通过TIRF显微镜 在体外 同时可视化交联和单微管的动力学

细胞微管阵列包含具有功能所需的不同动态特性的微管亚群。该协议解决了调节器的集体活动如何赋予近端微管亚群具有不同特性。这种自下而上的恢复测定使我们能够同时可视化近端微管群体（如单个微管和束）的组织和动态，并破译其自组织背后的机制。

多组分重构需要优化pH、离子强度和蛋白质浓度等实验参数，同时保持每个参数的活性。在多蛋白测定之前对单个组分进行系统分析非常有帮助。首先，将4.5微升BRB ADDTT的混合物在一微升微管溶液中移液到显微镜载玻片上。

用 18 x 18 毫米的盖玻片盖住，并用透明指甲油或 VALAP 密封剂密封边缘。将 TIRF 物镜放在盖玻片下方。在适合明亮混合物中荧光标记的微管蛋白的波长处可视化新聚合的微管，以确定在即将到来的实验中使用微管的稀释度。

根据经验确定实验的激光强度，使得所有荧光蛋白都被照亮，但在实验的时间过程中不会经历显着的光漂白。将显微镜温度设置为28摄氏度以查看动态微管。使用镜头纸用70%乙醇清洁100倍物镜。

使用滤光片立方体和发射滤光片的最佳组合，具体取决于要成像的荧光通道。设置成像序列。对于使用647纳米荧光团标记的生物素化微管，可溶性微管中的560纳米荧光团标记的非生物素化微管和感兴趣的GFP标记的蛋白质的实验，每10秒对488纳米，560纳米和647纳米通道进行成像，持续20分钟。

为了在加入可溶性微管蛋白和微管相关蛋白之前捕获束的参考图像，在560纳米和647纳米波长通道中建立一个具有一个图像的序列。检查激光束在显微镜上方天花板上的位置，并使用软件对光束进行更改。确保激光照明器对齐。

在成像之前，向物镜中加入一滴显微镜浸没油。准备可溶性微管蛋白混合物，同时将其保持在冰上并向下旋转混合物。为了通过生物素 - NeutrAvidin -生物素连接固定微管，首先在大约7.5微升的NeutrAvidin溶液中流动，直到腔室充满并孵育五分钟。

用10微升MB冷水洗涤。在7.5微升的封闭蛋白KC中流动并孵育2分钟。用10微升MB温水洗涤，以准备引入微管的腔室。

稀释BRB ADDTT中生物素化微管的储备，并将该稀释液的一微升加入九微升MB温热。将混合物倒入腔室并孵育10分钟。用10微升MB温洗掉未固定的微管。

将7.5微升温的KC流入腔室并孵育两分钟。在孵育过程中，在KC中制备交联或蛋白质PRC1的两纳摩尔溶液并向下旋转溶液。将10微升该溶液流入成像室并孵育5分钟。

要制成束，将10微升非生物素化微管流入腔室并孵育10分钟。用10微升MB温温洗涤腔室两次。在10分钟的孵育时间内，制备含有目标蛋白质，可溶性微管蛋白，核苷酸，除氧剂和抗氧化剂的10微升测定混合物并将其旋转下来。

将混合物放在冰上。将准备好的成像室装入胶带到100X TIRF物镜上的载玻片支架上。使用 560 纳米和 647 纳米通道查找包含单个微管和束的最佳数量和密度的视场。

确定视野后，拍摄参考图像。小心地在测定混合物中流动，而不会干扰成像室。用 VALAP 密封剂密封腔室的开口端。

观察微管并开始成像序列。固定微管种子并产生束后，获得荧光图像。单个微管通过647纳米通道中的荧光信号进行鉴定，而当微管在两个通道中显示荧光信号时，微管被鉴定为预制束。

在KIF4A和CLASP1等蛋白存在下研究了单个微管和PRC1交联束的动力学，结果表明单个微管在测定过程中伸长，而交联微管的生长停滞。小心将聚合微管保持在室温或室温以上。将可溶性微管蛋白保持在冰上，并保护成像室和荧光标记的微管和蛋白质免受光照。

这些测定提供了在有丝分裂纺锤体中发现的蛋白质模块如何不同地调节在纺锤体中共存的两个不同微管群体的动力学的机制见解。