Name: 原发性恶性胸膜间皮瘤肿瘤系的生成和扩展 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-21T12:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: 学习从手术切除的恶性胸膜间皮瘤组织中分离、富集和扩增原代肿瘤细胞系的标准化方法。该技术可减少成纤维细胞污染，为研究肿瘤免疫功能及基因组状态提供可靠的体外模型系统。

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我们感谢 Raquel Laza-Briviesca 对本实验方案的初步建立所做出的贡献，感谢 Boris Sepesi 博士、Reza Mehran 博士和 David Rice 博士在组织样本收集方面的合作。本研究未获得额外的资金支持。

本文所述所有方法均已获得德克萨斯大学MD安德森癌症中心机构审查委员会（IRB）的批准。这涉及在获得知情同意后，通过标准临床护理手术切除的恶性胸膜间皮瘤（MPM）肿瘤样本。
1. 肿瘤消化培养基及其他相关培养基的制备
<ol>
	<li>在超净工作台中，向500 mL无菌RPMI 1640培养基中加入5 mL 100%青霉素/链霉素（Pen/Strep），以配制肿瘤消化液。
	<ol>
		<li>将培养基转移至500 mL、0.22 µm聚醚砜（PES）无菌滤器中进行真空过滤。 
		注意：过滤和抽吸步骤应使用75–150 torr的标准真空压力进行。</li>
		<li>标记并注明肿瘤消化液的配制日期，于4 °C保存。 
		注意：该培养基可在4 °C保存1个月。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在超净工作台中，于50 mL锥形管内，向16.5 mL消化液中加入2.5 mL 3% I型胶原酶、1 mL 1.5 mg/mL透明质酸酶和20 µL 250,000 单位/mL DNA酶1，以配制用于肿瘤消化的酶混合液。 
	注意：肿瘤消化用酶混合液总体积为20 mL；但每份肿瘤样本仅需10 mL。因此，剩余的酶混合液可于-20 °C保存以备后续使用。切勿反复冻融分装液。</li>
	<li>在超净工作台中，向500 mL无菌RPMI 1640培养基中加入5 mL 100%青霉素/链霉素和50 mL胎牛血清（FBS），以配制完全肿瘤培养基。
	<ol>
		<li>将培养基转移至500 mL、0.22 µm PES无菌滤器中进行真空过滤。</li>
		<li>标记并注明完全肿瘤培养基的配制日期，于4 °C保存。 
		注意：该培养基可在4 °C保存1个月。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在超净工作台中，向500 mL无菌RPMI 1640培养基中加入5 mL 100%青霉素/链霉素和5 mL胎牛血清（FBS），以配制低血清培养基用于饥饿处理。
	<ol>
		<li>将培养基转移至500 mL、0.22 µm PES无菌滤器中进行真空过滤。</li>
		<li>标记并注明低血清培养基的配制日期，于4 °C保存。 
		注意：该培养基可在4 °C保存1个月。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在超净工作台中，向45 mL胎牛血清（FBS）中加入5 mL二甲基亚砜（DMSO），以配制冻存液。
	<ol>
		<li>将冻存液转移至50 mL、0.22 µm PES无菌滤器中进行真空过滤。</li>
		<li>标记并注明五个15 mL锥形管。</li>
		<li>将10 mL冻存液分装至每个管中，并于-20 °C保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在超净工作台中，向500 mL无菌RPMI 1640培养基中加入50 mL胎牛血清（FBS），以配制无抗生素培养基用于支原体检测。
	<ol>
		<li>将培养基转移至50 mL、0.22 µm PES无菌滤器中进行真空过滤。</li>
		<li>标记并注明无抗生素培养基的配制日期，于4 °C保存。 
		注意：该培养基可在4 °C保存1个月。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在超净工作台中，向500 mL无菌1×磷酸盐缓冲液（PBS）中加入16.6 mL无菌牛血清白蛋白，以配制用于表型分析的荧光激活细胞分选（FACS）缓冲液。
	<ol>
		<li>标记并注明FACS缓冲液的配制日期，于4 °C保存。 
		&#8203;注意：只要两种组分均保持无菌储存，FACS缓冲液无需过滤除菌。FACS缓冲液在未开封前可在4 °C保存6个月。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 肿瘤组织的消化
<ol>
	<li>从步骤 1.2 中取出 10 mL 肿瘤消化酶混合液，转移至解离管中。</li>
	<li>使用无菌手术刀将肿瘤组织块转移至无菌的 6 孔板盖中。 
	注意：随肿瘤组织转移的培养基量已足够用于后续处理。
	<ol>
		<li>使用新的无菌手术刀和镊子去除所有脂肪组织、坏死组织和/或血凝块。 
		注意：脂肪组织通常呈淡黄色，质地为半固体；坏死组织颜色较周围组织更深，质地非常柔软；脂肪组织和坏死组织均容易碎裂。出血性组织呈鲜红色，操作时可能向培养基中释放血液。去除后，剩余的肿瘤组织应保持一定形状，颜色为浅色或粉红色，具体取决于组织类型。</li>
		<li>将整个肿瘤组织切成 1 mm3 大小的碎片。为防止组织干燥，向肿瘤组织中加入 500 µL 无菌 1× Hank's 平衡盐溶液（HBSS）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将肿瘤碎片转移至含有 10 mL 肿瘤消化酶混合液的解离管中（步骤 2.1）。拧紧管盖，将管子倒置（管盖朝下）放置于组织解离仪上，并将加热装置像套筒一样套在解离管外，按压使其卡紧到位。 
	注意：每根管子的最大容量为 4 g 肿瘤组织和 10 mL 液体体积。</li>
	<li>在解离仪上选择预设程序 37C_h_TDK_1。运行 10 分钟后检查状态，确保未出现红色指示灯闪烁提示的堵塞错误。 
	注意：该程序在 37 °C 下以 1,865 rpm 转速运行 1 小时。 
	&#8203;注意：若发生堵塞，请取下解离管，手动轻轻旋转混匀，以松动卡在管盖中的组织，然后将管子重新放回解离仪并继续运行程序。</li>
	<li>完成 1 小时的消化后，取出解离管并置于超净工作台中。将 70 µm 细胞滤网置于 50 mL 锥形管上，使用 10 mL 移液器将消化后的肿瘤悬液转移至滤网上进行过滤。若滤网堵塞，则更换新的滤网。
	<ol>
		<li>用 10 mL 新鲜肿瘤消化培养基冲洗解离管，并将冲洗液通过滤网过滤。</li>
		<li>取下 70 µm 滤网并弃去。</li>
		<li>用肿瘤消化培养基将总体积补至 40 mL。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在室温下以 500 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>使用连接真空源的 2 mL 吸管，小心吸除上清液，避免扰动沉淀，然后用 10 mL 无菌完全肿瘤培养基重悬细胞。</li>
	<li>重复步骤 2.6。</li>
	<li>按照步骤 2.7 所述方法吸除上清液，将细胞重悬于 3 mL 无菌完全肿瘤培养基中，并将细胞悬液转移至无菌 6 孔板的一个孔中。</li>
	<li>将 6 孔板置于 37 °C、5% CO2 的培养箱中培养。</li>
	<li>24 小时后，将第 1 孔中已使用的培养基转移至同一 6 孔板中的新孔（第 2 孔），并向第 1 孔中加入 3 mL 无菌完全肿瘤培养基。</li>
	<li>在步骤 2.11 之后 24 小时，将第 1 孔和第 2 孔中已使用的培养基合并转移至同一 6 孔板的第 3 孔中，并向第 1 孔和第 2 孔各加入 3 mL 无菌完全肿瘤培养基。</li>
	<li>在步骤 2.12 之后 48 小时，吸除全部 3 个孔中的培养基，并向每个孔中加入 3 mL 完全肿瘤培养基。</li>
</ol>
3. 原代肿瘤细胞系的建立
<ol>
	<li>使用倒置相差显微镜，确定早期传代培养物中成纤维细胞污染的比例。 
	注意：成纤维细胞通常细长且不规则，细胞膜边界不清，在Z轴上呈现较薄或扁平的形态。
	<ol>
		<li>如果早期传代培养物中成纤维细胞污染比例超过20%，则更换为低血清培养基后继续培养。</li>
		<li>每周两次重复步骤3.1.1中的低血清培养基更换操作，持续3至4周。</li>
		<li>当培养物达到80%汇合度时，以1:1比例将细胞传代至6孔板中的两个新孔中。此后每次细胞达到80%汇合度时，均在低血清培养基中以1:1比例进行传代。</li>
		<li>重复步骤3.1.3，最多持续4周，根据需要以1:1比例将细胞传代至更大的培养瓶中，每次在培养物达到80%汇合度时进行。如果成纤维细胞比例未能降至10%或以下，则进入步骤3.2，尝试采用差速胰酶消化法去除成纤维细胞污染；否则，进入步骤3.3。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为富集肿瘤细胞，用1× PBS轻轻冲洗孔板，去除含血清的培养基。
	<ol>
		<li>加入胰酶：6孔板每孔1 mL，T25培养瓶2 mL，T75培养瓶3 mL。</li>
		<li>将6孔板或培养瓶置于37 °C培养箱中孵育1分钟。取出后使用倒置显微镜观察细胞贴壁情况。若细胞部分脱落或漂浮，轻柔地仅收集悬浮细胞和胰酶，将细胞转移至含有等量或更多体积的完全肿瘤培养基的15 mL锥形管中。 
		注意：基于细胞贴附特性的部分收集是多个分步收集中的第一步。</li>
		<li>重复步骤3.2.1和3.2.2，直至所有细胞均脱落，或已收集4个组分。</li>
		<li>将所有独立组分在室温下以500 × g离心5分钟。</li>
		<li>如步骤2.7所述吸除上清液，并用5 mL无菌低血清培养基重悬细胞。</li>
		<li>将每个组分的细胞分别接种至T25培养瓶中，并将培养瓶置于37 °C培养箱中培养。</li>
		<li>48小时后评估各培养物，确定哪个组分富含肿瘤细胞而哪个富含成纤维细胞。弃去富含成纤维细胞的培养瓶。若成纤维细胞污染率&#60;10%，则在完全肿瘤培养基中继续扩增，并进入步骤4；若成纤维细胞污染率为10%-30%，则重复步骤3.1.2-3.1.4；若成纤维细胞污染率大于30%，则重复步骤3.2-3.2.7。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>若在早期传代培养物中检测到极少或无成纤维细胞，则当细胞在6孔板或培养瓶中达到80%汇合度时，以1:1比例在完全肿瘤培养基中继续传代培养。</li>
</ol>
4. 初代肿瘤细胞系的扩增
<ol>
	<li>当原代肿瘤培养物中成纤维细胞污染比例降至10%或以下时，吸除培养基，并每周两次更换为无菌的完全肿瘤培养基。 
	注意：T25培养瓶的最佳培养基体积为5 mL；T75为12 mL；T150为25 mL。
	<ol>
		<li>当培养物在培养板或培养瓶中达到80%融合度时，根据需要以1:1比例传代至更大的培养瓶中。 
		注意：根据细胞生长情况，可能需要采用更高的传代比例。调整传代比例，使培养物每3–5天达到80%融合度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>持续传代至培养物代数达到第4代或以上。当培养物在至少两个T75培养瓶中均达到80%融合度时，进入步骤5。</li>
</ol>
5. 已建立的原代肿瘤细胞系的表征与保种
<ol>
	<li>将一个T75培养瓶进行早期传代冻存。对于其余T75培养瓶的支原体检测，继续进行步骤5.2。
	<ol>
		<li>对于早期传代细胞的冻存，解冻步骤1.5中预先分装好的冻存液1管。</li>
		<li>通过胰蛋白酶消化收集细胞：首先按照步骤3.2所述用1×PBS洗涤培养板，然后按照步骤3.2.1所述加入胰蛋白酶。</li>
		<li>将培养瓶置于37 °C培养箱中孵育3分钟。取出培养瓶，在倒置显微镜下观察细胞贴壁情况。若细胞开始脱落或漂浮，轻柔地移除悬浮细胞和胰蛋白酶，并将细胞转移至含有等体积或更大体积完全肿瘤培养基的15 mL锥形管中。 
		注：若细胞在3分钟后仍保持贴壁，将培养瓶放回培养箱继续孵育2分钟。</li>
		<li>轻轻吹打混匀管内细胞，取20 µL用于计数。</li>
		<li>在室温下以500 × g离心5分钟。</li>
		<li>在细胞离心过程中，使用实验室特定的计数方法（如台盼蓝或吖啶橙/碘化丙啶（AO/PI））进行细胞计数。</li>
		<li>离心后，将细胞重悬于冻存液中，密度至少为2 × 106个细胞/1 mL冻存液。</li>
		<li>将步骤5.1.7中得到的细胞悬液1 mL转移至预先标记的1.5 mL冻存管中。</li>
		<li>将冻存管放入程序降温盒中，并立即转移至-80 °C保存。</li>
		<li>细胞可在-80 °C保存最多1周，之后转移至液氮中进行长期保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将一个T75培养瓶按1:1比例分装用于支原体检测。更换为步骤1.6中制备的无抗生素培养基。
	<ol>
		<li>72小时后，将支原体检测试剂、底物及对照品在室温下解冻15分钟，然后进行检测。</li>
		<li>从每种待测培养物中收集1 mL上清液，置于15 mL锥形管中。</li>
		<li>在室温下以500 × g离心5分钟，沉淀任何悬浮细胞。</li>
		<li>将100 µL样本上清液和对照品加入白色96孔板中。向每个样本和对照孔中加入100 µL支原体检测试剂。</li>
		<li>在室温下孵育5分钟。</li>
		<li>将96孔板放入酶标仪中读取发光值（读数A，即第一次读数）。 
		注：支原体检测试剂盒生产商的操作说明建议多功能酶标仪使用默认设置。检测模式设为终点发光检测，积分时间为1秒，增益为135。酶标仪使用自动增益调节程序以优化每次实验的信号增益。1秒积分时间为标准默认设置。这两个参数用于调节酶标仪对发光信号强度的解读，可能需要根据具体仪器进行调整。</li>
		<li>从酶标仪中取出96孔板，向每个样本和对照孔中加入100 µL支原体检测底物。</li>
		<li>在室温下孵育10分钟。</li>
		<li>将96孔板再次放入酶标仪中读取发光值（读数B，即第二次读数）。</li>
		<li>为判断支原体是否阳性，计算读数B与读数A的比值。 
		注：支原体检测试剂盒生产商的操作说明中描述了支原体阳性的比值标准。读数A和读数B使用相同设置获取，仅反映读取顺序。
		<ol>
			<li>若比值&#60;1，判定为支原体阴性。</li>
			<li>若比值为1–1.2，结果不确定，需重复步骤5.2。</li>
			<li>若比值&#62;1.2，判定为支原体阳性，需对该培养物进行监测；必要时终止培养。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对支原体阴性的肿瘤细胞进行流式细胞术表征
	<ol>
		<li>使用细胞解离缓冲液解离肿瘤细胞。</li>
		<li>计数细胞，并将细胞重悬于步骤1.7中的FACS缓冲液中，浓度为1 × 106/mL。</li>
		<li>取100 µL细胞悬液分别加入各个流式管中，用于表面染色。</li>
		<li>在室温下以500 × g离心5分钟。</li>
		<li>吸除上清液，加入500 µL含5%山羊血清的FACS缓冲液，在室温下孵育10分钟以封闭Fc受体。</li>
		<li>加入2 mL FACS缓冲液，并在室温下以500 × g离心5分钟。</li>
		<li>吸除上清液，加入抗体表面染色混合液（表1）和FACS缓冲液，使终体积为100 µL。盖好样本，冰上避光染色30分钟。</li>
		<li>重复步骤5.3.6。</li>
		<li>吸除上清液，加入200 µL含1%多聚甲醛（PFA）和0.25%乙醇的溶液重悬细胞以固定细胞。室温避光孵育20分钟。</li>
		<li>重复步骤5.3.6。将细胞重悬于200 µL FACS缓冲液中，用于流式细胞仪检测。 
		注：预期间皮瘤肿瘤细胞对间皮素和N-钙黏蛋白呈阳性。部分细胞可能还表达CD90。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在完全肿瘤培养基中扩增，并分别按照步骤4.1和5.1所述进行冻存建库。</li>
</ol>

<ol><li>Guzman-Casta, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+factors+for+progression-free+and+overall+survival+in+malignant+pleural+mesothelioma%5BTitle%5D)+AND+%22Thoracic+Cancer%22%5BJournal%5D)">Prognostic factors for progression-free and overall survival in malignant pleural mesothelioma.</a> Thoracic Cancer. 12 (7), 1014-1022 (2021).</li>
<li>Baas, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First-line+nivolumab+plus+ipilimumab+in+unresectable+malignant+pleural+mesothelioma+%28CheckMate+743%29%3A+a+multicentre%2C+randomised%2C+open-label%2C+phase+3+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">First-line nivolumab plus ipilimumab in unresectable malignant pleural mesothelioma (CheckMate 743): a multicentre, randomised, open-label, phase 3 trial.</a> Lancet. 397 (10272), 375-386 (2021).</li>
<li>Testa, J. R., Berns, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+models+of+malignant+mesothelioma%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Preclinical models of malignant mesothelioma.</a> Frontiers in Oncology. 10, 101(2020).</li>
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<li>Donnenberg, V. S., Corselli, M., Normolle, D. P., Meyer, E. M., Donnenberg, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+detection+of+most+proteins+in+the+cell+surface+proteome+is+unaffected+by+trypsin+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric detection of most proteins in the cell surface proteome is unaffected by trypsin treatment.</a> Cytometry A. 93 (8), 803-810 (2018).</li>
<li>Pham, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+pancreatic+cancer+cells+from+a+patient-derived+xenograft+model+allows+for+practical+expansion+and+preserved+heterogeneity+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Isolation of pancreatic cancer cells from a patient-derived xenograft model allows for practical expansion and preserved heterogeneity in culture.</a> American Journal of Pathology. 186 (6), 1537-1546 (2016).</li>
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</ol>

CH 是 Briacell Therapeutics 和间皮瘤应用研究基金会科学顾问委员会的成员。其他所有作者均无任何利益冲突需要披露。

尽管该实验方案较为简单，但仍有一些关键步骤必须严格遵循。早期传代冻存对于保留肿瘤细胞富集过程的可重复性至关重要，以防初次尝试失败。通过肉眼评估成纤维细胞污染情况，以确定正确的传代和培养基饥饿技术，对于防止成纤维细胞在培养中过度生长至关重要。此外，差速胰酶消化法在孵育过程中需要对细胞进行仔细观察。细胞从培养皿表面脱落的速度可能不同，且不同细胞系之间存在差异。在学习和优化这一操作及决策步骤时，可将部分原始培养物保存在6孔板中，使用低血清饥饿培养基（含1%青霉素/链霉素和1%胎牛血清的RPMI 1640培养基），直至观察到肿瘤细胞的富集现象。
在已验证的间皮瘤肿瘤细胞系表型表征中，一个重要的因素是胰蛋白酶消化及蛋白酶-胶原酶混合液对间皮瘤肿瘤细胞表面标志物 N-钙黏蛋白表达的影响8。我们观察到，若使用这些酶进行细胞解离，会导致该表面标志物的丢失，此前已有相关报道9。尽管已有研究表明大多数表面蛋白不受胰蛋白酶的负面影响，但在设计流式抗体组合时，仍需对每个表面标志物进行单独验证<sup class...

恶性胸膜间皮瘤（MPM）是一种与石棉暴露高度相关的罕见肿瘤。尽管基于免疫治疗的方法已显示出令人鼓舞的效果，但对于罹患此疾病的患者而言，目前可用的治疗选择仍然有限，总体5年生存率较低1,2。目前多个研究机构正在努力深入理解该疾病，并识别可能改善患者预后的新型治疗靶点。尽管已有多种间皮瘤小鼠模型，但获取原代间皮瘤肿瘤细胞的途径仍较为有限3。体外扩增原代间皮瘤肿瘤细胞将提供一个有价值的模型系统，可用于直接研究肿瘤细胞及其与自体免疫细胞（如肿瘤浸润性淋巴细胞）之间的相互作用。虽然已有少数关于原代间皮瘤肿瘤细胞系扩增的报道，但数量稀少且未提供详细的标准操作流程（SOP）。此外，来自美国典型培养物保藏中心（ATCC）等商业来源的细胞系也较少。尽管原代肿瘤细胞系的可及性有限，已有研究表明，肿瘤细胞可从胸腔积液以及肿瘤组织中直接扩增获得4,5。此外，扩增后的肿瘤细胞系已被证实能够保留原始肿瘤的分子特征4,5,6。
本实验室正在研究恶性胸膜间皮瘤（MPM）的肿瘤-免疫微环境，并已建立一种从手术切除标本中扩增原代MPM肿瘤细胞系的方法。该方法借鉴了我们建立原发性转移性黑色素瘤肿瘤细胞系的经验。本研究的目的是提供一种详细且实用的原代间皮瘤肿瘤细胞系扩增方法，采用二维模型系统进行培养，并进一步开展表型分析。鉴于近年来在一线治疗中靶向CTLA4和PD-1的检查点阻断策略已取得显著成效2，能够大量建立原代肿瘤细胞系将有助于深入理解肿瘤自身耐药的内在机制，同时也为评估T细胞对肿瘤的识别能力提供重要的模型系统，从而加深我们对MPM中免疫应答机制的理解。
本方案的主要局限性在于，每种肿瘤都具有不同的微环境，且扩增成功率存在高度变异性。此外，该方法筛选的是能够在二维培养系统中扩增的肿瘤细胞。其他方法，如生成三维球状体或类器官培养，可能提供一种替代途径，有望实现更高的扩增成功率，或获得在传统二维系统中无法扩增的细胞系。已有研究表明，此类三维培养对于难以扩增的肿瘤类型（例如胰腺癌）的建立具有实用价值7。

<table><tbody><tr><td>10 mL 血清移液管</td><td>BD Falcon</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 圆底离心管</td><td>BD Falcon</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>2 mL 吸液移液管</td><td>BD Falcon</td><td>357558</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 血清移液管</td><td>BD Falcon</td><td>357543</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 圆底离心管</td><td>BD Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>6孔细胞培养板，经组织培养处理</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>AT104</td><td>一种蛋白酶-胶原酶混合物，被认为在流式细胞术中更有效地保护表位。</td></tr><tr><td>anti-CD325 (N-钙黏蛋白) PE</td><td>Invitrogen</td><td>12-3259-42</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD90 PE-Cy7</td><td>BD Biosciences</td><td>561558</td><td></td></tr><tr><td>抗间皮素 APC</td><td>Miltenyi</td><td>130-118-096</td><td></td></tr><tr><td>30% 牛血清白蛋白</td><td>Sigma</td><td>A8577-1L</td><td></td></tr><tr><td>无酶细胞解离缓冲液</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13151014</td><td></td></tr><tr><td>细胞筛（70 &amp;micro;m）</td><td>Greiner Bio-One</td><td>542-070</td><td></td></tr><tr><td>配备15 mL和50 mL转子的离心机</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>I型胶原酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-0130</td><td>将1.5 g I型胶原酶溶解于100 mL无菌DMEM中，并分装为5 mL每份。做好标记后于-20 &amp;deg;C保存。</td></tr><tr><td>程序降温冻存盒</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15-350-50</td><td></td></tr><tr><td>冻存管</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>5000-0020</td><td></td></tr><tr><td>CulturPlate-96</td><td>Packard Instrument Company</td><td>6005680</td><td>白色不透明96孔微孔板。</td></tr><tr><td>二甲基亚砜</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>脱氧核糖核酸酶I（来源于牛胰腺）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4527</td><td>分装为50 &amp;mu;L每份，做好标记后于-20 &amp;deg;C保存。解冻后可于4 &amp;deg;C保存一个月。</td></tr><tr><td>1×杜氏磷酸盐缓冲液</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>200度乙醇</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A4094</td><td></td></tr><tr><td>FACS管—带滤膜盖</td><td>BD Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Gemini-Bio</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>GentleMACS C管</td><td>Miltenyi</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td>带加热装置的GentleMACS Octo解离仪</td><td>Miltenyi</td><td>130-096-427</td><td>包含专用加热套筒，用于在解离过程中对C管加热。</td></tr><tr><td>山羊血清</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9023</td><td>分装后于-20 &amp;deg;C保存。</td></tr><tr><td>Hank's平衡盐溶液，500 mL</td><td>Corning</td><td>MT21022CV</td><td></td></tr><tr><td>透明质酸酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3506</td><td>将0.15 g透明质酸酶溶解于100 mL无菌DMEM中，并分装为1.0 mL每份。做好标记后于-20 &amp;deg;C保存。</td></tr><tr><td>倒置显微镜</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>层流罩</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>活/死细胞黄色染料</td><td>Life Technologies</td><td>L-34968</td><td></td></tr><tr><td>微量移液器吸头，20 &amp;micro;L</td><td>ART</td><td>2149P</td><td></td></tr><tr><td>微量移液器，0.5–20 &amp;micro;L</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>支原体检测试剂盒对照组</td><td>Lonza</td><td>LT07-518</td><td>将阳性对照分装后于-20 &amp;deg;C保存。</td></tr><tr><td>Mycoalert Plus支原体检测试剂盒</td><td>Lonza</td><td>LT07-710</td><td>将试剂和底物分装后于-20 &amp;deg;C保存。剩余缓冲液分装作为阴性对照，同样于-20 &amp;deg;C保存。</td></tr><tr><td>16% 多聚甲醛</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td>通过PVDF注射器滤器（Millex货号SLVV033RS）过滤制备储备液，并在通风橱中分装。于-20 &amp;deg;C保存。</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素溶液，10,000 U/mL</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>移液器辅助器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>具备发光检测功能的酶标仪</td><td>BioTek</td><td>Synergy HT</td><td>任何满足此规格的酶标仪均可使用</td></tr><tr><td>RPMI 1640培养基</td><td>Corning</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>手术刀</td><td>Andwin</td><td>2975#21</td><td></td></tr><tr><td>Stericup Quick Release-GP 无菌真空过滤系统，0.22 &amp;micro;m PES Express PLUS，500 mL</td><td>EMD Millipore</td><td>S2GPU05RE</td><td></td></tr><tr><td>Steriflip-GP 滤器，0.22 &amp;micro;m PES Express PLUS，50 mL</td><td>EMD Millipore</td><td>SCGP00525</td><td></td></tr><tr><td>无菌镊子</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-000-157</td><td></td></tr><tr><td>T25细胞培养瓶，经组织培养处理</td><td>Corning</td><td>430639</td><td></td></tr><tr><td>T75细胞培养瓶，经组织培养处理</td><td>Corning</td><td>430641U</td><td></td></tr><tr><td>0.4% 台盼蓝溶液</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>0.05% 胰蛋白酶-EDTA溶液</td><td>Corning</td><td>25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>ViaStain吖啶橙/碘化丙啶（AO/PI）溶液</td><td>Nexcelom</td><td>CS2-0106-5ML</td><td></td></tr></tbody></table>

原发性恶性胸膜间皮瘤肿瘤细胞系的建立与扩增

Generation and Expansion of Primary, Malignant Pleural Mesothelioma Tumor Lines

目前尚缺乏从罕见肿瘤类型中扩增原代肿瘤细胞系的有效方法。本实验方案介绍了一种从手术切除的恶性胸膜间皮瘤（MPM）组织中扩增原代肿瘤细胞的方法，全面概述了从组织消化、富集、扩增、冻存到表型鉴定的全过程。此外，本方案还引入了一些可能适用于多种肿瘤类型的肿瘤细胞培养概念，例如差异胰蛋白酶消化法，以及解离方法对细胞表面标志物检测在表型鉴定中影响的分析。本研究的主要局限性在于所筛选的肿瘤细胞仅能在二维（2D）培养系统中扩增。对该方案的若干改进，包括采用三维（3D）培养系统、添加培养基补充物、使用包被培养板以增强细胞贴附性，以及采用其他组织解离方法，可能有助于优化该技术并提高建立肿瘤细胞系的整体成功率。总体而言，本方案为从此类罕见肿瘤中建立和鉴定肿瘤细胞提供了一种基础性方法。

为确定早期传代培养物中的成纤维细胞污染情况，使用倒置相差显微镜观察细胞，以评估成纤维细胞相对于其他贴壁细胞的出现频率。 图1 显示成纤维细胞污染程度增加至80%的示例（图1A), 50% (图1B)，以及30%（图1C），与无成纤维细胞污染的培养物相比（图1D）。根据此视觉评估结果，按照上述方法调整扩增条件。一旦获得无支原体污染的培养物， &lt;当建立10%的成纤维细胞污染后，采用流式细胞术测定间皮瘤肿瘤细胞系的纯度。
图2A、B展示了两个原代间皮瘤肿瘤细胞系（MESO171和MESO176）与ATCC建立的间皮瘤肿瘤细胞系（NCI-H2452和MSTO-211H）的代表性流式细胞术表面染色结...

本方法论文的目的是展示一种稳健且可重复的方法，用于从手术切除的胸膜间皮瘤组织中富集、生成并扩增原代肿瘤细胞系。

目前尚缺乏从罕见肿瘤类型中扩增原代肿瘤细胞系的有效方法。本方案描述了扩增原代……

本方案为肿瘤细胞扩增提供了基础，从而能够深入研究肿瘤细胞的功能和基因组状态。此外，它还提供了一种体外模型系统，用于评估肿瘤对免疫应答的影响。该技术的主要优势在于，它提供了一种标准化的方案，可用于从患者组织中建立间皮肿瘤细胞系。目前该模型系统尚无标准化的操作流程。该技术最困难的方面在于早期传代培养物中成纤维细胞的污染问题。必须充分掌握成纤维细胞与肿瘤细胞在形态学上的区别，以判断成纤维细胞饥饿处理是否有效。首先，将10毫升肿瘤消化酶混合液转移至解离管中。使用无菌手术刀将肿瘤组织块转移至无菌的六孔板盖中。使用新的无菌手术刀和镊子去除所有脂肪坏死组织和血凝块。将整个肿瘤组织切成1立方毫米大小的小块。为防止组织干燥，向肿瘤组织中加入500 µL无菌的Hank's平衡盐溶液（HBSS）。将肿瘤碎片转移至含有10 mL肿瘤消化酶混合液的解离管中。拧紧管盖。将管子倒置（管盖朝下）放入组织解离仪中，并为解离仪供电。在解离仪上选择预设程序中的37摄氏度人肿瘤组织解离试剂盒程序1，10分钟后检查状态，确保无红色指示灯闪烁提示堵塞错误。一小时后，取出解离管并置于超净工作台中。将70微米细胞滤网置于50毫升锥形管上，用10毫升移液器将消化后的肿瘤组织转移至滤网上进行过滤。若滤网堵塞，则更换新的滤网。用 10 毫升新鲜的肿瘤消化培养基冲洗解离管，并通过滤膜洗涤。移除并弃去滤膜。用肿瘤消化培养基将总体积补至 40 毫升。在室温下以 500 × g 离心五分钟。使用连接真空源的 2 毫升吸液枪，吸除上清液，避免扰动沉淀，然后用 10 毫升无菌肿瘤培养基重悬细胞。随后，再次离心试管，并按上述方法吸除上清液。接下来，将细胞重悬于3 mL无菌肿瘤培养基中，并将细胞悬液转移至一个无菌的6孔板中的一个孔内。将该6孔板置于37摄氏度、含5%二氧化碳的培养箱中孵育。24小时后，将第1孔中消化肿瘤所用的培养基转移至同一6孔板中的另一个新孔中，然后向第1孔加入3 mL无菌肿瘤培养基。使用倒置相差显微镜，确定早期传代培养物中成纤维细胞污染的比例。如果早期传代培养物中成纤维细胞污染超过细胞总数的20%，则更换为低血清培养基继续培养。如果成纤维细胞比例未能降至10%或更低，则用PBS轻轻冲洗孔板，以去除含血清的培养基。在六孔板的每个孔中加入一毫升胰蛋白酶。将六孔板或培养瓶置于37摄氏度的培养箱中孵育一分钟。从培养箱中取出板或培养瓶，使用倒置显微镜检查细胞的贴壁情况。当细胞部分脱落或漂浮时，轻柔地移除悬浮的细胞和胰蛋白酶。将细胞放入含有等量或更大量完全肿瘤培养基的15毫升锥形管中。重复消化处理，直至获得三至四批细胞。将所有独立组分在室温下以 500 x g 离心五分钟。使用连接真空源的 2 毫升吸液移液管，吸取上清液，注意不要扰动沉淀。用 5 毫升无菌低血清培养基重悬细胞。为每种组分在T-25培养瓶中接种细胞，并将培养瓶置于37摄氏度的培养箱中。如需冻存早期传代的细胞，解冻一管分装好的冻存液。通过胰酶消化法收集细胞，首先用PBS洗涤培养瓶，然后加入胰酶，操作方法如前所述。将烧瓶置于37摄氏度的培养箱中孵育三分钟。从培养箱中取出烧瓶，使用倒置显微镜检查细胞贴壁情况。若细胞出现脱落或漂浮现象，应轻柔地移除悬浮的细胞和胰蛋白酶。将细胞放入含有等量或更大量完全肿瘤培养基的15毫升锥形管中。用移液器轻轻吹打混匀管内物质。取20微升细胞悬液用于计数。然后在室温下以 500 × g 离心剩余的细胞悬液 5 分钟。在细胞离心过程中，使用实验室特定的计数方案进行细胞计数，例如台盼蓝或吖啶橙/碘化丙啶染色法。离心后，将细胞重悬于冻存液中，每毫升冻存液中至少含有 5 × 10⁶ 个细胞，并将 1 毫升该细胞悬液转移至预先标记的 1.5 毫升冻存管中。将冻存管放入程序降温盒中，并立即转移至-80°C保存。该图显示成纤维细胞污染程度分别为80%、50%和30%的情况，对比了无成纤维细胞污染的培养物。该图展示了四种原代间皮瘤肿瘤细胞系MESO171、MESO176、NCIH2452、MSTO-211H以及作为阴性对照的黑色素瘤细胞系MEL526的代表性流式细胞术表面标志染色结果。这些细胞系可同时表达间皮素和N-钙黏蛋白。研究还表明，检测酶消化法解离对细胞表面蛋白标志物表达的影响十分重要，因为胰蛋白酶和蛋白酶胶原酶混合物均会导致N-钙黏蛋白表面表达的丧失，而CD90的表达则未受影响。关键步骤包括对肿瘤组织的正确处理，如消化前去除血液和脂肪，识别成纤维细胞污染，以及确定如何限制成纤维细胞的过度生长，这些均至关重要。在此方案之后的一个重要方法是细胞毒性淋巴细胞实验，用于检测自体T细胞识别患者来源肿瘤细胞的能力。该技术将鉴定出新的抗肿瘤特异性T细胞受体，这些受体可能具有治疗意义。此外，该方法还将使我们能够研究肿瘤细胞与配对的肿瘤浸润淋巴细胞之间的相互作用以及免疫功能障碍。

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原发性恶性胸膜间皮瘤肿瘤系的生成和扩展

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体外 腹膜间皮清除实验：模拟卵巢癌转移早期步骤

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原发性恶性胸膜间皮瘤肿瘤细胞系的建立与扩增

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