Name: 使用秀丽隐杆线虫中的自动包涵体计数监测体内蛋白质聚集动力学 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 49 s
Description: 了解如何使用CellProfiler和AmyloFit在秀丽隐杆线虫中进行自动包涵体计数，以定量分析体内蛋白质聚集动力学。该方法为研究神经退行性疾病提供了可靠的数学建模框架。

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感谢Morimoto实验室提供的 C. elegans 菌株，以及Esmeralda Bosman在高通量共聚焦显微镜使用上的协助。本研究由乌得勒支大学向T.S.提供的启动资金资助。

1. 秀丽隐杆线虫（C. elegans）同步化年龄种群的培养
<ol>
	<li>保持 秀丽隐杆线虫 在接种了菌株的线虫生长培养基（NGM）平板上 大肠杆菌 按照标准操作程序在20 °C培养OP5018.</li>
	<li>使用铂金线虫挑取工具，将10条成年线虫转移至一块6 cm涂有菌的NGM平板上，进行同步产卵。将成虫在20 °C条件下放置约2小时以产卵，随后移除成虫。根据菌株的繁殖力及所需采集的时间点数量，每种菌株准备1–4块平板。</li>
	<li>将含有卵的培养皿放入20 °C培养箱中。监测动物的发育过程，直至其达到成虫阶段。 
	注意：此处将动物达到成年期的那一天定义为第1天。通常，这相当于产卵后的第三天。</li>
	<li>从第1天开始，每天将线虫转移至新接种的NGM平板，以分离其子代。为补偿在转移过程中死亡或丢失的个体，每种品系按待成像时间点数量乘以约40只进行转移（见步骤2）。持续转移直至线虫停止产下受精卵（成虫期约第6天）。 
	&#8203;注意：排除出现成袋状或其他发育表型的动物。在表达易聚集蛋白的品系中，常可观察到成袋状现象。</li>
</ol>
2. 样品制备 秀丽隐杆线虫 在多孔板中
注意：由于成像过程需要使用最终会导致动物死亡的麻醉剂，因此同一动物无法用于后续时间点的检测。相反，应在不同时间点对同一批年龄同步化的不同动物进行成像。尽管大多数品系在第1天时包涵体较少，但仍建议将此时间点作为基线纳入实验。
<ol>
	<li>准备384孔板，将所需数量的孔中加入100 µL M9缓冲液，并添加25 mM NaN3作为麻醉剂。每种菌株对应一个孔。 
	注意：叠氮化钠（NaN3）具有毒性，操作时应小心谨慎。</li>
	<li>对于每种菌株，使用铂金线虫挑取工具将20只线虫转移至一个孔中。 
	&#8203;注意：在将线虫放入孔中之前，必须先将其放置在细菌菌苔之外。细菌会导致线虫黏附在挑取工具上，从而难以释放，并可能使孔内液体浑浊。通常，每孔20只为最佳数量，可在避免线虫相互重叠的同时，减少对空孔区域的不必要成像。</li>
	<li>用盖子盖好板子以防止蒸发，并在制备后1小时内完成成像。</li>
	<li>每天重复步骤2.1–2.3，直至包涵体数量达到稳定平台期，或直至大多数线虫死亡。每天应在同一时间进行样品制备和成像，以确保时间间隔为24小时。</li>
</ol>
3. 在高通量共聚焦显微镜上进行图像采集
注意：本实验也可在配备多孔板支架的常规转盘共聚焦显微镜上进行。使用具有较大视野的相机有助于减少成像时所需的拼接图像数量，从而覆盖整个孔。有关本实验方案所用显微镜和软件的详细信息，请参见材料表。
<ol>
	<li>打开仪器并启动软件。</li>
	<li>通过进入 Measurement Settings | New 创建新实验方案。选择正确的多孔板类型，然后点击 Create a New Measurement Setting。</li>
	<li>进入 Ch 1 设置荧光通道。将物镜设置为 10x。选择 488 nm 作为光源，BP525/25 作为发射滤光片以成像 YFP。将 binning 设置为 2x2 以减小文件大小。</li>
	<li>点击 Add Channel，并选择 Brightfield 作为成像方法。</li>
	<li>若要在测量中添加 z-stack 共聚焦荧光图像，请在 Action List 下选择 3D Fluorescence acquisition。进入 Select 并选择 Ch 1。为最小化文件大小，将 Image Processing 设置为 Maximum ，以便保存最大投影图像而非完整的 z-stack 数据。</li>
	<li>点击 BF/Ph Acquisition | Select | Ch 2 以设置明场通道。</li>
	<li>点击 Unload Well Plates 旁边的 play 按钮（寻找向右指向的三角形符号），然后将 384 孔板放入显微镜中。</li>
	<li>在 3D Fluorescence Acquisition 下，点击 Test 并选择一个含有线虫的孔，以确定使线虫正确居中的最佳位移距离。将 Ascending Distance 设置为 50 µm，Descending Distance 设置为 -50 µm，Slicing Interval 设置为 2 µm，以在 z-stack 中完整捕获动物的厚度。</li>
	<li>优化曝光时间，使所有四个菌株均获得良好的信号强度，同时避免信号饱和。对所有菌株和时间点使用相同的曝光时间。</li>
	<li>在 Well Plate Scan Setting 下选择需要成像的孔。选择 Tile 和 Acquire Whole Well。</li>
	<li>保存 Measurement Setting，然后点击 Start Measurement 开始实验。对于后续时间点，打开相同的测量设置，并调整位移距离及需要成像的孔。</li>
</ol>
4. 在 ImageJ 中拼接图块图像
注意：仅当使用大于 4x 的物镜时才需要执行此步骤，此时每个孔的图像将被采集为多个图块。在此分析流程中，图块的拼接使用免费软件 FIJI/ImageJ19 完成（图 2）。根据步骤 3 中所用仪器的不同，也可能可在配套软件中直接进行拼接。
<ol>
	<li>下载 FIJI20 并打开。</li>
	<li>进入 Plugins | Stitching | Grid/Collection Stitching21。</li>
	<li>在弹出窗口“Grid/Collection Stitching”中，根据图像瓦片的采集方式选择类型和顺序。选择Grid: row-by-row和Right &amp;#38; Down。</li>
	<li>在下一个窗口“Grid stitching: Grid: row-by-row, Right &amp;#38; Down”中，输入 x 和 y 方向上的瓦片数量。对于此处使用的 10x 物镜，将Grid size x设为2，Grid size y设为3，Tile overlap设为0。</li>
	<li>点击Browse，选择包含待拼接 TIFF 图像的文件夹。</li>
	<li>在File names for tiles下输入文件的通用名称，在每个文件名中瓦片编号的位置使用 {i}。</li>
	<li>取消勾选下方所有选项框。</li>
	<li>运行插件。</li>
	<li>将生成的图像保存为 TIFF 文件，用于下一步分析。</li>
</ol>
5. 使用 CellProfiler 进行自动包涵体计数22
<ol>
	<li>下载并安装开源图像分析软件 CellProfiler23。从 github.com/sinnigelab/aggregate-quantification 下载 InclusionCounting.cpproj 分析流程。</li>
	<li>打开 CellProfiler，将该流程文件拖入“Drop a pipeline file here”窗口，点击Yes以加载项目。</li>
	<li>点击Images输入模块，将拼接后的图像拖入“Drop files and folder here”窗口中。</li>
	<li>点击Metadata输入模块，根据拼接图像的文件名调整Regular expression to extract from file name（用于从文件名中提取信息的正则表达式）。</li>
	<li>点击NamesandTypes输入模块，调整Select the rule criteria（选择规则条件），以匹配文件名中的通道信息。 
	注：在该流程的默认设置中，文件名包含BF的被识别为明场图像，并命名为Worms；文件名包含YFP的被识别为荧光图像，并命名为Fluorescence。</li>
	<li>点击View output settings，选择一个默认文件夹以保存 CellProfiler 的输出结果。</li>
	<li>点击Start Test Mode，使用第一组成像数据集检查流程设置。点击Run可运行流程中的所有模块，或点击Step逐个模块运行。如需在EditObjectsManually模块中调整线虫轮廓，请点击Help查看操作说明，点击Done继续运行流程。 
	注：在&#160;测试模式下，提取的测量数据不会被导出。检测线虫和包涵体的阈值参数可能需要根据所用菌株和放大倍数进行调整。</li>
	<li>点击Exit Test Mode，然后点击Analyze Images开始分析图像。</li>
	<li>打开输出文件夹查看输出文件。打开文件名后附加outlines的图像，检查线虫和包涵体的轮廓叠加是否正确。 
	注：每条线虫的包涵体数量可在名为ExpandedWormObjects的文件中找到。有关输入图像的更多信息，请查看名为Image的文件。其他输出选项可在流程的ExportToSpreadsheet模块中进行设置。</li>
</ol>
6. 使用 AmyloFit 对包涵体计数数据进行全局拟合5
注意：此步骤仅在具备多个蛋白质浓度的数据时方可执行。对于 Q40-YFP，此前已构建了一组在体壁肌细胞中具有不同过表达水平的四个品系17。在其他情况下，应通过质粒显微注射和基因组整合方法构建新的品系24。
<ol>
	<li>前往用于聚集动力学分析的免费在线拟合平台 AmyloFit25. 注册或使用现有账户登录。 
	注意：有关如何使用 AmyloFit 的详细手册可供参考以获得额外帮助。登录后，请参见网页左上角的链接以获取更多信息。</li>
	<li>要开始使用 AmyloFit， 名称 项目并单击 创建项目. 通过点击打开项目 打开 并创建一个会话，方法是为其命名并点击 创建 &amp;#38; 加载会话.</li>
	<li>点击 添加数据 并上传包含每只动物包涵体平均数量的文件，文件格式需符合左侧面板所示的数据格式要求。点击 加载新数据.</li>
	<li>跳过预处理步骤，因为包含计数数据无需进行这些步骤，通过设置 用于零点偏移校正的平均点数 和 用于平台期平均的点数 到 0. 点击 提交对每种蛋白质浓度（即上传文件中的每一列）重复此步骤。</li>
	<li>选择 自定义 在模型面板中，输入 Ncells*(1-exp(-Kcell*m**(n)*(t-1))) 在方程框中并点击 加载模型. 
	注意：由于 AmyloFit 最初是为分析来自动力学数据而设计的 体外 检测，必须加载定制模型以分析包含计数数据 秀丽隐杆线虫 在本文所使用的方程中， N细胞 是形成包涵体的细胞数量， K细胞 是成核速率常数， m 细胞内蛋白质浓度，以及 n 成核反应级数</li>
	<li>将参数类型设置为 全球常数 用于 N细胞, 全局拟合 用于 K细胞 和 n，以及 常量 用于 m设置 价值 的 N细胞 到 95 用于体壁肌细胞 初始猜测 用于 K细胞&#160;和&#160;n 到 1. 输入以下数值 m 左侧图示不同菌株的结果。 
	注意：对于此处使用的相对简单的模型，初始猜测值并不重要。但对于更复杂的模型，输入预期值的估计值有助于缩短计算时间。</li>
	<li>保持盆地跳跃次数不变，然后单击 适配 在拟合面板中。</li>
	<li>单击提取拟合结果 下载数据并拟合. 
	注意：模型全局拟合所提取的参数将显示在右下角。数据与拟合结果的图表将自动在右上方面板中生成。可通过点击提取该图表 下载 pdf 并前往进行自定义 显示&#160;绘图&#160;选项. K细胞 分子数为单位&#160;浓度- n&#160;时间-1&#160;细胞-1. 用于比较具有不同数值的参数 n, K细胞 可通过将其乘以给定蛋白质浓度来转换为成核速率 mn.</li>
</ol>

<ol><li>Knowles, T. P. J., Vendruscolo, M., Dobson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+amyloid+state+and+its+association+with+protein+misfolding+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The amyloid state and its association with protein misfolding diseases.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 15 (6), 384-396 (2014).</li>
<li>Chiti, F., Dobson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+misfolding%2C+amyloid+formation%2C+and+human+disease%3A+a+summary+of+progress+over+the+last+decade%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Protein misfolding, amyloid formation, and human disease: a summary of progress over the last decade.</a> Annual Review of Biochemistry. 86 (1), 27-68 (2017).</li>
<li>Knowles, T. P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+analytical+solution+to+the+kinetics+of+breakable+filament+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An analytical solution to the kinetics of breakable filament assembly.</a> Science. 326 (5959), 1533-1537 (2009).</li>
<li>Cohen, S. I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation+of+amyloid-%CE%B242+aggregates+occurs+through+a+secondary+nucleation+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Proliferation of amyloid-β42 aggregates occurs through a secondary nucleation mechanism.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (24), 9758-9763 (2013).</li>
<li>Meisl, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+protein+aggregation+from+global+fitting+of+kinetic+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of protein aggregation from global fitting of kinetic models.</a> Nature Protocols. 11 (2), 252-272 (2016).</li>
<li>Satyal, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyglutamine+aggregates+alter+protein+folding+homeostasis+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Polyglutamine aggregates alter protein folding homeostasis in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (11), 5750-5755 (2000).</li>
<li>Morley, J. F., Brignull, H. R., Weyers, J. J., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+threshold+for+polyglutamine-expansion+protein+aggregation+and+cellular+toxicity+is+dynamic+and+influenced+by+aging+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The threshold for polyglutamine-expansion protein aggregation and cellular toxicity is dynamic and influenced by aging in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (16), 10417-10422 (2002).</li>
<li>Brignull, H. R., Moore, F. E., Tang, S. J., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyglutamine+proteins+at+the+pathogenic+threshold+display+neuron-specific+aggregation+in+a+pan-neuronal+Caenorhabditis+elegans+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Polyglutamine proteins at the pathogenic threshold display neuron-specific aggregation in a pan-neuronal Caenorhabditis elegans model.</a> Journal of Neuroscience. 26 (29), 7597-7606 (2006).</li>
<li>Moronetti Mazzeo, L. E., Dersh, D., Boccitto, M., Kalb, R. G., Lamitina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+and+aging+induce+distinct+polyQ+protein+aggregation+states%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Stress and aging induce distinct polyQ protein aggregation states.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (26), 10587-10592 (2012).</li>
<li>Prahlad, V., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+circuitry+regulates+the+response+of+Caenorhabditis+elegans+to+misfolded+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Neuronal circuitry regulates the response of Caenorhabditis elegans to misfolded proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (34), 14204-14209 (2011).</li>
<li>Nollen, E. A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+RNA+interference+screen+identifies+previously+undescribed+regulators+of+polyglutamine+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Genome-wide RNA interference screen identifies previously undescribed regulators of polyglutamine aggregation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (17), 6403-6408 (2004).</li>
<li>Silva, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+screening+strategy+identifies+novel+regulators+of+the+proteostasis+network%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">A genetic screening strategy identifies novel regulators of the proteostasis network.</a> PLoS Genetics. 7 (12), 1002438(2011).</li>
<li>Brehme, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chaperome+subnetwork+safeguards+proteostasis+in+aging+and+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A chaperome subnetwork safeguards proteostasis in aging and neurodegenerative disease.</a> Cell Reports. 9, 1-16 (2014).</li>
<li>Calamini, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule+proteostasis+regulators+for+protein+conformational+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Small-molecule proteostasis regulators for protein conformational diseases.</a> Nature Chemical Biology. 8 (2), 185-196 (2012).</li>
<li>Sinnige, T., Stroobants, K., Dobson, C. M., Vendruscolo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysical+studies+of+protein+misfolding+and+aggregation+in+in+vivo+models+of+Alzheimer%27s+and+Parkinson%27s+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Quarterly+Reviews+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Biophysical studies of protein misfolding and aggregation in in vivo models of Alzheimer's and Parkinson's diseases.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 49, 22(2020).</li>
<li>Mondal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+microfluidics+providing+high-resolution+and+high-throughput+screening+of+Caenorhabditis+elegans+poly-glutamine+aggregation+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Large-scale microfluidics providing high-resolution and high-throughput screening of Caenorhabditis elegans poly-glutamine aggregation model.</a> Nature Communications. 7, 13023(2016).</li>
<li>Sinnige, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+analysis+reveals+that+independent+nucleation+events+determine+the+progression+of+polyglutamine+aggregation+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Kinetic analysis reveals that independent nucleation events determine the progression of polyglutamine aggregation in C. elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (11), 202188118(2021).</li>
<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans.</a> Methods. 77 (1), 71-94 (1974).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>FIJI/ImageJ. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://imagej.net/downloads">https://imagej.net/downloads</a> (2012).</li>
<li>Preibisch, S., Saalfeld, S., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Globally+optimal+stitching+of+tiled+3D+microscopic+image+acquisitions%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions.</a> Bioinformatics. 25 (11), 1463-1465 (2009).</li>
<li>Lamprecht, M. R., Sabatini, D. M., Carpenter, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellProfiler%3A+free%2C+versatile+software+for+automated+biological+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">CellProfiler: free, versatile software for automated biological image analysis.</a> BioTechniques. 42 (1), 71-75 (2007).</li>
<li>CellProfiler. Broad Institute. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://cellprofiler.org/releases">https://cellprofiler.org/releases</a> (2021).</li>
<li>Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+in+C.+elegans%3A+extrachromosomal+maintenance+and+integration+of+transforming+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer in C. elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences.</a> EMBO Journal. 10 (12), 3959-3970 (1991).</li>
<li>Knowles group, University of Cambridge. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://amylofit.com/amylofitmain/login/">https://amylofit.com/amylofitmain/login/</a> (2021).</li>
<li>Lazaro-Pena, M. I., Cornwell, A. B., Samuelson, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+tissue-specific+proteostatic+decline+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Quantifying tissue-specific proteostatic decline in Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (175), (2021).</li>
<li>Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorodeoxyuridine+improves+Caenorhabditis+elegans+proteostasis+independent+of+reproduction+onset%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset.</a> PLoS One. 9 (1), 85964(2014).</li>
<li>Brunquell, J., Bowers, P., Westerheide, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorodeoxyuridine+enhances+the+heat+shock+response+and+decreases+polyglutamine+aggregation+in+an+HSF-1-dependent+manner+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Ageing+and+Development%22%5BJournal%5D)">Fluorodeoxyuridine enhances the heat shock response and decreases polyglutamine aggregation in an HSF-1-dependent manner in Caenorhabditis elegans.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 141-142, 1-4 (2014).</li>
<li>David, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+protein+aggregation+as+an+inherent+part+of+aging+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Widespread protein aggregation as an inherent part of aging in C. elegans.</a> PLoS Biology. 8 (8), 47-48 (2010).</li>
<li>Hunter, S., Maulik, M., Scerbak, C., Vayndorf, E., Taylor, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+sieve%3A+A+low-tech+instrument+and+methodology+for+sorting+small+multicellular+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis sieve: A low-tech instrument and methodology for sorting small multicellular organisms.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (137), (2018).</li>
<li>Burnett, K., Edsinger, E., Albrecht, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+gentle+hydrogel+encapsulation+of+living+organisms+enables+long-term+microscopy+over+multiple+hours%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">Rapid and gentle hydrogel encapsulation of living organisms enables long-term microscopy over multiple hours.</a> Communications Biology. 1, 73(2018).</li>
<li>Dong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+and+long-term+immobilization+in+a+hydrogel-microbead+matrix+for+high-resolution+imaging+of+Caenorhabditis+elegans+and+other+small+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Reversible and long-term immobilization in a hydrogel-microbead matrix for high-resolution imaging of Caenorhabditis elegans and other small organisms.</a> PLoS One. 13 (3), 0193989(2018).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

本文所述方法可实现对模式生物 C. elegans 中蛋白质聚集动力学的无偏倚且定量的分析。该方法依赖于四个关键要素（图1）：1）维持年龄同步的线虫群体；2）在多孔板中进行荧光显微镜成像；3）利用 CellProfiler 软件自动计数包涵体；4）在 AmyloFit 中进行数据拟合。与手动计数自由运动动物或静态图像中的包涵体相比26，CellProfiler 中的定量分析速度更快且更具无偏性。本实验方案的另一项重要改进在于获取动力学数据而非单一时间点数据，通过将数据拟合至数学模型，可对聚集机制提供定量层面的深入理解。
该方案的四个要素可作为独立模块使用，可根据具体应用进行修改。也可使用5-氟-2′-脱氧尿苷（FUDR）使动物不育，从而维持年龄同步的种群。该化合物会影响寿命和蛋白质稳态24,25，并对实验操作者具有高度致癌性；然而，使用FUDR可避免手动转移线虫，而在处理大量样本时，手动转移可能非常耗时。其他替代方法包括使用不育突变体29或过滤装置来分离后代30。
荧光显微镜步骤也可进行调整，例如使用更高倍数的放大来监测神经元中的蛋白质聚集。当不同实验条件之间的相对差异比包涵体的绝对数量更为重要时，宽场显微镜可能已足以用于监测肌肉细胞中的polyQ聚集。在此类情况下仍可使用CellProfiler分析流程，但用户需要调整识别线虫和包涵体&#160;的参数设置。该技术的通量目前受限于需手动将动物挑入384孔板。这一限制未来有望通过使用微流控装置加以解决16。叠氮化钠是一种相对强烈的麻醉剂，可被水凝胶或微珠进行物理固定所替代28,29。
本文中 AmyloFit 的分析基于一种聚集机制，即在单个细胞中发生独立的成核事件。如果该模型不适用，用户应考虑采用其他模型，例如先前开发的协同聚集模型17。该方法的一个局限性在于需要获得表达目标蛋白浓度不同的菌株，尽管这些菌株可通过常规的 C. elegans 方法获得24。
总之，该方案提供了获得蛋白质聚集动力学高质量数据的方法 体内 模型系统，可用于深入分析聚集机制17. 尽管该方法是在多聚谷氨酰胺（polyQ）聚集的背景下展示的 秀丽隐杆线虫 肌肉组织，该实验方案的未来应用可能包括其他蛋白质和组织，以及蛋白质稳态因子和小分子的影响。

错误折叠蛋白积聚形成不溶性沉积物的现象存在于多种疾病中。典型的例子包括阿尔茨海默病中的淀粉样蛋白-β和tau蛋白聚集、帕金森病中的α-突触核蛋白聚集，以及亨廷顿病中含扩展多聚谷氨酰胺（polyQ）的亨廷顿蛋白（huntingtin）的聚集。1,2这些多肽错误折叠形成淀粉样纤维的过程与毒性及细胞死亡相关，但其具体机制在很大程度上仍不清楚。阐明淀粉样纤维形成的机制对于开发有效的治疗策略至关重要，这将&#160;目前无法提供。
已对淀粉样蛋白的形成进行了详细研究 体外 基于硫黄素T荧光测量，从而揭示聚集过程的机制以及抑制性分子的作用效果3,4,5然而，目前尚不清楚相同的聚集机制是否在活细胞和生物体的复杂环境中同样成立。线虫 秀丽隐杆线虫 是研究蛋白质聚集的合适模式生物 体内其解剖结构相对简单，但包含多种组织，如肌肉、肠道和神经系统。该生物的遗传特征明确，且易于进行遗传改造。此外，其世代周期短，约为3天，总寿命为2-3周。因此，可在实验上较为便利的时间尺度内观察动物整个生命周期中的蛋白质聚集现象。最后，该线虫具有光学透明性，便于在活体动物中追踪荧光标记蛋白的聚集过程。
C. elegans 的这些特性此前已被用于研究 polyQ 蛋白的聚集，作为亨廷顿病及其他 polyQ 扩增疾病的模型。当谷氨酰胺残基数超过 35–40 的致病阈值时，与黄色荧光蛋白（YFP）标记的 polyQ 蛋白可在肌肉组织6,7、神经元8以及肠道9,10中观察到形成不溶性包涵体。这些特征已被广泛用于筛选影响蛋白聚集和毒性的基因11,12,13以及小分子调节剂14。
秀丽隐杆线虫 有望在弥合差距方面发挥重要作用 体外 蛋白质聚集研究以及小鼠等更复杂的疾病模型15. 秀丽隐杆线虫 适用于药物筛选16 但也可被用于深入理解蛋白质聚集的分子机制 体内，正如最近所展示的那样17然而，对于这两种应用而言，提取蛋白质聚集的定量且可重复的测量指标至关重要。在此，通过使用高通量共聚焦显微镜结合专用的图像分析流程来实现这一目标。图1).

<table><tbody><tr><td>384孔板</td><td>格雷纳</td><td>781091</td><td>黑色，平底透明</td></tr><tr><td>AmyloFit</td><td>诺尔斯实验室</td><td>v2.0</td><td>访问地址：www.amylofit.ch.cam.ac.uk</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;秀丽隐杆线虫&lt;/em&gt; Q40 品系 A</td><td>Morimoto 实验室</td><td>AM1228</td><td>基因型 &lt;em&gt;rmIs404[unc-54p::Q40::YFP]&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;秀丽隐杆线虫&lt;/em&gt; Q40 品系 B</td><td>Morimoto 实验室</td><td>AM1229</td><td>基因型 &lt;em&gt;rmIs404[unc-54p::Q40::YFP]&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;秀丽隐杆线虫&lt;/em&gt; Q40 品系 C</td><td>Morimoto 实验室</td><td>AM1230</td><td>基因型 &lt;em&gt;rmIs404[unc-54p::Q40::YFP]&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;秀丽隐杆线虫&lt;/em&gt; Q40 品系 D</td><td>Morimoto 实验室</td><td>AM1231</td><td>基因型 &lt;em&gt;rmIs404[unc-54p::Q40::YFP]&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>CellProfiler</td><td>布罗德研究所</td><td>4.1.3</td><td>下载自 https://cellprofiler.org</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; OP50</td><td>秀丽隐杆线虫遗传学中心（Caenorhabditis Genetics Center, CGC）</td><td>OP50</td><td></td></tr><tr><td>FIJI</td><td>开源</td><td>（斐济就是）ImageJ v2.1/1.5.3j</td><td>下载自 https://imagej.net/software/fiji/</td></tr><tr><td>高通量共聚焦显微镜</td><td>Yokogawa</td><td>CellVoyager CV7000S</td><td></td></tr><tr><td>M9 缓冲液</td><td>自制</td><td></td><td>3 g/L KH₂PO₄&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;，6 g/L Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;，0.5 g/L NaCl，1 mM MgSO₄&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>NGM 平板</td><td>自制</td><td></td><td>&amp;nbsp;17 g/L 琼脂，2.5 g/L 胰蛋白胨，3 g/L NaCl，25 mM KPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 缓冲液 pH 6.0，1 mM MgSO₄&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;，1 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;，5 mg/L 胆固醇</td></tr><tr><td>巴斯德吸管</td><td>WU Mainz</td><td>250</td><td>制作线虫挑针，长度为150 mm</td></tr><tr><td>铂铱合金丝</td><td>Alfa Aesar</td><td>39383</td><td>制作线虫挑针，直径为0.25 mm</td></tr><tr><td>叠氮化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Leica</td><td>S9</td><td></td></tr></tbody></table>

监测蛋白质聚集动力学 在体 内 使用自动包涵体计数在 秀丽隐杆线虫

Monitoring Protein Aggregation Kinetics In Vivo using Automated Inclusion Counting in Caenorhabditis elegans

蛋白质聚集形成不溶性包涵体是多种人类疾病的特征，其中许多疾病与年龄相关。线虫Caenorhabditis elegans是一种公认的研究蛋白聚集及其毒性的模式生物。其透明的身体使得通过荧光显微镜直接观察蛋白质聚集成为可能。此外，该线虫繁殖周期短、寿命短暂，是筛选调控这一过程的基因和分子的合适模型。
然而，在活体动物中对聚集体负荷的定量缺乏标准化，通常是在单个时间点通过荧光解剖显微镜下人工计数包涵体来完成。该方法在不同观察者之间可能导致较高的变异性，并限制了对聚集过程的理解。相比之下，类淀粉样蛋白聚集 体外 通过硫磺素T荧光以高度定量且时间分辨的方式进行常规监测。
本文介绍了一种类似的方法，用于在活体 C. elegans 中无偏倚地分析聚集动力学，该方法结合了高通量共聚焦显微镜、定制的图像分析及数据拟合技术。通过监测体壁肌细胞中荧光标记的多聚谷氨酰胺（polyQ）蛋白包涵体的形成，验证了该方法的适用性。图像分析流程可确定不同时间点包涵体的数量，并将其拟合至一个基于单个肌细胞中独立成核事件的数学模型。本文所述方法有望以稳健且定量的方式，在活体动物中评估蛋白稳态调控因子及潜在治疗手段对蛋白聚集性疾病的影响。

此处所述的方法（图1用于分析由40个谷氨酰胺与黄色荧光蛋白融合构成的蛋白（Q40-YFP）的聚集动力学。该蛋白在以下调控下表达： unc-54 启动子，在体壁肌细胞中驱动表达。由于这些细胞相对较大且易于观察，使用10倍物镜即可清晰分辨该组织中由Q40-YFP形成的包涵体。此前已构建四种品系（A-D株系），其蛋白表达水平各不相同，用于评估多聚谷氨酰胺（polyQ）聚集对浓度的依赖性。 体内17.
通过2小时产卵获得A-D品系的年龄同步化种群，后代成虫后每日转移一次。从成虫期第1天至第10天，使用高通量共聚焦显微镜对每种品系各20只动物在384孔板中进行成像。每个孔的图像采集为6个图块，并利用ImageJ插件将图块拼接成完整图像。21 (图2）。拼接的图像随后使用定制的 CellProfiler 进行分析22 管道图3) 以量化每种菌株在每个时间点每只动物的平均包涵体数量。
随后将数据拟合到 AmyloFit 中的数学模型5（图4）。该模型基于以下假设：95个体壁肌细胞各自独立地通过一个限速的成核事件获得一个包涵体，随后发生快速聚集体生长17。拟合结果得到成核速率常数为 9.9 × 105 分子 M-2.1 d-1 细胞-1，反应级数为 2.1，在细胞内蛋白浓度为 1 mM 时对应的成核速率为 0.38 分子 d-1 细胞-1。两次独立的生物学重复实验获得了相近的成核速率和反应级数，结果与先前使用类似方案的研究一致17（表1）。
<img alt="年龄同步化生长过程，包含图像采集、包涵体计数、数据拟合；示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63365/63365fig01v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 1"> 
图 1：方法的示意图概述。 （A）通过定时产卵获得年龄同步化的 C. elegans 种群。（B）来自同一种群的线虫在384孔板中于不同时间点进行成像。（C）将多个图像拼接形成完整孔的图像，并使用CellProfiler分析每条线虫的包涵体数量。（D）利用AmyloFit将数据拟合到数学模型中。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63365/63365fig01largev2.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="网格拼接设置；ImageJ 软件插件设置，示意图，右下网格配置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63365/63365fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2：使用插件 Grid/Collection stitching21 在 ImageJ 中进行拼接操作的截图。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63365/63365fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="明场与YFP图示，展示图像分析过程中的原始数据与目标物识别。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63365/63365fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3细胞内包涵体数量定量的 CellProfiler 分析流程示意图。 (A-C) 明场图像（A) 用于鉴定蠕虫（B，特写镜头在 C). (D-G) 荧光图像（D，特写镜头 E) 用于鉴定包涵体（F）。线虫及其包涵体相关联，用于提供每个孔中每条线虫的包涵体数量（G所示图像为成年第3天的Q40品系A动物。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63365/63365fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="AmyloFit 工作流程：数据上传、加载含方程的模型、参数拟合、结果图表。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63365/63365fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 4"> 
图 4：在 AmyloFit 中将数据拟合到数学模型。（A）将数据上传至 AmyloFit。（B）输入自定义方程以模拟包涵体形成过程，假设每个细胞中发生独立的成核事件。（C）对表达不同水平 Q40-YFP 的 C. elegans 菌株 A-D 的聚集动力学进行拟合。数据代表两次独立的生物学重复实验。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63365/63365fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>数据集 1</td>
			<td>数据集 2</td>
			<td>Sinnige 等17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n</td>
			<td>2.1</td>
			<td>1.9</td>
			<td>1.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kcell (molecules M-n d-1 cell-1)</td>
			<td>9.9 x 105</td>
			<td>1.4 x 105</td>
			<td>3.1 x 104</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mM 时的成核速率 (molecules d-1 cell-1)</td>
			<td>0.38</td>
			<td>0.21</td>
			<td>0.35</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：Q40-YFP 聚集的成核速率与反应级数的数值。 本方案两次独立生物学重复实验的数据，以及与先前发表数据的比较17。

本文介绍了一种用于分析线虫Caenorhabditis elegans中蛋白质聚集动力学的方法。对年龄同步化的线虫群体在不同时间点进行成像，随后在CellProfiler中进行半自动包涵体计数，并利用AmyloFit软件拟合数学模型。

蛋白质聚集形成不溶性包涵体是多种人类疾病的特征，其中许多疾病与年龄相关。线虫秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis ...）

到目前为止，蛋白质聚集的机制主要在体外进行研究。通过我们的实验方案，可以在模式生物秀丽隐杆线虫（C.elegans）中开展类似的定量研究。本方法的主要优势在于能够无偏倚地定量包涵体数量。通过将这些高质量数据拟合到数学模型中，我们可以深入了解聚集机制。蛋白质聚集发生在多种疾病中，包括阿尔茨海默病和亨廷顿病。理解体内蛋白质聚集的分子机制对于开发新的治疗方法至关重要。首先，使用铂金线虫挑取工具将10条成年线虫转移至一个6 cm涂有菌的NGM平板上，以进行同步产卵。让成虫在20°C下产卵约两小时，随后将其从平板上移除。将含有卵的平板置于20°C培养箱中孵育。持续观察线虫的发育情况，直至其在产卵后约第三天发育至成虫阶段。通过在所需数量的孔中加入 100 µL M9 缓冲液（补充 25 mM 叠氮化钠作为麻醉剂）来准备 384 孔板。每种菌株各使用一个孔进行成像。对于每种菌株，使用铂金线虫挑取器将 20 条动物转移至一个孔中。用盖子盖住培养板以防止蒸发，并在制备后一小时内对培养板进行成像。打开仪器并启动软件。点击“卸载培养板”旁边的播放按钮，将384孔板放入显微镜中。在“操作列表”和“3D荧光采集”下，点击“测试”，并选择含有线虫的孔。将图像处理设置为“无”，然后点击“播放”按钮，以确定使线虫正确居中的最佳位移距离。将Z轴堆栈的上升距离设为50 m，下降距离设为50 m，切片间隔设为2 m，以捕获动物整体厚度。将图像处理设置恢复为最大值。在孔板扫描设置下选择需要成像的孔。然后选择“平铺”并采集整孔图像。保存测量设置，点击“开始测量”以启动实验。打开 CellProfiler，将流程文件拖入“在此处放置流程文件”窗口。单击“是”以加载项目。接下来，将拼接好的图像拖入“在此处放置文件和文件夹”窗口。单击“元数据输入”模块。根据拼接图像的文件名调整正则表达式，以从文件名中提取信息。单击“名称和类型”输入模块，并调整“选择规则条件”，使其与文件名中的通道匹配。然后，单击输出设置以选择用于保存 CellProfiler 输出结果的文件夹。单击启动测试模式，使用第一组成像数据集来检查流程的设置。单击逐步运行，一次运行一个模块，逐步执行整个流程。要调整线虫轮廓，请在 EditObjectsManually 模块中点击“显示帮助”以查看说明。修正轮廓后，点击“完成”以继续运行流程。单击“退出测试模式并分析图像”。打开输出文件夹以查看输出文件。然后打开图像文件，文件名为原始文件名后跟“outlines”（轮廓），以检查线虫和包涵体是否被正确叠加。要开始使用 AmyloFit，请为项目命名，然后点击“创建项目”。点击“打开”以启动项目。通过输入会话名称并点击“创建并加载会话”来创建一个会话。单击“添加数据”，然后按照左侧面板中显示的数据格式要求，上传包含每只动物包涵体平均数量的文件。接着，单击“加载新数据”。将“用于零点偏移的平均点数”设置为 0，并将“用于平台期的平均点数”设置为 0，以跳过预处理步骤，因为包涵体计数数据无需这些步骤。然后，点击提交。对每种蛋白质浓度重复此步骤。在模型面板中选择自定义。在“方程”框中输入独立成核的方程，然后点击“加载模型”。对于 Ncells，将参数类型设置为全局常数，并将数值设为 95，对应于体壁肌细胞的数量。将 Kcell 和 n 的参数类型设置为“全局拟合”，将 m 的参数类型设置为“常数”。在左侧面板中输入不同菌株的 m 值。保持盆地跳跃次数不变，点击“拟合”面板中的“拟合”按钮。最后，通过点击“下载数据和拟合结果”来提取拟合结果。通过表达不同Q40浓度的四种秀丽隐杆线虫（C. elegans）品系监测了包涵体数量。独立成核模型能够很好地描述聚集动力学。拟合结果得到反应级数为2.1，核化速率为每细胞每天0.38个分子，对应胞内蛋白浓度为1 mM。先前研究中的两次独立生物学重复实验显示出与反应级数和核化速率高度一致的数值。需要注意的一点是，为了获得可靠的拟合结果，必须使用多种蛋白质浓度下的高质量数据集。该方法可用于寻找干扰生物体内蛋白质聚集的途径，例如基因敲低或小分子处理。

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