使用秀丽隐杆线虫中的自动包涵体计数监测体内蛋白质聚集动力学
2021年12月17日
这里，提出了一种分析线虫 秀丽隐杆线虫中蛋白质聚集动力学的方法。来自年龄同步种群的动物在不同的时间点成像，然后在CellProfiler中进行半自动内含物计数，并拟合AmyloFit中的数学模型。
到目前为止，蛋白质聚集的机制主要在体外进行了研究。使用我们的方案，我们可以在模式生物秀丽隐杆线虫中进行类似的定量研究。我们方法的主要优点是对夹杂物数量进行无偏量化。
通过将这些高质量数据拟合到数学模型中，我们可以深入了解聚合机制。蛋白质聚集发生在许多疾病中，包括阿尔茨海默氏症和亨廷顿舞蹈症。了解蛋白质在体内聚集的分子机制对于开发新疗法至关重要。
首先将10个成年线虫放在6厘米的染色NGM板上，用铂蚯蚓进行同步产卵。让成虫在20°C下产卵约两个小时，然后将其从盘子中取出。将装有卵的盘子放在20°C的孵化器中，监测动物的发育，直到它们在产卵后大约第三天成年。
通过用100L M9缓冲液填充所需数量的孔来制备384孔板，并补充25mM叠氮化钠作为麻醉剂。每个菌株填充一个孔以进行成像。对于每种菌株，使用铂蚯蚓将20只动物转移到一个孔中。
用盖子盖住板以防止蒸发，并在制备后一小时内对板进行成像。打开仪器，然后打开软件。单击"卸载孔板"旁边的"播放"按钮，然后将 384 孔板放入显微镜中。
在"操作列表和 3D 荧光采集"下，单击"测试"，然后选择包含蠕虫的孔。将"图像处理"设置为"无"。然后单击"播放"按钮，确定蠕虫正确居中的最佳移动距离。
将"上升距离"设置为 50 m，将"下降距离"设置为 50 m，将"切片间隔"设置为 2 m，以捕获 z 堆栈中动物的整个厚度。将"图像处理"设置回"最大值"。在孔板扫描设置下选择要成像的孔。
然后选择"平铺"并获取整个井。保存测量设置。然后点击开始测量以开始实验。
打开 CellProfiler 并将管道拖动到"将管道文件拖放到此处"窗口中。单击"是"加载项目。接下来，将拼接的图像拖到"将文件和文件夹拖放到此处"窗口中。
单击元数据输入模块。调整正则表达式以根据拼接图像的名称从文件名中提取。单击"名称和类型"输入模块，然后调整"选择规则条件"以匹配文件名中的通道。
然后，单击"输出设置"以选择一个文件夹以保存CellProfiler的输出。单击"启动测试模式"以使用第一个映像数据集检查管道的设置。单击"步骤"以一次运行一个模块，从而通过管道运行。
要调整蠕虫轮廓，请单击"编辑对象手动"模块中的"显示帮助"以查看说明。更正轮廓。然后单击"完成"以继续运行管道。
单击"退出测试模式"并分析图像。打开输出文件夹以查看输出文件。并打开带有原始文件名的图像，后跟轮廓，以检查蠕虫和内含物是否正确覆盖。
要开始使用AmyloFit，请命名项目，然后单击"创建项目"。单击"打开"将其打开。并通过为其命名并单击"创建并加载会话"来创建会话。
单击"添加数据"，然后按照左侧面板中显示的数据格式要求上传包含每只动物的平均内含物数量的文件。然后，单击"加载新数据"。将零点偏移的"平均点数"设置为 0，将"平稳点的平均值"设置为 0 以跳过包含计数数据不需要的预处理步骤。
然后，单击"提交"。对每种蛋白质浓度重复此步骤。在"模型"面板中选择"自定义"。
在"公式"框中输入独立成核的公式。然后单击加载模型。对于 Ncell，将参数类型设置为全局常量，并将 Value 设置为 95，对应于体壁肌肉细胞的数量。
将 Kcell 和 n 的参数类型设置为全局拟合。并给常数为m。在左侧面板中输入不同菌株的 m 值。
保持盆跃点数不变，然后单击"管接头"面板中的"适合"。最后，通过单击下载数据和拟合来提取拟合。在四种表达不同Q40浓度的秀丽隐杆线虫菌株中监测包涵体数量。
独立成核模型很好地描述了聚集动力学。在细胞内蛋白浓度为1 mM的情况下，拟合产生2.1的反应顺序，每个细胞每天的成核速率为0.38个分子。在之前的一项研究中，两个独立的生物重复显示了反应顺序和成核速率的紧密对应值。
应该记住的一件事是，您需要多个蛋白质浓度的高质量数据集才能获得可靠的拟合。这种方法可用于寻找干扰生物体中蛋白质聚集的方法，例如遗传敲低或小分子治疗。
概述
本文介绍了一种用于分析线虫秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）中蛋白质聚集动力学的方法。该方案通过成像和数学建模，实现对包涵体数量的无偏定量分析。
关键研究要素
科学领域
- 神经科学
- 生物学
- 蛋白质聚集
背景
- 蛋白质聚集与多种疾病相关，包括阿尔茨海默病和亨廷顿病。
- 以往的研究主要集中在体外方法上。
- 理解体内机制对于开发治疗方法至关重要。
- 秀丽隐杆线虫是此类研究的模式生物。
研究目的
- 建立一种在活体生物中研究蛋白质聚集的方法。
- 准确量化包涵体数量，并深入解析聚集机制。
- 促进治疗干预手段的探索。
使用的方法
- 在不同时间点对年龄同步的 C. elegans 进行成像。
- 使用 CellProfiler 进行包涵体计数。
- 利用 AmyloFit 将数据拟合到数学模型中。
- 实验条件包括特定的温度和缓冲液制备。
主要结果
- 独立成核模型能有效描述聚集动力学。
- 确定反应级数为2.1，成核速率为每细胞每天0.38个分子。
- 高质量的数据集对于可靠的拟合至关重要。
- 该方法可用于研究遗传或药理学干预。
结论
- 该方法为在体内研究蛋白质聚集提供了一个可靠的框架。
- 获得的见解可为相关疾病的治疗策略提供依据。
- 未来的研究可探索其他蛋白质浓度和条件。
常见问题
行业高管相关性
在体内定量蛋白质聚集动力学填补了神经退行性疾病研究中的一个关键空白，因为体外模型往往无法捕捉细胞的复杂性。该方法能够在遗传背景可控的生物体中实现对包涵体形成的无偏倚、时间分辨的测量，有助于靶点验证和机制层面的风险评估。通过将定量成像与数学建模相结合，该方法可在与疾病相关的系统中，为评估蛋白稳态调节剂及潜在治疗候选物提供可靠的预测依据。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：通过量化活体肌肉细胞中的聚集动力学，实现对治疗假设的验证。
- 操作价值：通过对不同遗传品系进行无偏倚的包涵体计数，支持生物学风险评估。
- 预测价值：将数据拟合到独立成核模型可阐明作用机制，并为靶点可信度提供依据。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：生成适用于检测标准化的定量、时间分辨包涵体计数。
- 操作价值：结合高通量成像与自动图像分析，实现可重复的结果输出。
- 可扩展性：采用384孔板格式，可用于筛选基因或药物调节因子。
转化与临床前研究
- 转化连续性：通过在线虫（C. elegans）中表达多聚谷氨酰胺（polyQ）模拟亨廷顿病等人类蛋白质聚集性疾病。
- 机制性风险排除：推导成核速率和反应级数，以区分不同的聚集机制。
- 基于风险评估的推进：量化干预措施对聚集动力学的影响，为是否继续推进研究提供决策依据。
流程与工作流整合
该方法适用于从早期发现到先导化合物鉴定的阶段，其中定量的聚集数据可为靶点选择和化合物筛选提供依据。
- 发现生物学：利用延时成像的包涵体数据，检验关于成核依赖性聚集的假设。
- 筛选：生成可用于化合物或基因文库评估的、即用型定量检测结果。
- 分析：采用数学拟合方法提取动力学参数（Kcell, n），以实现不同条件间的比较。
- 转化研究：使用与疾病相关的polyQ模型，将体内发现与人类病理学联系起来。
- 企业级复用：建立可重复使用的成像与分析工作流程，用于慢性蛋白质病变研究。
运营与企业影响
- 科学价值：通过将包涵体计数与聚集的生物物理模型关联，减少机制上的模糊性。
- 操作价值：通过自动化分析流程实现定量标准化，最大限度降低观察者间的变异。
- 战略价值：提供动力学而非仅终点的聚集数据，从而优化“进行/不进行”的决策。
- 项目影响：基于作用机制和调控潜力，实现对靶点的风险校正优先排序。
实施注意事项
- 需要具备共聚焦显微镜、图像分析（CellProfiler）和动力学建模（AmyloFit）方面的专业知识。
- 依赖能够对多孔板格式进行三维荧光z轴层扫的仪器设备。
- 需要在不同操作人员之间对线虫处理、染色和成像时间进行标准化。
- 若推广至其他组织或模型，可能需要调整图像分割和信号阈值参数。
- 如转录文本所述，可靠的模型拟合依赖高质量、多浓度的数据集。
生物制药常见问题
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:42
Growth of an Age-Synchronized Population of C. elegans
1:12
Sample Preparation of C. elegans in a Multiwell Plate
1:43
Image Acquisition on the High-Throughput Confocal Microscope
2:45
Automated Inclusion Counting Using CellProfiler
4:07
Global Fitting of Inclusion Count Data Using AmyloFit
5:39
Results: Fitting the Data to a Mathematical Model in AmyloFit
6:16
Conclusion
