Name: 通过TIRF显微镜 在体外 同时可视化交联和单微管的动力学 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: 了解利用TIRF显微镜在体外同时可视化单微管和交联微管束动力学的方法。该技术可定量比较不同微管亚群的动态特性，揭示微管相关蛋白的集体活性机制。

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本工作获得了美国国立卫生研究院（NIH，编号1DP2GM126894-01）的资助，以及佩韦慈善信托基金和史密斯家族基金会为R.S.提供的资金支持。作者感谢姜硕博士在方案的开发与优化过程中所做出的贡献。

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<li>Wijeratne, S., Subramanian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geometry+of+antiparallel+microtubule+bundles+regulates+relative+sliding+and+stalling+by+PRC1+and+Kif4A%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Geometry of antiparallel microtubule bundles regulates relative sliding and stalling by PRC1 and Kif4A.</a> eLife. 7, 32595(2018).</li>
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</ol>

作者声明无竞争利益。

本文所述实验显著拓展了传统微管重建实验的范围与复杂性，传统实验通常仅在单根微管或单一类型的微管阵列上进行。当前实验方法提供了一种可同时定量并比较微管相关蛋白（MAP）对两种微管群体调控活性的手段，即单根微管和交联成束的微管。此外，该实验方法还可用于研究两种类型的微管束：一种是在动力学起始前由稳定种子预先形成的微管束，另一种是在两个生长末端相遇并发生交联时新形成的微管束（图3）。不仅如此，除了传统的实验变量（如蛋白质浓度和缓冲液条件）外，该方法还能评估微管阵列几何特征的影响，例如微管束中相邻微管之间的长度和夹角，这些几何因素正逐渐被认识到是影响微管动力学和微管相关蛋白活性的重要决定因素16。
为了将此实验方法进一步拓展 体外 重组多种微管相关结构时，需解决以下关键问题：（i）PRC1 优先交联彼此呈反向平行排列的微管。尽管在有丝分裂过程中细胞中心存在此类反向平行的微管束，但在神经元轴突及有丝分裂纺锤体等其他微管结构中，平行排列的微管束则是常见特征。上述方案可轻...

微管是形成多种细胞过程所必需的结构支架的生物大分子聚合物，这些过程包括细胞内运输、细胞器定位、细胞分裂和细胞伸长。为了执行这些多样化的功能，单个微管被组织成微米尺度的阵列，例如有丝分裂纺锤体、纤毛轴丝、神经元束、间期阵列以及植物皮层阵列。在这些结构中普遍存在的一种构型特征是微管沿其长度方向通过交联形成的束状结构1。若干基于微管的结构具有一个引人注目的特点，即在空间上紧密相邻的区域内，既存在成束的微管，也存在未交联的单根微管。这些不同的微管亚群可根据其正常功能的需要，表现出显著不同的聚合动力学行为2,3,4,5。例如，在有丝分裂纺锤体中，稳定的交联微管束与动态的单根微管共存于细胞中心的微米级区域内6。因此，研究共存微管群体动态特性的调控机制，对于理解基于微管结构的组装与功能至关重要。
微管是动态的多聚体，可在聚合与解聚阶段之间循环，并通过称为“灾变”和“救援”的事件在两种状态之间转换7。细胞内微管的动态行为受到多种微管相关蛋白（MAPs）的调控，这些蛋白可调节微管聚合与解聚的速率，以及灾变和救援事件的发生频率。由于光学显微镜在空间分辨率上的局限性，尤其是在微管密度较高的区域，研究MAPs在细胞内空间邻近微管阵列上的作用具有挑战性。此外，同一细胞区域内存在多种MAPs也阻碍了细胞生物学研究结果的准确解读。体外重建实验结合全内反射荧光（TIRF）显微镜技术，可规避上述难题，从而研究特定MAP亚群如何调控邻近微管阵列动态的分子机制。本文通过在受控条件下加入一种或多种重组MAP蛋白，检测体外组装的微管动态行为8,9,10。然而，传统的重建实验通常仅针对单根微管或单一类型的阵列进行，因而无法实现对共存微管群体的可视化观察。
本文介绍了一种&#160;体外重建实验方法，可在相同的溶液条件下同时观察两种微管群体11。我们描述了一种方法，用于在同一根微管以及由有丝分裂纺锤体相关蛋白PRC1交联形成的微管束上，同时观察多种微管相关蛋白（MAPs）的集体活性&#160;&#160;&#160;。蛋白PRC1优先结合于反向平行微管之间的重叠区域，从而将其交联9。该实验方案主要包括以下步骤：（i）储备液和试剂的配制；（ii）清洗并处理用于构建显微成像室的盖玻片表面；（iii）制备稳定的微管“种子”&#34;&#34;，作为实验中微管聚合的起始核心；（iv）设定TIRF显微镜参数以观察微管动态；（v）在成像室内固定微管种子，并生成由PRC1交联的微管束；（vi）在加入可溶性微管蛋白、MAPs和核苷酸后，通过TIRF显微镜实时观察成像室中微管的动态行为。该实验方法可用于对MAPs的定位及其对两类微管群体动态影响进行定性评估和定量分析。此外，该方法还可在多种实验条件下，评估多种MAPs对微管群体的协同作用。

<table><tbody><tr><td>(&amp;plusmn;)-6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-羧酸（Trolox）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>238813</td><td></td></tr><tr><td>1,4-哌嗪二乙磺酸（PIPES）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6757</td><td></td></tr><tr><td>18x18 mm #1.5 盖玻片&amp;nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>63787</td><td></td></tr><tr><td>2-巯基乙醇（BME）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M-6250</td><td></td></tr><tr><td>24x60 mm #1.5 盖玻片</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>63793</td><td></td></tr><tr><td>405/488/560/647 nm 激光四通道滤光片&amp;nbsp;</td><td>Chroma</td><td>TRF89901-NK</td><td></td></tr><tr><td>丙酮</td><td>Sigma Aldrich</td><td>320110</td><td></td></tr><tr><td>腺苷-5'-三磷酸二钠盐水合物（ATP）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7699-5G</td><td></td></tr><tr><td>亲和素，NeutrAvidin&amp;reg; 生物素结合蛋白（Molecular Probes&amp;reg;）</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>A2666</td><td></td></tr><tr><td>超声清洗仪：Branson 2800 Cleaner</td><td>Branson</td><td>CPX2800H</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Coulter 聚碳酸酯厚壁管，11 x 34 mm</td><td>Beckman-Coulter&amp;nbsp;</td><td>343778</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Coulter 聚碳酸酯厚壁管，8 x 34 mm</td><td>Beckman-Coulter&amp;nbsp;</td><td>343776</td><td></td></tr><tr><td>生物素-PEG-SVA，分子量 5,000</td><td>Laysan Bio</td><td>#Biotin-PEG-SVA-5000</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>2905</td><td></td></tr><tr><td>过氧化氢酶</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C40</td><td></td></tr><tr><td>Corning LSE 小型微型离心机，AC100-240V</td><td>Corning</td><td>6670</td><td></td></tr><tr><td>精密操作擦拭纸</td><td>Kimtech</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>二硫苏糖醇（DTT）</td><td>GoldBio</td><td>DTT10</td><td></td></tr><tr><td>发射滤光片</td><td>Chroma</td><td>ET610/75m</td><td></td></tr><tr><td>乙醇（200 证明）</td><td>Decon Labs</td><td>2705</td><td></td></tr><tr><td>乙二醇四乙酸（EGTA）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>3777</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖氧化酶</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G2133</td><td></td></tr><tr><td>GMPCPP</td><td>Jena Bioscience&amp;nbsp;</td><td>NU-405</td><td></td></tr><tr><td>鸟苷-5'-三磷酸钠盐水合物（GTP）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>Hellmanex III 清洗剂&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z805939</td><td></td></tr><tr><td>浸油，A型</td><td>Fisher Scientific</td><td>77010</td><td></td></tr><tr><td>κ-酪蛋白</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0406</td><td></td></tr><tr><td>羊毛脂</td><td>Fisher Scientific</td><td>S25376</td><td></td></tr><tr><td>镜头清洁纸</td><td>ThorLabs</td><td>MC-5</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁（MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>甲基纤维素</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M0512</td><td></td></tr><tr><td>Microfuge 16 台式离心机</td><td>Beckman-Coulter&amp;nbsp;</td><td>A46474</td><td></td></tr><tr><td>显微镜载玻片，钻石白玻璃，25 x 75 mm，90&amp;deg; 磨边，白色磨砂</td><td>Globe Scientific</td><td>1380-50W</td><td></td></tr><tr><td>mPEG-琥珀酰亚胺基戊酸酯，分子量 5,000&amp;nbsp;</td><td>Laysan Bio</td><td>#NH2-PEG-VA-5K</td><td></td></tr><tr><td>Optima&amp;trade; Max-XP 台式超速离心机</td><td>Beckman-Coulter&amp;nbsp;</td><td>393315</td><td></td></tr><tr><td>石蜡</td><td>Fisher Scientific</td><td>P31-500</td><td></td></tr><tr><td>PELCO 反向（自闭合）精细镊子</td><td>Ted Pella</td><td>5377-NM</td><td></td></tr><tr><td>白凡士林</td><td>Fisher Scientific</td><td>18-605-050</td><td></td></tr><tr><td>等离子清洗仪，115V</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-001</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钾（KOH）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>221473</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Thermal-Lok 单孔干式恒温器</td><td>USA Scientific</td><td>2510-1101</td><td></td></tr><tr><td>适用于 1.5 和 2.0 mL 管的 Thermal-Lok 模块</td><td>USA Scientific</td><td>2520-0000</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific&amp;trade; Pierce&amp;trade; Bond-Breaker&amp;trade; TCEP 溶液，中性 pH；500 mM</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>PI-77720</td><td></td></tr><tr><td>TIRF 100X NA 1.49 油镜物镜</td><td>Nikon</td><td>CFI Apochromat TIRF 100XC Oil</td><td></td></tr><tr><td>TIRF 显微镜</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti</td><td></td></tr><tr><td>TLA 120.1 转子</td><td>Beckman-Coulter&amp;nbsp;</td><td>362224</td><td></td></tr><tr><td>TLA 120.2 转子</td><td>Beckman-Coulter&amp;nbsp;</td><td>357656</td><td></td></tr><tr><td>微管蛋白（&gt;99% 纯度）：猪脑来源</td><td>Cytoskeleton</td><td>T240</td><td></td></tr><tr><td>生物素标记微管蛋白：猪脑来源</td><td>Cytoskeleton</td><td>T333P</td><td></td></tr><tr><td>荧光标记微管蛋白（HiLyte 647）：猪脑来源</td><td>Cytoskeleton</td><td>TL670M</td><td></td></tr><tr><td>荧光标记微管蛋白（X-罗丹明）：牛脑来源</td><td>Cytoskeleton</td><td>TL620M</td><td></td></tr><tr><td>VECTABOND&amp;reg; 试剂，组织切片粘附剂</td><td>Vector Biolabs</td><td>SP-1800-7</td><td></td></tr><tr><td>VWR&amp;reg; 便携式培养箱，120V，50/60Hz，0.6A</td><td>VWR</td><td>97025-630</td><td></td></tr></tbody></table>

同时可视化交联微管与单体微管的动力学行为 体外 通过全内反射荧光显微镜

Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

微管是由αβ-微管蛋白异源二聚体聚合而成的多聚体，在细胞内组装成不同的结构。基于微管的结构和网络通常包含具有不同动态特性的微管阵列亚群。例如，在分裂期细胞中，稳定的交联微管束与动态的非交联微管在空间上紧密共存。基于全内反射荧光显微镜（TIRF显微镜）的 体外 重组研究能够同时可视化这些不同微管阵列的动力学行为。在该实验中，构建一个成像腔室，其中表面固定的微管以单根纤维形式存在，或被交联成有序结构&#160;束。通过引入微管蛋白、核苷酸和蛋白质调节因子，可直接观察相关蛋白以及单根和交联微管的动力学特性。此外，还可实时监测动态的单根微管组装成束过程中的变化。本文所述方法可在相同实验条件下，系统评估单个蛋白质的活性与定位，以及蛋白质调节因子对两种不同微管亚群的协同作用，从而提供其他方法无法获得的机制性见解。

上述实验使用了647 nm荧光标记的生物素化微管、560 nm荧光标记的非生物素化微管以及560 nm荧光标记的可溶性微管蛋白混合物。微管通过交联蛋白PRC1（GFP标记）进行交联。在表面固定形成微管束和单根微管后（步骤5.11），将成像腔室安装于配备100X 1.49 NA油镜的TIRF显微镜上，并在560 nm和647 nm荧光通道下进行观察。单根微管通过其在647 nm通道中的荧光信号进行识别。在两个通道中均显示荧光信号的微管被认定为预先形成的微管束（图4）。若实验中使用的生物素化与非生物素化微管带有相同的荧光标记，则检测到的微管束荧光强度约为单根微管的两倍或更高。根据各群体的比例与密度，可优化步骤5.6和5.10中微管成核种子的浓度。
<img alt="种子的荧光标记；显微镜图像；生物素化与非生物素化；合并图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63377/63377fig04.jpg" data-a...

此处基于TIRF显微镜的 体外 介绍了一种重建实验方法，可同时定量并比较两种微管群体的动力学。该方法能够同时观察多种微管相关蛋白在交联的微管束和单根微管上的集体活性。

微管是由αβ-微管蛋白异源二聚体聚合而成的多聚体，在细胞内组装成特定结构。基于微管的结构和……

细胞微管阵列包含具有不同动态特性的微管亚群，以满足其功能需求。本方案阐述了调控因子的协同作用如何赋予邻近微管亚群以独特性质。这种自下而上的重建实验使我们能够同时观察单根微管和微管束等邻近微管群体的组织结构与动态行为，并解析其自组织背后的机制。多组分重建需要在保持各组分活性的同时，优化pH、离子强度和蛋白质浓度等实验参数。在进行多蛋白检测之前，对各个组分进行系统性分析极为重要。首先，将4.5微升BRB ADDTT与1微升微管溶液混合，用移液器将其滴加到显微镜载玻片上。用 18 × 18 毫米的盖玻片覆盖，并用透明指甲油或 VALAP 封片剂密封边缘。将 TIRF 物镜置于盖玻片下方。在明亮混合液中，根据荧光标记的微管蛋白选择合适的激发波长，观察新聚合的微管，以确定后续实验中微管的稀释比例。根据实验经验确定激光强度，确保所有荧光蛋白均被激发，但在实验过程中不会发生明显的光漂白。将显微镜温度设置为28摄氏度以观察动态微管。使用镜头纸蘸取70%乙醇清洁100倍物镜。根据待成像的荧光通道，选择最佳的滤光片组和发射滤光片组合。设置成像序列。对于一项包含647纳米荧光染料标记的生物素化微管、可溶性微管蛋白中560纳米荧光染料标记的非生物素化微管以及GFP标记的目标蛋白的实验，每10秒对488纳米、560纳米和647纳米通道进行一次成像，持续20分钟。在添加可溶性微管蛋白和微管相关蛋白之前，为束状结构采集参考图像，设置一个包含560纳米和647纳米波长通道各一幅图像的序列。检查显微镜上方天花板上激光束的位置，并使用软件调整光束。确保激光照明器已对准。成像前，在物镜上滴加一滴显微镜浸油。将可溶性微管蛋白混合物置于冰上制备，并离心混合物。为通过生物素-NeutrAvidin-生物素连接固定微管，首先将约7.5微升NeutrAvidin溶液注入流动池直至充满，并孵育5分钟。用10 µL MB冷液清洗。加入7.5 µL封闭蛋白KC，孵育2分钟。用10 µL MB温液清洗，以准备上样微管。将生物素标记的微管蛋白储备液用BRB ADDTT稀释，取一微升该稀释液加入九微升预热的MB缓冲液中。将混合液注入反应室，孵育10分钟。用十微升预热的MB缓冲液洗去未固定的微管蛋白。将7.5微升预热的KC缓冲液注入腔室，孵育2分钟。孵育期间，配制含有2纳摩尔浓度交联剂或蛋白PRC1的KC溶液，并离心该溶液。随后将10微升该溶液注入成像腔室，孵育5分钟。制备微管束时，将10微升非生物素标记的微管注入反应腔，孵育10分钟。随后用10微升温热的MB缓冲液洗涤反应腔两次。在10分钟孵育期间，准备含有目标蛋白、可溶性微管蛋白、核苷酸、氧气清除剂和抗氧化剂的10微升反应混合液，并进行离心。将混合物置于冰上。将固定在载物片架上的成像腔室置于100X TIRF物镜下。使用560纳米和647纳米通道寻找一个视野，其中含有适量且密度适宜的单根微管及微管束。确定视野后，拍摄参考图像。小心地将检测混合物注入成像室，避免扰动成像室。使用VALAP密封剂密封成像室的开放两端。观察微管并开始成像序列。在固定微管成核点并形成束状结构后，获取荧光图像。单个微管通过647纳米通道中的荧光信号进行识别，而当结构在两个通道中均显示荧光信号时，则被识别为预先形成的微管束。在存在KIF4A和CLASP1蛋白的情况下，研究了单个微管以及PRC1交联微管束的动力学，结果显示单个微管在实验过程中持续延长，而交联微管的生长则受到抑制。注意保持聚合后的微管处于室温或更高温度；可溶性微管蛋白应置于冰上，并避免成像腔室及荧光标记的微管和蛋白暴露于光照下。这些实验为有丝分裂纺锤体上的一种蛋白质模块如何差异性地调控共存于纺锤体中的两种不同微管群体的动态变化提供了机制性见解。

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Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

通过TIRF显微镜 在体外 同时可视化交联和单微管的动力学

蛋白质在质膜内或细胞内特定位置的区室化分布是一种重要的调控机制，可显著影响信号转导的结果；因此，要理解信号转导过程，研究相关蛋白质在空间和时间上的动态行为至关重要。本文介绍了一种基于全内反射荧光（TIRF）显微镜的系统，用于研究T细胞中的信号转导，该系统也具有广泛的适用性。...

一种用于实时同步成像T细胞受体及其相关信号蛋白的TIRF显微镜技术

全内反射荧光（TIRF）显微镜是一种强大的技术，可用于高对比度和高时间分辨率地观察靠近细胞表面的结构。我们展示了如何利用TIRF研究细胞壁包被的细菌和真菌细胞皮层中的蛋白质动态。...

使用全内反射荧光显微镜观察微生物皮层结构与动态

本视频介绍了TIRF技术，这是一种基于全内反射显微镜的方法，用于观察肌动蛋白和微管聚合的动态过程。该方法能够实现对肌动蛋白与微管偶联动态的高分辨率实时成像，对于理解细胞间相互作用至关重要。...

利用TIRF显微镜观察肌动蛋白与微管耦联动力学

在本视频中，我们介绍了干涉反射显微镜（IRM）技术，用于在适当缓冲液存在下，对盖玻片表面生长的微管进行可视化观察。当入射光照射时，盖玻片-缓冲液界面和缓冲液-微管界面均会反射光线，这些反射光相互叠加形成干涉图样，从而能够在明亮背景上以高对比度图像清晰显示微管结构。...

无需标记的微管动力学干涉反射显微成像

网格蛋白介导的内吞作用是一种快速且高度动态的过程，可将多种蛋白质（包括信号受体）内化。本文所述的实验方案可直接可视化单个内吞事件的动力学过程。这对于理解内吞机制核心组分之间如何相互协调，以及蛋白质货物如何影响该过程至关重要。...

通过全内反射荧光显微镜以单事件分辨率可视化G蛋白偶联受体的网格蛋白介导的内吞作用

芽殖酵母是研究微管动态的有利模型 体内 由于其强大的遗传学特性和微管细胞骨架的简单性。以下实验方案描述了如何转化和培养酵母细胞，获取共聚焦显微镜图像，以及在活体酵母细胞中对微管动态进行定量分析。...

高分辨率成像与分析酿酒酵母中单个星体微管的动力学行为

将介绍一种先进的显微镜，该显微镜能够对分离的质膜及其周围的细胞内体积进行快速且高分辨率的成像。将转盘共聚焦显微技术与全内反射荧光显微技术集成于同一系统，可实现高达每3.5秒获取一幅图像堆栈的高速活细胞成像实验。...

利用先进的转盘-全内反射荧光显微镜技术可视化细胞中的黏附形成

本方案旨在指导如何在标准荧光显微镜上实施干涉反射显微技术，用于体外表面实验中对微管进行无标记、高对比度、高速成像。...

无标记、高速微管成像的干涉反射显微镜技术实现

我们介绍一种实验方案，可同时实现干涉反射显微镜与全内反射荧光显微镜，用于动态微管及荧光标记的微管相关蛋白的同步成像。...

同时干涉反射与全内反射荧光显微镜技术用于成像动态微管及其相关蛋白

此处，我们介绍一种微管束的重建方案 体外...

直接测量重建的活性微管束内部作用力

本方案旨在通过可视化动态微丝和微管提供操作指南 体外 全内反射荧光（TIRF）显微镜检测...

可视化肌动蛋白与微管耦合动力学 体外 通过全内反射荧光（TIRF）显微镜技术

了解利用TIRF显微镜在体外同时可视化单微管和交联微管束动力学的方法。该技术可定量比较不同微管亚群的动态特性，揭示微管相关蛋白的集体活性机制。

同时可视化交联微管与单体微管的动力学行为体外通过全内反射荧光显微镜

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同时可视化交联微管与单体微管的动力学行为 体外 通过全内反射荧光显微镜

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