使用秀丽隐杆线虫中的自动包涵体计数监测体内蛋白质聚集动力学

到目前为止，蛋白质聚集的机制主要在体外进行了研究。使用我们的方案，我们可以在模式生物秀丽隐杆线虫中进行类似的定量研究。我们方法的主要优点是对夹杂物数量进行无偏量化。

通过将这些高质量数据拟合到数学模型中，我们可以深入了解聚合机制。蛋白质聚集发生在许多疾病中，包括阿尔茨海默氏症和亨廷顿舞蹈症。了解蛋白质在体内聚集的分子机制对于开发新疗法至关重要。

首先将10个成年线虫放在6厘米的染色NGM板上，用铂蚯蚓进行同步产卵。让成虫在20°C下产卵约两个小时，然后将其从盘子中取出。将装有卵的盘子放在20°C的孵化器中，监测动物的发育，直到它们在产卵后大约第三天成年。

通过用100L M9缓冲液填充所需数量的孔来制备384孔板，并补充25mM叠氮化钠作为麻醉剂。每个菌株填充一个孔以进行成像。对于每种菌株，使用铂蚯蚓将20只动物转移到一个孔中。

用盖子盖住板以防止蒸发，并在制备后一小时内对板进行成像。打开仪器，然后打开软件。单击"卸载孔板"旁边的"播放"按钮，然后将 384 孔板放入显微镜中。

在"操作列表和 3D 荧光采集"下，单击"测试"，然后选择包含蠕虫的孔。将"图像处理"设置为"无"。然后单击"播放"按钮，确定蠕虫正确居中的最佳移动距离。

将"上升距离"设置为 50 m，将"下降距离"设置为 50 m，将"切片间隔"设置为 2 m，以捕获 z 堆栈中动物的整个厚度。将"图像处理"设置回"最大值"。在孔板扫描设置下选择要成像的孔。

然后选择"平铺"并获取整个井。保存测量设置。然后点击开始测量以开始实验。

打开 CellProfiler 并将管道拖动到"将管道文件拖放到此处"窗口中。单击"是"加载项目。接下来，将拼接的图像拖到"将文件和文件夹拖放到此处"窗口中。

单击元数据输入模块。调整正则表达式以根据拼接图像的名称从文件名中提取。单击"名称和类型"输入模块，然后调整"选择规则条件"以匹配文件名中的通道。

然后，单击"输出设置"以选择一个文件夹以保存CellProfiler的输出。单击"启动测试模式"以使用第一个映像数据集检查管道的设置。单击"步骤"以一次运行一个模块，从而通过管道运行。

要调整蠕虫轮廓，请单击"编辑对象手动"模块中的"显示帮助"以查看说明。更正轮廓。然后单击"完成"以继续运行管道。

单击"退出测试模式"并分析图像。打开输出文件夹以查看输出文件。并打开带有原始文件名的图像，后跟轮廓，以检查蠕虫和内含物是否正确覆盖。

要开始使用AmyloFit，请命名项目，然后单击"创建项目"。单击"打开"将其打开。并通过为其命名并单击"创建并加载会话"来创建会话。

单击"添加数据"，然后按照左侧面板中显示的数据格式要求上传包含每只动物的平均内含物数量的文件。然后，单击"加载新数据"。将零点偏移的"平均点数"设置为 0，将"平稳点的平均值"设置为 0 以跳过包含计数数据不需要的预处理步骤。

然后，单击"提交"。对每种蛋白质浓度重复此步骤。在"模型"面板中选择"自定义"。

在"公式"框中输入独立成核的公式。然后单击加载模型。对于 Ncell，将参数类型设置为全局常量，并将 Value 设置为 95，对应于体壁肌肉细胞的数量。

将 Kcell 和 n 的参数类型设置为全局拟合。并给常数为m。在左侧面板中输入不同菌株的 m 值。

保持盆跃点数不变，然后单击"管接头"面板中的"适合"。最后，通过单击下载数据和拟合来提取拟合。在四种表达不同Q40浓度的秀丽隐杆线虫菌株中监测包涵体数量。

独立成核模型很好地描述了聚集动力学。在细胞内蛋白浓度为1 mM的情况下，拟合产生2.1的反应顺序，每个细胞每天的成核速率为0.38个分子。在之前的一项研究中，两个独立的生物重复显示了反应顺序和成核速率的紧密对应值。

应该记住的一件事是，您需要多个蛋白质浓度的高质量数据集才能获得可靠的拟合。这种方法可用于寻找干扰生物体中蛋白质聚集的方法，例如遗传敲低或小分子治疗。