG滴度对应的平均中位荧光强度值达到最佳，表明一抗结合动力学较快。双通道检测中二抗浓度优化结果显示，所有浓度下信号均处于线性测量范围，具有较宽的动态范围。不同二抗孵育时间下的检测信号以及各孵育时间的信号变化详情如下所示。

在双通道检测的特异性评估中，空白对照与单一报告通道之间几乎未观察到交叉信号干扰。在展示 COVID-19 疫苗接种后血清转化事件的示例中，观察到的刺突蛋白 S1 IgA 和 IgM 水平较 IgG 同种型滴度约低 40 倍。该方法对于监测免疫功能低下个体对疫苗的应答具有重要意义。

这将使我们能够确定这些患者是否真正通过这些疫苗接种获得了保护。