土壤样品中昆虫病原真菌分离方法的比较

分离昆虫病原真菌对于开发生物杀虫剂具有重要意义，同时有助于研究该类群的多样性、分布及生态学特性。利用昆虫诱饵法分离昆虫病原真菌被认为是一种成本低且效率高的方法。该方法使用含氯霉素、噻苯咪唑和环己酰亚胺的人工培养基，不使用多菌灵，且在土壤样品处理过程中所需空间较小。

关键步骤包括在一周和两周后检查CTC平板，以防止其他真菌过度生长而抑制虫生真菌的发育，随后根据虫生真菌菌落的宏观形态和微观形态进行鉴定。首先，使用小铲子采集深10厘米、重800克的土壤样品。将样品置于聚丙烯袋中，室温保存，直至实验开始。

由于昆虫病原真菌具有根际定殖能力，因此也可采集细小的根系。若使用含氯霉素、噻苯咪唑、放线菌酮或CTC选择性人工培养基分离真菌，称取0.35克带根或不带根的土壤样品，并将其置于1.5毫升离心管中。

在生物安全柜中操作时，向含有土壤的微量离心管中加入1毫升无菌的0.01体积百分比吐温80（聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯）水悬浮液，涡旋振荡30秒。完成后，吸取50微升上清液，滴加到含CTC培养基的培养皿中央。然后使用直径为6毫米的无菌Drigalski刮刀将悬液均匀涂布于培养基表面。

将平板置于25摄氏度、相对湿度不低于80%的暗光气候培养箱中孵育。在孵育7天、14天和21天后，观察平板上真菌菌落的生长情况。使用表面消毒的Galleria mellonella和Tenebrio molitor晚期幼虫作为昆虫诱饵来分离真菌。

将幼虫浸入0.5%次氯酸钠溶液中一分钟以进行消毒。随后用无菌水清洗幼虫两次。在塑料盆中组装诱饵，盆盖上打10个直径为10毫米的小孔，内装250克采集的土壤。

每隔一天将土壤充分混匀，以使幼虫与土壤充分接触，并每天观察花盆，寻找死亡的昆虫。从花盆中取出死亡昆虫后，用0.5%次氯酸钠表面消毒1分钟。为促进真菌感染，将消毒后的昆虫置于相对湿度80%、25摄氏度的湿润培养箱中培养7天。

在真菌感染发生后，从昆虫体表收集分生孢子，并借助微生物接种环，在体视显微镜下将分生孢子接种至含有0.05%氯霉素的马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDAC培养基）上。作为替代方法，可将整条感染的幼虫置于PDAC培养基上。随后按照前述方法，将培养皿放入气候培养箱中进行培养。

培养14天后，按照文稿中的描述，通过分析平板上真菌培养物的宏观形态特征来鉴定虫生真菌（EPF）种类。随后，在80%相对湿度和25°C条件下，将气生分生孢子转移至载片培养物中培养3天。3天后，用乳酚蓝对载片染色，以观察其显微特征。

在光学显微镜下，于400倍镜下观察真菌结构，如排列方式、分生孢子梗、分生孢子的形状和大小，以确认杀虫真菌（EPF）的鉴定结果。本研究从524份土壤样品中分离出51株金龟子绿僵菌（Metarhizium）和白僵菌（Beaveria）属的杀虫真菌。代表性分析展示了部分金龟子绿僵菌属和白僵菌属分离株的微观形态特征。

采用三种不同的分离方法研究了24份土壤样品中虫生真菌（EPF）的发生情况。结果表明，大蜡螟（Galleria mellonella）诱饵在分离中效率最高，其次是黄粉虫（Tenebrio molitor）诱饵和CTC培养基。这24份土壤样品中未分离到白僵菌属（Beaveria）物种，仅分离到绿僵菌属（Metarhizium）。

需要牢记的最重要事项是将气生分生孢子转移至载玻片进行涂片，观察显微镜下的特征，并利用形态学检索表确认虫生真菌的鉴定结果。其他方法包括使用含有特定化学物质的选择性人工培养基，以抑制污染物（如多菌灵）的生长。寻找具有优异生物防治特性的新型真菌分离株，对于提高真菌在节肢动物害虫防控中的有效性以及深入探索无脊椎动物病理学领域的相关问题至关重要。