Name: 聚糖介导的蛋白质相互作用研究的生物信息学资源 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 21 s
Description: 探索聚糖信息学方法，利用在线数据库和可视化工具分析人类蛋白质糖组数据。本方案演示如何通过GlyConnect和UniLectin3D等资源研究聚糖在健康与疾病中的作用机制。

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作者衷心感谢蛋白质组信息学小组的历任和现任成员，他们参与了本教程所用资源的开发工作，特别是Julien Mariethoz和Catherine Hayes对GlyConnect的贡献，François Bonnardel对UniLectin的贡献，Davide Alocci和Frederic Nikitin对Octopus的贡献，以及Thibault Robin对Compozitor的开发和Octopus最终完善所做的工作。
glyco@Expasy 项目的发展得到了瑞士联邦政府通过教育、研究与创新国务秘书处（SERI）的支持，并由瑞士国家科学基金会（SNSF：31003A_179249）提供补充资助。ExPASy 由瑞士生物信息学研究所维护，并托管于 Vital-IT 能力中心。作者还感谢 Anne Imberty 在 UniLectin 平台上的卓越合作，该平台由法国国家研究局 PIA glyco@Alps（ANR-15-IDEX-02）、罗纳河谷联盟校区联合资助计划（http://campusrhodanien.unige-cofunds.ch）以及 Labex Arcane/CBH-EUR-GS（ANR-17-EURE-0003）共同支持。

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<li>Sehnal, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LiteMol+suite%3A+interactive+web-based+visualization+of+large-scale+macromolecular+structure+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">LiteMol suite: interactive web-based visualization of large-scale macromolecular structure data.</a> Nature Methods. 14 (12), 1121-1122 (2017).</li>
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<li>Compagno, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycans+and+galectins+in+prostate+cancer+biology%2C+angiogenesis+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Glycans and galectins in prostate cancer biology, angiogenesis and metastasis.</a> Glycobiology. 24 (10), 899-906 (2014).</li>
<li>Gentilini, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+and+high+expression+of+Galectin-8+tightly+controls+metastatic+progression+of+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Stable and high expression of Galectin-8 tightly controls metastatic progression of prostate cancer.</a> Oncotarget. 8 (27), 44654-44668 (2017).</li>
<li>Schwämmle, V., Verano-Braga, T., Roepstorff, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+and+statistical+methods+for+high-throughput+analysis+of+post-translational+modifications+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Computational and statistical methods for high-throughput analysis of post-translational modifications of proteins.</a> Journal of Proteomics. 129, 3-15 (2015).</li>
<li>Khatri, K., Klein, J. A., Zaia, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+an+informed+search+space+maximizes+confidence+of+site-specific+assignment+of+glycoprotein+glycosylation%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Use of an informed search space maximizes confidence of site-specific assignment of glycoprotein glycosylation.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (2), 607-618 (2017).</li>
<li>Sztain, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+glycan+gate+controls+opening+of+the+SARS-CoV-2+spike+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A glycan gate controls opening of the SARS-CoV-2 spike protein.</a> Nature Chemistry. 13, 963-968 (2021).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

利用 GlyConnect Octopus 揭示意外相关性的工具 
GlyConnect Octopus 最初设计用于以较宽松的糖链定义来查询数据库。事实上，文献中通常会报告糖组中糖链的主要特征，例如是否含有岩藻糖基化或唾液酸化修饰、是否具有两个或更多天线结构等。此外，无论 N-连接还是 O-连接的糖链，均可根据《糖生物学要点》（Essentials of Glycobiology）1 参考手册中详述的核心结构进行分类，这类核心结构也常在已发表的文章中被引用。最后，血型抗原等糖链表位是研究者在结构中关注的另一类特性，可能被单独识别以对糖链进行分型。最终，针对特定组织或选定物种中表达的糖组，搜索其共性或差异特征可能是有意义的。从这一角度看，所收集的信息应被用作提出新假设的依据，而非被视为唯一确定的事实。
利用 GlyConnect Compozitor 构建糖链组成集合的工具 
浏览蛋白质页面中描述的结构信息存在局限性，因为列表形式往往掩盖了条目化结...

糖类、与其相连的蛋白质（糖蛋白）以及与其结合的蛋白质（凝集素或碳水化合物结合蛋白）是细胞表面主要的分子参与者1。尽管它们在细胞间通讯中具有核心作用，但与基因组学和蛋白质组学相比，大规模研究（包括糖组学、糖蛋白质组学或糖类相互作用组学数据）仍然十分有限。
直到最近，仍缺乏能够在复杂碳水化合物与载体蛋白保持偶联状态下对其分支结构进行表征的方法。糖蛋白的生物合成是一种非模板驱动的过程，其中单糖供体、接受糖基的糖蛋白底物以及糖基转移酶和糖苷酶共同发挥相互作用。由此产生的糖蛋白可能带有复杂的结构，具有多个分支点，每个单糖组分都可能是自然界中存在的多种类型之一1。由于该过程不依赖模板，因此生化分析成为获取寡糖结构信息的唯一选择。对天然蛋白质上连接的糖链结构进行分析往往具有挑战性，因为需要高灵敏度、定量且可靠的分析技术来确定单糖组成、连接方式及分支序列2。
在此背景下，质谱法（MS）是糖组学和糖蛋白质组学实验中最广泛使用的技术。随着时间推移，这些实验正越来越多地在高通量条件下进行，相关数据也不断积累至各类数据库中。以多种格式表示的聚糖结构3已收录于GlyTouCan4，这是通用的聚糖数据存储库，其中每种结构均被赋予一个稳定标识符，而不论该聚糖定义的精确程度如何（例如，可能缺少连接类型或组成不明确）。极为相似的结构被分别收集，但其微小差异均被清晰记录。糖蛋白的信息则在GlyConnect5和GlyGen6两个相互交叉引用的数据库中进行描述与人工审校。支持结构证据的质谱数据正越来越多地存储于GlycoPOST7中。关于在线资源的更全面覆盖，参考手册《糖生物学精要》（Essentials of Glycobiology）的第52章专门介绍了糖生物信息学8。值得注意的是，近年来糖肽鉴定软件大量涌现9,10，但并未有效提升结果的可重复性。这一问题促使人类蛋白质组组织糖蛋白质组学计划（HUPO GlycoProteomics Initiative, HGI）的领导者于2019年发起了一项软件挑战赛。来自复杂人血清N-和O-糖蛋白混合物经CID、ETD和EThcD三种碎裂模式处理后获得的质谱数据，向所有参赛者（无论是软件用户还是开发者）公开。此处仅概述该挑战赛结果的完整报告11。首先，观察到鉴定结果存在较大差异。这主要归因于不同搜索引擎所采用的方法、参数设置、输出结果的过滤方式以及肽段“计数”方式的多样性。实验设计本身也可能使某些软件或方法处于有利或不利地位。尤为重要的是，使用相同软件的不同参与者报告了不一致的结果，凸显了严重的可重复性问题。通过比较不同提交结果发现，某些软件的表现优于其他软件，某些搜索策略也更有效。这一反馈有望指导自动化糖肽数据分析方法的改进，并反过来影响数据库的内容建设。
糖组学信息学的发展推动了网络门户的建立，这些门户提供信息并可访问多个相似或互补的资源。最新且最全面的资源在《综合糖科学》（Comprehensive Glycoscience）丛书的一章中有详细描述12，并通过合作，以开放获取的方式提供了数据共享与信息交换的解决方案。其中一个门户最初名为 Glycomics@ExPASy13，随着 ExPASy 平台的全面升级14，该门户被重新命名为 Glyco@Expasy。ExPASy 平台数十年来一直托管着大量被多种组学领域广泛使用的工具和数据库，其中最受欢迎的是 UniProt15——即通用蛋白质知识库。Glyco@Expasy 通过可视化分类及其相互依赖关系的展示，提供了一种教学式的数据库与工具用途探索方式。以下实验方案展示了如何利用该门户中的一系列资源，探索糖组学和糖蛋白质组学数据，并通过糖组学明确建立糖蛋白质组学与糖链互作组学之间的联系。via 目前，糖组学实验可产生单糖结构完全定义、糖链连接方式部分或完全确定的结果，但其在蛋白质上的位点附着信息却很少甚至完全未被表征。相比之下，糖蛋白质组学实验能够提供精确的位点附着信息，但对糖链结构的解析能力较差，通常仅限于单糖组成。这些信息在 GlyConnect 数据库中被整合在一起。此外，GlyConnect 中的搜索工具可用于检测潜在的糖链配体，这些配体及其识别蛋白在 UniLectin16 中有详细描述，并通过糖链与 GlyConnect 相关联。via 本文所述的实验方案分为两个部分，分别涵盖与 N-连接和 O-连接糖链及糖蛋白相关的具体问题。

<table><tbody><tr><td>互联网连接</td><td>用户自选</td><td></td><td></td></tr><tr><td>最新版本的网页浏览器</td><td>用户自选</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

用于研究聚糖介导的蛋白质相互作用的生物信息学资源

Bioinformatics Resources for the Study of Glycan-Mediated Protein Interactions

Glyco@Expasy 项目作为一个相互关联的数据库与工具集合，涵盖了糖生物学多个方面的知识。其特别目标是突出由糖链介导的糖蛋白（如细胞表面受体）与糖结合蛋白之间的相互作用。本文通过两个典型示例——人前列腺特异性抗原（PSA）的N-糖组和人血清蛋白的O-糖组，介绍该集合中的主要资源。通过不同的数据库查询并借助可视化工具，本文展示了如何在一个连续的流程中探索和比较内容，以收集并关联原本分散的信息片段。所收集的数据旨在为更复杂的糖链功能研究场景提供支持。因此，本文所介绍的糖生物信息学被提出作为一种手段，可用于加强、构建或反驳关于特定背景下蛋白质糖组特异性的假设。

本实验方案的第一部分（第1节）展示了如何利用GlyConnect平台研究连接在人前列腺特异性抗原（PSA）Asn-69位点上的N-糖链的特异性或共有性。通过两种可视化工具（图4 和图5），重点分析了组织依赖性（尿液和精浆）以及异构体依赖性（正常pI和高pI）的糖链表达差异。
首先，GlyConnect Octopus 能够展示数据库中存储的实体之间的关联，从而提供了探索上下文信息的机会 通过 （1）在八达通中选择显示不同的实体，以及（2）点击链接查看相关条目。结果呈现出因组织而异的独特关联。
其次，GlyConnect Compozitor 最初被设计用于定义/优化糖肽鉴定的组分文件，现被用于评估两种已知 PSA 异构体（正常和高等电点）中的聚糖表达。对每种异构体糖组的比较生成了一个连接紧密的图谱，突出了四个节点（组分），其中两个为高 pI 异构体所特有。尽...

本方案介绍了如何利用在线资源探索、比较和解读人类蛋白质糖组。

Glyco@Expasy 项目启动时包含一系列相互关联的数据库和工具，涵盖糖生物学多个方面的知识。在……

生物信息学是利用计算机解决生物学问题的学科。糖生物学信息学则是利用计算机解决糖生物学领域问题的学科。通过糖生物学信息学，我们开发用于存储糖组学或糖蛋白质组学数据的数据库，这些数据库可供浏览或检索；同时我们还开发用于可视化和比较这些数据的分析工具。糖类在健康与疾病中的作用正日益受到重视，糖组学信息学也正致力于推动这一领域的发展。Catherine Hayes 接受过糖生物学领域的专业训练，目前担任数据科学家。Julien Mariethoz 接受过计算机科学领域的专业训练，负责协调数据库与工具的开发工作。访问网站 glycoproteome.expasy.org/glycomics-expasy，在左侧菜单中勾选糖蛋白（glycoproteins）选项。右侧的气泡图将自动聚焦于该类别对应的气泡，然后点击 GlyConnect 气泡，即可在新标签页中打开 GlyConnect 主页。选择蛋白质按钮，在蛋白质视图页面的搜索窗口中输入 prostate。点击对应于前列腺特异性抗原（PSA）常见同工型的编号 790。接着，在顶部的多色工具栏中，点击绿色的“source”按钮，以显示已发表数据所来源的样本类型。点击疾病按钮，查看数据库中的健康相关信息。然后点击结构按钮，查看糖组学数据中与PSA相关的全部135个结构。点击组成按钮，查看糖蛋白组学实验确定的78个相关组成。单击任意结构或组成以获取更多详细信息。为减少组成的歧义，可单击选定组成下方推荐的结构。每当单糖数目与列表中某一结构的数目一致时，系统将自动提供相应建议。要充分浏览蛋白质页面，请在页面右侧查看更多详细信息。前往 Octopus 主页以确认与 PSA 相连的多种聚糖中是否存在共同的结构特征，保持默认选中的 N-连接标签，切换到核心子标签，然后点击杂合型图标。接着转到性质子标签，选择唾液酸化图标，并点击绿色搜索按钮。在显示的关系图中，将鼠标悬停在 H6N4F1S1 上，可突出显示与三个结构中七种蛋白质的连接。相比之下，将鼠标悬停在 H6N4F2S1 上可突出显示 PSA 的两种同工型。将鼠标悬停在结构 ID 上可显示其 SNFG 表示形式，单击该 ID 可打开对应的页面。将中心节点更改为组织，然后将光标置于图中央的尿液或精液上，以查看不同的关联。将中心节点更改为疾病，将显示13个选项，其中之一为前列腺癌。唯一相关的蛋白是PSA。接下来，单击清除按钮以刷新搜索。转到属性子选项卡，然后单击双天线图标。接着转到决定子选项卡，选择3-唾液酸-LN二型图标，然后单击绿色搜索按钮。检查通过Octopus检索到的与含有末端3-唾液酸-LN二型基序的双天线聚糖的关联。将中心节点更改为组织以便于阅读，并将鼠标悬停在KLK3_human上，以直接连接精液与PSA常见亚型及七种结构。返回至蛋白质页面（本例中为PSA），以扫描该列表中每种组分之间的潜在关系。在 PSA 条目页面的右侧，点击 Compozitor 链接。确保 Compozitor 搜索字段中已预填入蛋白标签页中 ID 790 条目的详细信息。点击“添加到选择”按钮，以从数据库中检索数据。取消选择包含虚拟节点选项，然后点击计算图按钮，以显示一个由 78 种组分组成的连通良好的图谱，代表 PSA 的 N-糖组，以及一个显示糖链主要特征的柱状图。保持在主蛋白标签页，在蛋白字段中选择前列腺特异性抗原高等电点异构体。点击添加到选择按钮，以从数据库中检索出共计 57 种组分的数据。单击计算图按钮，生成两种同工型的叠加图，评估两种PSA同工型糖组的差异。访问网站 www.unilectin.eu 并单击 UniLectin3D 按钮。点击糖链搜索按钮，然后点击代表唾液酸的紫色菱形，系统将显示数据库中所有以唾液酸结尾的糖链结合基序。点击3-唾液酸-LN II型基序，系统将显示所有已知其三维结构可证实与3-唾液酸-LN II型发生相互作用的凝集素。按字段搜索选项。在物种字段中输入 Homo sapiens。点击“探索 X 射线结构”按钮以筛选原始列表。仅剩一个条目，即人源半乳糖凝集素-8。单击“查看3D结构和信息”按钮，以显示人源半乳糖凝集素-8与3-唾液酸-LN二型相互作用的详细信息。通过两种不同的查看器访问页面上展示的人源半乳糖凝集素-8的结构信息。使用LiteMol软件时，按住鼠标可旋转分子，并将配体移至前景。将鼠标悬停在左侧列出的相互作用上，以更新右侧视图，并使用 PLIP 软件定位该特定相互作用在结构中的位置。通过访问本页面上引用的文章，可直接从 GlyConnect 主页浏览 HGI 数据集。点击参考文献条目页面右侧的 Compozitor 链接，以评估该数据集的一致性。搜索字段将预先填入与工具高级选项卡中 DOI 编号相同的参考值。在 DOI 编号后输入 glycan_type=O-linked，以将搜索范围缩小至 O-连接聚糖。然后单击“添加到选择”按钮，以从数据库中检索数据。保持选中“包含虚拟节点”选项，然后点击“计算图”按钮以显示连接的组成结构图。进入 GlyConnect Compozitor 的蛋白质标签页，在蛋白质列表中选择 inter-alpha trypsin inhibitor heavy chain H4。确保物种默认选择为 Homo sapiens。取消选中聚糖类型中的 N-Linked。在位点列表中仅选择 THR 725，然后点击添加到选中按钮。接着点击图形计算按钮以显示相连组成成分的图谱。为理解虚拟节点，请点击图谱下方的导出按钮。仅选择“虚拟”并点击剪贴板图标，复制这八种组分。将所选内容粘贴至 Compozitor 自定义选项卡的查询窗口中。在组分字段中设置选择标签，在糖链类型字段中选择 O-连接，然后点击“添加到选择”按钮。最后，点击计算图按钮。GlyConnect Octopus 的此输出结果显示了蛋白质与聚糖之间依赖于组织的关联关系。该输出展示了所有携带杂合型和唾液酸化聚糖结构的人类蛋白质及其表达的组织。与尿液相关的部分被突出显示，展示了两种蛋白质——人绒毛膜促性腺激素（choriogonadotropin 或 GLHA human）和前列腺特异性抗原常见亚型（PSA common isoform 或 KLK3 human）——与分散的聚糖结构相连。类似地，与精液相关的部分被突出显示，展示了两种前列腺特异性抗原（PSA）蛋白亚型与成组的聚糖结构相连。这两种PSA亚型叠加的N-聚糖组结果展示在GlyConnect Compozitor的输出中。蓝色节点表示与常见亚型相关的聚糖，红色节点表示高磷亚型的聚糖。聚糖组之间的重叠部分以洋红色节点表示。节点内的数字代表根据GlyConnect数据库中关于PSA的内容，符合标注组成的聚糖结构数量。通过3-唾液酸化-LN二型末端表位，GlyConnect中展示的PSA糖组被证实与UniLectin3D中展示的半乳糖凝集素-8存在相关性。这为糖介导的蛋白质-蛋白质相互作用提供了可能但并非确定的机制场景。研究人员分析并比对了一组高质量的人血清O-糖链组成与GlyConnect数据库中的内容，从而提供了定制糖链组成文件的选项，以更精确地鉴定糖肽。它可以基于一个数据集中提供的最少20种组分，或通过GlyConnect中合理收集的23至26个组分加以完善，以增强该组分集合的一致性。从本方案中需要牢记的是，糖组不能仅限于一个项目列表；而恰恰借助糖组信息学工具，您能够展示这些项目之间的相互依赖关系，从而最终阐明其功能。

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生物学

聚糖介导的蛋白质相互作用研究的生物信息学资源

使用特异性糖苷酶从糖蛋白中去除糖链，随后进行SDS-PAGE，是检测蛋白质样品上聚糖修饰的一种有效方法，也是开展初步糖生物学研究的良好选择。去糖基化后的变化可通过凝胶电泳迁移率的改变或使用对聚糖敏感的染色试剂进行染色来检测。...

利用特异性内切和外切糖苷酶鉴定与表征蛋白质糖基化

本文介绍了一种改进的自下而上糖组学技术，该技术通过将未分级生物流体中的糖链化学降解为其具有连接特异性的单糖组分，并利用气相色谱-质谱法（GC-MS）进行检测，从而分析糖链的总体组成谱型。该方法的潜在应用包括癌症及其他糖链相关疾病的早期诊断。...

聚糖节点分析：糖组学的自下而上方法

唾液酸聚糖微阵列检测可用于评估人血清中的抗Neu5Gc抗体，因此有望成为一种用于癌症及其他慢性炎症介导的人类疾病的高通量诊断检测方法。...

利用唾液酸糖微阵列检测技术分析人血清中抗Neu5Gc IgG

本研究展示了印刷糖阵列（PGA）技术在分析小型动物体内循环抗碳水化合物抗体方面的潜力。...

打印型聚糖芯片：一种用于分析小型动物循环中抗碳水化合物抗体谱的灵敏技术

开放搜索能够鉴定出带有先前未知聚糖组成的糖肽。本文以Acinetobacter...

基于开放搜索策略在Acinetobacter baumannii O-连接糖肽鉴定中的应用

本文介绍了一种实验方案，详细阐述了用于表征溶液中蛋白质-聚糖相互作用的一系列核磁共振（NMR）实验的样品制备、数据采集、处理与分析方法。文中概述了目前常用的基于配体和基于蛋白质的研究方法，这些方法无疑将推动结构糖生物学和分子识别研究领域的发展。...

解析糖-蛋白质相互作用：核磁共振（NMR）大显身手

本方案详细介绍了糖组学指导的糖蛋白质组学方法，这是一种整合组学技术，可全面揭示复杂肿瘤微环境中异质性糖蛋白组的特征，有助于深入理解癌症的糖生物学。...

糖组学指导的糖蛋白质组学促进复杂肿瘤微环境中糖蛋白质组的全面分析

本基于核磁共振（NMR）的实验方案利用氰病毒素-N（cyanovirin-N）与D-甘露糖研究弱蛋白-聚糖相互作用。通过结合配体检测与蛋白检测方法，该方案可定位结合位点、检测变构效应并鉴定碰撞复合物。该方法概述了样品制备与数据分析流程，为聚糖特异性诊断及识别机制提供重要的结构与动态信息。...

探索蛋白质-聚糖相互作用：核磁共振技术的进展

利用操作性条件反射范式，通过播放随机点运动图和计算机生成的无脊椎动物视频来测试蜥蜴的视觉敏感性。...

测试蜥蜴对运动速度和方向的视觉敏感性

使用杰基龙作为模型生成的计算机模拟刺激。...

计算机生成的动物模型刺激材料

探索聚糖信息学方法，利用在线数据库和可视化工具分析人类蛋白质糖组数据。本方案演示如何通过GlyConnect和UniLectin3D等资源研究聚糖在健康与疾病中的作用机制。

用于研究聚糖介导的蛋白质相互作用的生物信息学资源

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