Name: 使用eGFP标记的蛋白质研究 果蝇 光感受器细胞中的膜蛋白运输 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-21T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 20 s
Description: 了解利用eGFP标记蛋白研究果蝇光感受器细胞中膜蛋白运输的非侵入性方法。该技术通过深伪瞳孔成像和水浸显微镜观察，可监测光感受器退化，为研究人类遗传性失明提供重要模型。

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我们谨向多年来参与研究的学生研究人员表示感谢。特别感谢Nina Meyer、Sibylle Mayer、Juliane Kaim和Laura Jaggy，本方案中所展示的代表性结果使用了她们的数据。本研究小组的工作由德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft）资助（项目编号：Hu 839/2-4、Hu 839/7-1），项目负责人为Armin Huber。

<ol><li>Wang, X., Huang, T., Bu, G., Xu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulation+of+protein+trafficking+in+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurodegeneration.+9%22%5BJournal%5D)">Dysregulation of protein trafficking in neurodegeneration.</a> Molecular Neurodegeneration. 9. 9, 31(2014).</li>
<li>Schopf, K., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+protein+trafficking+in+Drosophila+photoreceptor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Membrane protein trafficking in Drosophila photoreceptor cells.</a> European Journal of Cell Biology. 96 (5), 391-401 (2017).</li>
<li>Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+photoreceptor+array+of+the+dipteran+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">The photoreceptor array of the dipteran retina.</a> Trends in Neurosciences. 9, 419-423 (1986).</li>
<li>Wang, T., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phototransduction+and+retinal+degeneration+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Archiv+-+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Phototransduction and retinal degeneration in Drosophila.</a> Pflügers Archiv - European Journal of Physiology. 454 (5), 821-847 (2007).</li>
<li>Xiong, B., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhodopsin+homeostasis+and+retinal+degeneration%3A+lessons+from+the+fly%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Rhodopsin homeostasis and retinal degeneration: lessons from the fly.</a> Trends in Neurosciences. 36 (11), 652-660 (2013).</li>
<li>Bähner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-regulated+subcellular+translocation+of+Drosophila+TRPL+channels+induces+long-term+adaptation+and+modifies+the+light-induced+current%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Light-regulated subcellular translocation of Drosophila TRPL channels induces long-term adaptation and modifies the light-induced current.</a> Neuron. 34 (1), 83-93 (2002).</li>
<li>Cronin, M. A., Lieu, M. -H., Tsunoda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+stages+of+light-dependent+TRPL-channel+translocation+in+Drosophila+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Two stages of light-dependent TRPL-channel translocation in Drosophila photoreceptors.</a> Journal of Cell Science. 119, 2935-2944 (2006).</li>
<li>Meyer, N., Joel-Almagor, T., Frechter, S., Minke, B., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+translocation+of+the+eGFP-tagged+TRPL+channel+in+Drosophila+photoreceptors+requires+activation+of+the+phototransduction+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Subcellular translocation of the eGFP-tagged TRPL channel in Drosophila photoreceptors requires activation of the phototransduction cascade.</a> Journal of Cell Science. 119, Pt 12 2592-2603 (2006).</li>
<li>Oberegelsbacher, C., Schneidler, C., Voolstra, O., Cerny, A., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+TRPL+ion+channel+shares+a+Rab-dependent+translocation+pathway+with+rhodopsin%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The Drosophila TRPL ion channel shares a Rab-dependent translocation pathway with rhodopsin.</a> European Journal of Cell Biology. 90 (8), 620-630 (2011).</li>
<li>Wagner, K., Smylla, T. K., Lampe, M., Krieg, J., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipase+D+and+retromer+promote+recycling+of+TRPL+ion+channel+via+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Phospholipase D and retromer promote recycling of TRPL ion channel via the endoplasmic reticulum.</a> Traffic. , (2021).</li>
<li>Franceschini, N., Kirschfeld, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Les+ph%C3%A9nom%C3%A9nes+de+pseudopupille+dans+l%27oeil+compose+de+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Kybernetik%22%5BJournal%5D)">Les phénoménes de pseudopupille dans l'oeil compose de Drosophila.</a> Kybernetik. 9 (5), 159-182 (1971).</li>
<li>Pichaud, F., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+visualization+approach+for+identifying+mutations+that+affect+differentiation+and+organization+of+the+Drosophila+ommatidia%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A new visualization approach for identifying mutations that affect differentiation and organization of the Drosophila ommatidia.</a> Development. 128 (6), 815-826 (2001).</li>
<li>Smylla, T. K., Wagner, K., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+fluorescent+proteins+for+functional+dissection+of+the+Drosophila+visual+system%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Application of fluorescent proteins for functional dissection of the Drosophila visual system.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), (2021).</li>
<li>Meyer, N. Mechanisms of the light-dependent translocation of the ion channel TRPL in the photoreceptors of Drosophila melanogaster: Dissertation for obtaining the academic degree Dr. rer. nat. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22University+of+Karlsruhe+%28TH%29%22">University of Karlsruhe (TH)</a>. , Karlsruhe. (2005).</li>
<li>Meyer, N., Oberegelsbacher, C., Dürr, T. D., Schäfer, A., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+eGFP-based+genetic+screen+for+defects+in+light-triggered+subcelluar+translocation+of+the+Drosophila+photoreceptor+channel+TRPL%5BTitle%5D)+AND+%22Fly%22%5BJournal%5D)">An eGFP-based genetic screen for defects in light-triggered subcelluar translocation of the Drosophila photoreceptor channel TRPL.</a> Fly. 2 (1), 36-46 (2008).</li>
<li>Zheng, L., Carthew, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lola+regulates+cell+fate+by+antagonizing+Notch+induction+in+the+Drosophila+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">Lola regulates cell fate by antagonizing Notch induction in the Drosophila eye.</a> Mechanisms of Development. 125 (1-2), 18-29 (2008).</li>
<li>Hibbard, K. L., O'Tousa, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+the+cytoplasmic+DEAD+box+helicase+Dbp21E2+in+rhodopsin+maturation+and+photoreceptor+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurogenetics%22%5BJournal%5D)">A role for the cytoplasmic DEAD box helicase Dbp21E2 in rhodopsin maturation and photoreceptor viability.</a> Journal of Neurogenetics. 26 (2), 177-188 (2012).</li>
<li>Huang, Y., Xie, J., Wang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Fluorescence-based+genetic+screen+to+study+retinal+degeneration+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">A Fluorescence-based genetic screen to study retinal degeneration in Drosophila.</a> PloS One. 10 (12), 0144925(2015).</li>
<li>Zhao, H., Wang, J., Wang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+V-ATPase+V1+subunit+A1+is+required+for+rhodopsin+anterograde+trafficking+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">The V-ATPase V1 subunit A1 is required for rhodopsin anterograde trafficking in Drosophila.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (13), 1640-1651 (2018).</li>
<li>Xiong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ER+complex+proteins+are+required+for+rhodopsin+biosynthesis+and+photoreceptor+survival+in+Drosophila+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">ER complex proteins are required for rhodopsin biosynthesis and photoreceptor survival in Drosophila and mice.</a> Cell Death and Differentiation. 27 (2), 646-661 (2020).</li>
<li>Zhao, H., Wang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PE+homeostasis+rebalanced+through+mitochondria-ER+lipid+exchange+prevents+retinal+degeneration+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">PE homeostasis rebalanced through mitochondria-ER lipid exchange prevents retinal degeneration in Drosophila.</a> PLoS Genetics. 16 (10), 1009070(2020).</li>
<li>Cerny, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+GTP-+and+phospholipid-binding+protein+TTD14+regulates+trafficking+of+the+TRPL+ion+channel+in+Drosophila+photoreceptor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">The GTP- and phospholipid-binding protein TTD14 regulates trafficking of the TRPL ion channel in Drosophila photoreceptor cells.</a> PLoS Genetics. 11 (10), 1005578(2015).</li>
<li>Richter, D. Structural and functional analyses of TRP ion channels in the photoreceptor cells of Drosophila melanogaster: Dissertation for obtaining the academic degree Dr. rer, nat. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22University+of+Karlsruhe+%28TH%29%22">University of Karlsruhe (TH)</a>. , Karlsruhe. (2007).</li>
<li>Gambis, A., Dourlen, P., Steller, H., Mollereau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-color+in+vivo+imaging+of+photoreceptor+apoptosis+and+development+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Two-color in vivo imaging of photoreceptor apoptosis and development in Drosophila.</a> Developmental Biology. 351 (1), 128-134 (2011).</li>
<li>Hardie, R. C., Liu, C. -H., Randall, A. S., Sengupta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+tracking+of+phosphoinositides+in+Drosophila+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">In vivo tracking of phosphoinositides in Drosophila photoreceptors.</a> Journal of Cell Science. 128 (23), 4328-4340 (2015).</li>
<li>Chakrabarti, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dPIP5K+dependent+pool+of+phosphatidylinositol+4%2C5+bisphosphate+%28PIP2%29+is+required+for+G-protein+coupled+signal+transduction+in+Drosophila+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">A dPIP5K dependent pool of phosphatidylinositol 4,5 bisphosphate (PIP2) is required for G-protein coupled signal transduction in Drosophila photoreceptors.</a> PLoS Genetics. 11 (1), 1004948(2015).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

荧光蛋白的应用以及通过DPP成像和视网膜浸水显微镜进行筛选的简便性已被多个研究团队证实是成功的12。已有多种遗传筛选采用了与本文所述相似的策略，利用Rh1::eGFP检测视紫红质表达水平、稳态、视网膜组织结构或细胞完整性的缺陷17,18,19,20,21。如上所述，像TRPL::eGFP这类可转运的融合蛋白可用于检测从或到小网膜的蛋白质转运过程是否受损，例如在诱变筛选中。另一方面，像TRP::eGFP这类永久定位于小网膜的融合蛋白则可用于研究小网膜的形态结构。DPP和浸水显微镜被公认为是在果蝇（Drosophila）眼模型中进行高通量分析和筛选的优秀方法。然而，建议最终对分离的单眼或冷冻切片的视网膜组织进行（免疫）组织化学分析，以验证通过DPP或浸水...

通过将蛋白质运送至细胞膜以及从细胞膜移除，神经元中的膜蛋白运输调控着细胞膜上受体和离子通道等膜蛋白的分布，从而调节神经元功能。蛋白质运输的失调或缺陷通常会对细胞产生有害影响，并导致神经元退行性变。在人类中，这可能引发阿尔茨海默病和帕金森病等神经退行性疾病。 视网膜色素变性1复眼中的感光细胞 黑腹果蝇 已成为 体内 研究膜蛋白转运的模式系统2. 这不仅归因于其基因的多功能性 果蝇 能够实现高效的遗传筛选，还因为光感受器膜中所有吸收光的关键组分均已得到详尽表征，并且已有多种高效的显微技术可用于果蝇复眼研究。本文重点介绍这些技术。
在 果蝇 光感受器细胞的顶端质膜在细胞的一侧形成密集排列的微绒毛束，称为小眼杆（rhabdomere）。光感受器细胞R1-6的小眼杆呈特征性的梯形排列，而光感受器细胞R7和R8则在该梯形中心形成单个小眼杆。3膜蛋白运输对于视网膜小柱膜蛋白（如视紫红质以及光激活的瞬时受体电位（TRP）和类瞬时受体电位（TRPL）离子通道）的受控更新是必需的，以确保这些光转导蛋白在视网膜小柱中维持适当含量。光感受器膜蛋白在内质网中合成，并被运输 通过 高尔基体到小网膜。在视紫红质被光激活后，一个视紫红质分子可通过吸收第二个光子而失活，或通过网格蛋白介导的内吞作用从小网膜中移除。内吞后的视紫红质要么在溶酶体中被降解，要么被回收至小网膜4,5离子通道 TRPL 在光转导级联反应激活后也会发生内化，并在光照依赖的条件下于小柱状突（果蝇在暗处时 TRPL 所在的位置）与细胞体内的内质网富集储存区室之间发生转位（光照数小时内被转运至此区室）。6,7,8,9,10与内吞的视紫红质不同，只有少量TRPL被降解 通过 内吞溶酶体途径，且大部分在细胞内储存，并在暗适应时被循环回小网膜6因此，TRPL 可用于分析光触发的质膜蛋白的转运。 果蝇 感光细胞也常被用于研究神经元变性。感光细胞的变性通常通过评估杆状突的结构来确定，后者会因变性过程而发生解体。5.
为了研究光感受器细胞中 TRPL 和视紫红质的亚细胞定位或光感受器细胞的退化，本文采用了两种在分析速度和分辨率上有所不同的荧光显微镜方法。一种是快速、无创的方法，可用于遗传筛选，但空间分辨率有限，即深部假瞳孔（DPP）中荧光的检测。DPP 是节肢动物复眼的一种光学现象，其几何起源早在1971年由 Franceschini 和 Kirschfeld 详细阐明11。简而言之，在视网膜下方的多个光学平面上，可观察到来自相邻小眼的微绒毛束的重叠图像。在穿过眼球曲率中心的焦平面上，这些叠加的投影形成一个图像，其形状类似于单个小眼中微绒毛束的梯形排列，但尺寸放大了若干数量级。该现象即使不依赖荧光蛋白的外源表达（例如 TRPL::eGFP8）也可观察到，但荧光蛋白的表达有助于更清晰地检测 DPP（图 1A-A''）12。第二种无创方法是水浸显微镜技术，其原理是通过用水中和眼睛的屈光系统后，对荧光标记的蛋白进行成像（图 1B-C''）12。利用水浸法，可对单个光感受器细胞中微绒毛束或胞体内的 TRPL::eGFP 相对含量进行定量评估。此外，可利用不发生转位的荧光标记蛋白来评估微绒毛束的完整性，并以定量方式确定潜在退化过程的时间进程，如本文所述。
尽管DPP记录是这些方法中最简单、最快捷的，但其生成数据的空间分辨率有限。此外，DPP缺失的原因有很多，而这些原因通常无法通过DPP成像本身加以辨别。由于DPP代表多个小眼的信号总和，因此会丢失关于单个细胞的信息。因此，低分辨率的DPP成像在筛选大量果蝇方面具有重要作用，但通常应随后通过浸水显微镜进行更高分辨率的记录。浸水显微成像可实现对单个细胞、发育缺陷、眼形态、蛋白质错位或视网膜变性等现象的分析，并可对这些效应进行定量评估。本实验方案将详细描述这两种技术。
<img alt="显微成像中的DPP成像：致死性水浸、非致死性；实验、荧光结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63375/63375fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1显微镜技术变体概述 果蝇 本方案中展示的眼睛。 （示意图与典型显微照片A-A''荧光深部假瞳孔（DPP）成像，（B-B'') 荧光小眼杆致命性水浸显微观察，以及 (C-C''）非致死性水滴显微镜观察荧光小眼面。比例尺（A''): 100 µm. 比例尺（B''-C''): 10 µm该图已根据参考文献进行了修改13. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63375/63375fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>15 mL 离心管</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>一氧化碳&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 麻醉果蝇板</td><td>Flystuff</td><td>59-172</td><td></td></tr><tr><td>冷光源灯（KL 1500 LCD）</td><td>蔡司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiji/ImageJ</td><td>美国国立卫生研究院</td><td></td><td></td></tr><tr><td>荧光显微镜，配备紫外灯、相机、滤光片组和软件（AxioImager.Z1m，Axiocam 530 mono，38 HE，ZEN2 blue edition）</td><td>蔡司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>荧光灯管（Lumilux T8，L 30W/840，4000 K，G13）&lt;br/&gt; [1750 勒克斯，E&lt;sub&gt;e&lt;/sub&gt;&lt;sup&gt;470 nm&lt;/sup&gt; = 298 &amp;micro;W cm&lt;sup&gt;-2&lt;/sup&gt;，E&lt;sub&gt;e&lt;/sub&gt;&lt;sup&gt;590 nm&lt;/sup&gt; = 215 &amp;micro;厘米&lt;sup&gt;-2&lt;/sup&gt;]&lt;br/&gt; 和[760 勒克斯，E&lt;sub&gt;e&lt;/sub&gt;&lt;sup&gt;470 nm&lt;/sup&gt; = 173 &amp;micro;厘米&lt;sup&gt;-2&lt;/sup&gt;，E&lt;sub&gt;e&lt;/sub&gt;&lt;sup&gt;590 nm&lt;/sup&gt; = 147 &amp;micro;W cm&lt;sup&gt;-2&lt;/sup&gt;]</td><td>Osram</td><td>4050300518039</td><td></td></tr><tr><td>实验室移液器（20-200） &amp;micro;L)</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>载物片</td><td>Roth</td><td>0656.1</td><td></td></tr><tr><td>培养皿（94 mm）</td><td>Greiner Bio-One</td><td>633102</td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头（200 &amp;micro;L)</td><td>Labsolute</td><td>7695844</td><td></td></tr><tr><td>橡皮泥（Blu-Tack）</td><td>Bostik</td><td>30811745</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜（SMZ445）</td><td>尼康</td><td></td><td></td></tr><tr><td>配备紫外灯、相机、滤光片组和软件的体视显微镜（MZ16F，MC170 HD，GFP3，LAS 4.12）</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

使用 egfp 标记蛋白在 drosophila 感光细胞中研究膜蛋白转运

Studying Membrane Protein Trafficking in Drosophila Photoreceptor Cells Using eGFP-Tagged Proteins

膜蛋白运输调控受体和离子通道向质膜的整合与清除。这一过程对神经元的细胞功能和细胞完整性具有根本性的重要意义。Drosophila 感光细胞已成为研究膜蛋白运输的模型。除视紫红质外，后者在光照后会从感光细胞膜内化并被降解，Drosophila 中的瞬时受体电位样（TRPL）离子通道也表现出光依赖性的转位现象：在黑暗中位于小膜室感光膜，而在光照后被转运至感光细胞胞体。通过在感光细胞中表达eGFP标记的TRPL，可以以一种简单且非侵入性的方式研究TRPL的这种细胞内运输过程。随后可通过深部假瞳孔法或浸水显微镜观察eGFP荧光。这些方法可在完整眼球中检测荧光，因此适用于针对TRPL转位缺陷型Drosophila 突变体的高通量分析和遗传筛选。本文详细介绍了用于研究TRPL光诱导转位的果蝇制备方法、显微技术以及定量分析方法。这些方法也可应用于其他Drosophila 感光细胞蛋白（例如视紫红质）的运输研究。此外，通过使用eGFP标记的小膜室蛋白，这些方法还可用于评估感光细胞的退行性变。

已构建在视紫红质1启动子控制下表达TRPL::eGFP融合蛋白的转基因Drosophila果蝇。在这些果蝇中，TRPL::eGFP在复眼的光感受器细胞R1-6中表达，并表现出依赖光照的定位变化。当果蝇处于黑暗环境中时，TRPL::eGFP被整合到外部小网膜中；经过数小时光照后，TRPL会转位至细胞体，并储存在富含内质网的区室中。8,10 当TRPL::eGFP位于小网膜中时，其荧光可在DPP中观察到。然而，由于TRPL::eGFP发生转位，光照下小网膜的荧光会消失（图11A、B）。该现象已被用于开展遗传筛选，以鉴定TRPL::eGFP内化缺陷的突变体（图11C、D）14,15。为了能够分离潜在的纯合致死...

本文介绍了利用eGFP荧光在黑腹果蝇（Drosophila）复眼中对光感受器膜蛋白进行定位以及评估视网膜变性的非侵入性方法。

使用 eGFP 标记蛋白在 Drosophila 感光细胞中研究膜蛋白转运

膜蛋白运输调控受体和离子通道向质膜的整合与移除。该过程在本质上……

带有GFP标签的光感受器蛋白（如离子通道TRPL GFP）使我们能够利用非侵入性技术研究神经元中的蛋白质运输。该方法还可用于监测光感受器的退化过程。因此，可以在果蝇眼睛中研究导致人类失明的遗传性疾病的分子基础。可通过观察深部假瞳孔中的荧光或使用浸水显微镜来评估GFP标记蛋白的细胞定位。这两种方法均可快速确定视觉蛋白的定位，并观察由于感光细胞退化导致的微绒毛结构缺陷。为了获得高质量的图像，最关键的因素是果蝇眼睛的取向。进行该技术操作时，应将注意力集中在略微靠近复眼边缘的小眼上。我将演示深部伪瞳孔（DPP）成像的操作流程，而使用水浸显微镜的另外两种技术将由我的同事Krystina Wagner博士以及本课题组的博士生Matthias Zeger进行演示。开始深部伪瞳孔（DPP）成像时，先麻醉1至3日龄的果蝇，然后将其侧置于显微镜物镜中央，使左眼或右眼精确地呈径向朝向物镜。增加放大倍数以使整个眼睛进入视野，并将眼睛的中央小眼居中。如果可能，通过将双虹膜光圈调节至较浅的设置来减小显微镜的景深。接着，将显微镜的紫外灯调至最大强度并打开。然后，根据眼睛中表达的荧光蛋白选择显微镜的荧光滤光片组，并将光路设置为通向显微镜附带的相机。利用软件中的实时成像功能，通过增加曝光时间和增益值，将图像亮度调整至仅能检测到眼睛特异性信号的水平。重新调整显微镜对焦至眼睛内部，以生成DPP的叠加图像。然后，拍摄荧光DPP的图像。为了制备致死突变的果蝇样本，将一块培乐多粘土固定在载玻片上，另取一块置于培养皿中央。向培养皿中加入冰镇的蒸馏水及一些冰屑。然后，将一只冰麻醉的果蝇置于涂有黏土的载物片上，并将其放在体视显微镜下。将果蝇翻转至仰卧位，用昆虫针从胸部中央穿刺而过。将针水平固定在涂有黏土的载物片上，并使果蝇的左眼或右眼朝上。然后，小心地将载玻片无黏土的一侧朝下固定在培养皿中，防止果蝇头部旋转。确保果蝇的眼睛被水覆盖。或者，若需制备非致死性处理的果蝇样本，可将经冰麻醉的果蝇头部朝前转移至200微升移液器吸头中，并用压缩空气小心地将果蝇推向吸头尖端。然后，使用解剖刀在果蝇头部前方切断移液器吸头，再用镊子小心地将果蝇向吸头内推进几毫米。再次切断移液器吸头，并用压缩空气将果蝇推回吸头末端，使仅果蝇的头部从吸头末端露出。将一块橡皮泥粘附在载物片上后，将移液器吸头压入橡皮泥中，使果蝇的左眼或右眼朝上。确保在显微镜下眼球的方向正确。进行图像采集时，选择水浸物镜。对于非致死性操作变体，使用实验室移液器将一大滴冷水中附着于水浸物镜的下表面。将制备好的果蝇载玻片小心地放置在显微镜载物台上。然后手动降低水浸物镜，直至其接触水面，或果蝇的眼睛接触到液滴。接着，将光路切换至显微镜相机，生成实时图像。重新调整相机的焦距，并评估眼睛的方向，确保眼睛朝向显微镜物镜呈径向排列。使用查找表软件检测过饱和情况。对于非色素型果蝇，调节曝光时间，使每幅图像中最亮的像素值略低于饱和阈值。拍摄图像，并将其保存为原始文件，以归档记录的所有相应元数据。然后，将图像导出为 tif 格式。为定量分析水浸显微照片中微绒杆的相对 eGFP 荧光强度，通过点击“分析”，然后选择“设置测量”，仅勾选“平均灰度值”选项，调整 ImageJ 的设置。通过点击“文件”，然后选择“打开”来导入 tif 图像。在图像中选择一个处于焦点的代表性区域，并通过反复按住 Control 键并同时按下加号键将其放大 200% 至 300%。接着，选择椭圆工具，在按住 Shift 键的同时，在图像中创建一个明显小于一个荧光小眼面的圆形选区。然后，在 ImageJ 主窗口工具栏下方查看显示的确切尺寸。要测量圆形选区内荧光强度，请使用键盘上的箭头键将圆圈移动至第一个小眼面，然后点击分析，再点击测量。此时将弹出一个结果窗口，列出所测得的灰度值。继续测量第2至第6个小眼的感杆体，并测量背景信号。对于非色素型果蝇，还需额外测量相应细胞体区域的信号。再测量另外两个小眼的荧光强度，共获得三个技术重复。使用铅笔工具标记已分析的小眼，并保存该图像以供记录。从结果窗口中选择并复制测得的灰度值，粘贴至电子表格软件中进行进一步计算。根据荧光强度值的来源，将其分类为小眼杆、细胞体和背景，并计算每个类别的平均强度。然后，使用第一个公式计算无色素眼、使用第二个公式计算有色素眼中存在于小眼体的eGFP相对含量。或者，通过水浸物镜显微图像中的eGFP荧光来定量分析眼形态时，可在图像中选择一个处于清晰对焦区域的代表性部位，从中选取三个相邻的小眼。根据eGFP荧光强度、边缘清晰度以及与周围背景信号的对比度，分别对所选区域中的18个小眼体进行评估。最后，对清晰可见的感杆结构评分为2分，微弱可见的感杆结构评分为1分，缺失的感杆结构评分为0分，据此计算退化指数。在表达eGFP-TRPL融合蛋白的转基因黑腹果蝇中，由于eGFP-TRPL发生转位，感杆结构的荧光在光照下消失。这使得研究人员能够开展遗传筛选，以鉴定在eGFP-TRPL内吞过程中存在缺陷的突变体。在对照果蝇中，eGFP 标记的 TRPL 在持续光照 16 小时后从感杆体转位至细胞体，导致感杆体荧光强度相较于暗适应状态显著降低。第二次暗孵育后，感杆体荧光强度再次回升至接近初始水平。然而，在 TRPL 转位缺陷型突变体 vps35MH20 中，持续光照 16 小时后再进行 24 小时暗适应，其荧光模式未发生显著变化。该定量方法可检测到具有高度统计学显著性的再循环缺陷。白眼果蝇可使小眼体和细胞体中的荧光信号均被检测到。相比之下，在红眼果蝇中，荧光信号仅可在小眼体中检测到，而在细胞体中无法检测到。关于视网膜变性的定量分析，可在数周内持续评估 eGFP TRP 荧光强度。在12小时光照、12小时黑暗循环条件下饲养两周后，突变果蝇的变性指数下降，而对照组果蝇则未出现下降。在本方案中，需区分有色眼与无色眼。由于色素沉着会影响荧光信号，因此已针对两种情况分别优化了定量水浸物镜显微镜技术。DPP成像和水浸物镜显微镜均为高通量方法，但分辨率有限。为研究亚细胞定位，我们建议对组织切片进行免疫荧光显微镜检测。为了对退行性表型进行详细分析，可进行电子显微镜检查。

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Biology

生物学

使用eGFP标记的蛋白质研究 果蝇 光感受器细胞中的膜蛋白运输

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活体成像观察果蝇复眼原基盘中胶质细胞的迁移

本报告介绍了利用活细胞成像和光漂白技术，研究在神经元质膜上外源性表达的、pH敏感型GFP标记蛋白的表面表达、转运途径及运输动力学。...

利用荧光恢复与荧光丢失光漂白技术评估培养神经元中膜蛋白的侧向扩散与胞吐作用

来源：Wagner, K. 等，利用eGFP标记蛋白研究果蝇感光细胞中的膜蛋白转运。J. Vis. Exp.

研究膜蛋白转运在 果蝇 光感受器细胞

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活体成像GFP标记蛋白 果蝇 卵母细胞

本方案介绍了一种高效成像活体样本的方法 果蝇...

活体成像 果蝇 蛹期复眼

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利用光激活型GFP成像APP的细胞内转运过程

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体内 果蝇运动神经突触前末梢的单分子示踪

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基底膜在发育过程中对组织和器官的形态发生至关重要。为了更好地理解导致该结构正确定位的机制，本文介绍了一种利用共聚焦显微镜和超分辨率显微镜观察和表征上皮细胞中基底膜蛋白的细胞内转运与分泌的方法。...

共聚焦与超分辨率成像技术揭示基底膜蛋白极化性细胞内运输及分泌过程 黑腹果蝇 卵子发生

本文介绍了几种常用的研究质膜受体激酶膜运输事件的方法。文稿中描述了详细的实验方案，包括植物材料准备、药物处理以及共聚焦成像设置。...

基于图像的方法研究气孔谱系细胞中的膜运输事件

本方案描述了定制的基于抗体的荧光标记及其向早期Drosophila胚胎中的显微注射，以实现对低丰度蛋白或翻译后修饰的活体成像，这些目标分子使用传统的GFP/mCherry标签方法难以检测。...

在活体中可视化低丰度蛋白质及翻译后修饰 黑腹果蝇 胚胎 通过 荧光抗体注射

了解利用eGFP标记蛋白研究果蝇光感受器细胞中膜蛋白运输的非侵入性方法。该技术通过深伪瞳孔成像和水浸显微镜观察，可监测光感受器退化，为研究人类遗传性失明提供重要模型。

使用 eGFP 标记蛋白在 Drosophila 感光细胞中研究膜蛋白转运

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