Name: 使用非放射性铁同位素定量体内通过小鼠胎盘的铁转运 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: 学习使用非放射性铁-58同位素定量小鼠妊娠期间胎盘铁转运的方法。该技术通过ICP-MS检测稳定同位素，可安全追踪铁在母体与胎儿组织中的分布，为研究孕期铁代谢提供新工具。

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作者感谢加州大学洛杉矶分校（UCLA）纳米系统研究所（CNSI）内加州大学纳米技术环境影响中心（UC Center for Environmental Implications of Nanotechnology）的ICP-MS设施，为优化58Fe测定方案提供了支持。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）糖尿病与消化及肾脏疾病国家研究所（NIDDK）（项目编号K01DK127004，授予VS）以及美国国立卫生研究院儿童健康与人类发展国家研究所（NICHD）（项目编号R01HD096863，授予EN）资助。

所有动物实验方案和实验操作均经加州大学洛杉矶分校机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准。
1. 58Fe-Tf 的制备
注意：本方案使用 58Fe；然而，57Fe 也可采用完全相同的方案。任一核素均可作为常规铁化学试剂使用和处置，无需额外防护措施。
<ol>
	<li>将58Fe溶解于12 N HCl中，每毫克58Fe使用50 µL HCl。
	<ol>
		<li>将HCl加入供应商提供的玻璃小瓶中的金属中，并松松地盖上盖子。为溶解铁，将58Fe/HCl溶液在60 °C下加热1小时。若仍未完全溶解，将溶液在通风橱中室温下静置过夜以完成溶解。 
		注意：58Fe/HCl溶液溶解后呈黄橙色。 
		Fe3O4(s) + 8HCl(aq) → Fe(II)Cl2(aq) + 2Fe(III)Cl3(aq) + 4H2O</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将残留的Fe(II)Cl2氧化，以生成Fe(III)Cl3溶液。
	<ol>
		<li>将58Fe/HCl溶液在60 °C下加热，并打开盖子以促进氧化。</li>
		<li>每50 µL 58Fe/HCl溶液中加入1 µL 35% H2O2，以进一步促进氧化。 
		Fe(II)Cl2(aq) + O2 + 4HCl → 4Fe(III)Cl3(aq) + 2H2O</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备三氯化铁（58Fe(III)Cl3）溶液。
	<ol>
		<li>将三氯化铁溶液在通风橱中60 °C下敞口放置，以蒸发样品。 
		注意：蒸发过程可能需要一至数天。</li>
		<li>用超纯H2O将58Fe(III)Cl3重新溶解至100 mM，并根据步骤1.1中使用的初始金属质量计算所需超纯H2O的体积（58Fe(III)Cl3的分子量为162.2）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过将58Fe(III)Cl3与NTA在20 mM NaHCO3存在下以1:5的摩尔比孵育，制备58Fe(III)-次氮基三乙酸盐（NTA）。
	<ol>
		<li>用1 N NaOH配制500 mM NTA溶液。</li>
		<li>配制5倍转铁蛋白加载缓冲液（0.5 M HEPES，pH 7.5；0.75 M NaCl）。</li>
		<li>用超纯H2O配制1 M NaHCO3溶液。</li>
		<li>向一个15 mL锥形管中加入150 µL 100 mM 58Fe(III)Cl3溶液（来自步骤1.3.2）、150 µL用1 N NaOH配制的500 mM NTA溶液、480 µL超纯H2O、200 µL 5倍转铁蛋白加载缓冲液和20 µL 1 M NaHCO3溶液。</li>
		<li>在室温下孵育混合物5分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用58Fe(III)-NTA加载脱铁转铁蛋白（apo-Tf），形成58Fe-Tf。 
	注意：本方案改编自McCarthy和Kosman28。
	<ol>
		<li>将500 mg apo-Tf溶解于4 mL 1倍Tf加载缓冲液中。</li>
		<li>向步骤1.4.4中的15 mL锥形管（含1 mL 58Fe(III)-NTA溶液）中加入4 mL apo-Tf溶液。 
		注意：此为58Fe-NTA与apo-Tf的3:1摩尔比。每个转铁蛋白含有2个铁结合位点；加入过量58Fe-NTA以确保转铁蛋白完全加载。</li>
		<li>为实现58Fe-NTA在apo-Tf上的最大加载量，检查溶液pH是否为7.5，必要时用NaHCO3或HCl调节pH。</li>
		<li>在室温下孵育2.5小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>去除未结合的过量58Fe(III)-NTA及释放的NTA。
	<ol>
		<li>将58Fe-Tf溶液转移至分子量截留柱（截留分子量30 kDa），在室温下以2,500 × g离心15分钟。</li>
		<li>用10 mL 1倍转铁蛋白加载缓冲液洗涤柱子，并在室温下以2,500 × g离心15分钟。重复洗涤和离心步骤，再用10 mL生理盐水进行盐洗，并在室温下以2,500 × g离心15分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>计算58Fe-Tf的浓度。 
	注意：由于在步骤1.5.2中加入了过量58Fe，可假设所有转铁蛋白均为双铁形式。由于使用了500 mg apo-Tf，因此在步骤1.5.4中约生成了500 mg 58Fe-Tf。
	<ol>
		<li>测量步骤1.6.2盐洗后离心回收的液体体积。</li>
		<li>用500 mg除以回收体积，以确定58Fe-Tf溶液的浓度（单位为mg/mL）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用0.22 µm注射器滤器对58Fe-Tf溶液进行除菌；储存于4 °C，待用时取出。 
	注意：58Fe-Tf溶液在制备后1至4周内使用。</li>
</ol>
2. 设置定时小鼠妊娠
<ol>
	<li>使用6至8周龄的雌性小鼠。在交配前2周将动物置于低铁饮食（4 ppm铁）或标准饲料（185 ppm铁）中，并在整个妊娠期间维持相应的饮食。</li>
	<li>选项01：通过E7.5时的体重增加确认妊娠。
	<ol>
		<li>设置多个繁殖笼。每笼中将2只雌鼠与1只雄鼠过夜合笼；次日将动物分开的当天记为胚胎发育第（E）0.5天。在E7.5时称量雌鼠体重以判断是否妊娠。对未增重的雌鼠再次与雄鼠交配。 
		注意：在野生型C57BL/6小鼠中，E7.5时体重增加1 g是妊娠的良好指标。该方法可确保所有在同一批次交配期间成功妊娠的动物其着床时间处于一个特定的16小时时间窗内，从而实现同步处理。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>选项02：通过阴栓检查确认妊娠。
	<ol>
		<li>将2只雌鼠与1只雄鼠合笼，并每日进行阴栓检查以确定是否发生交配。 
		注意：该方法可能导致妊娠时间不一致，且出现阴栓并不能保证一定妊娠。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 对E17.5天孕鼠静脉注射58Fe-Tf
<ol>
	<li>准备 58步骤1.8中用于注射的Fe-Tf。
	<ol>
		<li>准备 5835 mg/mL 生理盐水中的 Fe-Tf 溶液；注射 100 µL 每只小鼠</li>
		<li>用胰岛素注射器吸取 100 µL 的 58Fe-Tf 溶液 
		注意：每剂含有 3.5 mg 人源 58Fe-Tf（5 µg 的 58Fe</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用异氟烷麻醉怀孕小鼠。
	<ol>
		<li>使用带有麻醉室的异氟烷调节器。</li>
		<li>使用以下设置：5% 异氟烷，2 L/mL 氧气2，2 分钟</li>
		<li>通过轻捏小鼠脚趾并观察其是否无反应来确认小鼠是否已麻醉。</li>
		<li>将眼用润滑剂涂抹于小鼠眼球表面，并将小鼠置于加热垫上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>缓慢而小心地注射 58将 Fe-Tf 溶液注入眶后静脉窦。</li>
	<li>让小鼠从麻醉中恢复；在动物恢复足够的意识以维持胸卧位之前，不得离开动物无人看管。</li>
	<li>注射后6小时，通过过量异氟烷使E17.5孕鼠安乐死。
	<ol>
		<li>通过心脏穿刺对小鼠进行放血，作为二次安乐死的方法。</li>
		<li>用针固定双脚以保持稳定。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>收集胎盘和胚胎肝脏。
	<ol>
		<li>使用无菌镊子和解剖剪，小心地从怀孕小鼠体内取出子宫。剪下一个胎盘-胎儿单位，该单位包含一个完整的胎儿和胎盘，连同其所在的羊膜囊及部分子宫组织。</li>
		<li>小心切开子宫和羊膜囊，避免扰动胎儿和胎盘。</li>
		<li>剥离羊膜囊，取出胎儿和胎盘。</li>
		<li>剪断脐带。</li>
		<li>用干净的擦拭纸轻轻吸干胎儿和胎盘表面，以去除多余的羊水。</li>
		<li>记录整个胎盘的重量。</li>
		<li>用剃刀片将每个胎盘切成两半，分别放入2.0 mL离心管中，并在液氮中速冻。 
		注意：由于 58Fe无需特殊的处理注意事项和处置，可将一半的胎盘用于 58铁含量测定，另一半用于其他分析，包括通过蛋白质印迹法和qPCR检测转铁蛋白受体（TFR1）和铁转运蛋白（FPN）的表达。</li>
		<li>为收集胚胎肝脏，处死胚胎：使用剃须刀片迅速切断胚胎头部。 
		注意：在E17.5时，必须对子宫内的所有胚胎逐一实施安乐死，即使这些胚胎未用于研究。</li>
		<li>固定胚胎以保持稳定，暴露腹部区域。</li>
		<li>使用解剖剪在脐带附着处做一个小切口，将解剖剪的一端插入切口，沿中线平面朝冠状面方向剪开约¼英寸。然后，进行横断面剪切以暴露胎儿肝脏。</li>
		<li>使用镊子取出胎肝。</li>
		<li>记录整个胚胎肝脏的重量。</li>
		<li>将整个胚胎肝脏放入2 mL离心管中，置于液氮中速冻。 
		注意：也可仅使用胚胎肝脏的一部分进行 58如需进行额外分析，可测定铁含量。使用2.0 mL离心管比1.5 mL离心管更有利于组织匀浆。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将组织在 -80°C 下无限期保存80 °C.</li>
</ol>
4. 通过 ICP-MS 对组织进行定量铁分析的处理
<ol>
	<li>处理胎盘和胎肝以进行定量分析 非血红素铁.
	<ol>
		<li>解冻胎盘半块组织及整个胎肝，并称量胎盘半块组织的质量（胎肝质量的记录方法见步骤3.6.12）。</li>
		<li>添加 400 µL 0.53 N HCl，5.3% TCA 的蛋白质沉淀溶液</li>
		<li>使用电动匀浆器匀浆组织。</li>
		<li>将样品在指定条件下孵育 100 °C 1小时。</li>
		<li>将样品置于室温水中冷却 2 min。</li>
		<li>打开管盖以释放压力，然后再次盖紧管子。</li>
		<li>在 17,000 × g 室温下离心10分钟以沉淀组织碎片。</li>
		<li>小心地将上清液转移至一个新的已标记试管中。</li>
		<li>将样品送检进行ICP-MS分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>处理胎盘和胎肝以进行定量分析 血红素铁. 
	注意：在步骤1提取非血红素铁后，沉淀物中剩余的铁主要为血红素铁。
	<ol>
		<li>记录第4.1.7步中每个沉淀物的重量。</li>
		<li>将沉淀物在10 mL浓硝酸（70%）中消解3 添加1 mL 30% H2O2 
		注意：请与ICP-MS核心实验室或中心协商，以优化HNO₃的使用体积。3 对于特定研究，体积将部分取决于样品重量。</li>
		<li>将样品加热至 200 °C 15分钟。</li>
		<li>将样品送检进行ICP-MS分析。 
		注意：如果无需区分血红素铁与非血红素铁来源，仅需测定总铁含量，则可将全组织在 HNO₃ 中直接消化。3 作为第一步。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 数据分析
注意：ICP-MS 提供的数据为 56Fe 和 58Fe 的浓度，单位为 ng/mL 或 mg、ppb（表 1）。56Fe 是自然界中含量最丰富的铁同位素，其测量值反映整个妊娠期间铁在胎盘/胚胎中的累积情况，而 58Fe 的测量值则反映注射后 6 小时内转移的铁量。
<ol>
	<li>从测得的 58Fe 值中减去天然丰度的 58Fe（占总铁量的 0.28%）。</li>
	<li>计算胚胎肝脏总非血红素 58Fe。
	<ol>
		<li>首先将第 5.1 步计算得到的铁浓度（ng/mL）乘以第 4.1.2 步初始处理过程中的体积（mL），估算出总 58Fe，从而计算胚胎肝脏总非血红素铁含量（ng）。</li>
		<li>通过将第 3.6.6 步测得的胎盘总重量除以第 4.1.1 步中处理的胎盘重量，计算出整个胎盘的铁含量。将该值乘以第 5.2.1 步计算得到的总非血红素铁（ng），获得胎盘中总非血红素 58Fe 含量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>计算总血红素 58Fe。
	<ol>
		<li>首先将第 5.1 步计算得到的铁浓度（ng/mg）乘以第 4.2.1 步测得的沉淀物重量（mg），计算总血红素 58Fe。</li>
		<li>然后将第 3.5.1 步测得的胎盘总重量除以第 4.2.1 步测得的胎盘沉淀物重量，将该值乘以第 5.3.1 步计算得到的总血红素铁（ng），得到胎盘中总血红素 58Fe 含量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将计算得到的非血红素和血红素 58Fe 值相加，以确定每种组织的总铁含量。</li>
</ol>
<img alt="Fe-Tf 制备、给药、采集及用于 ICP-MS 分析的处理流程示意图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63378/63378fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：实验方案步骤的可视化概要。 (A) 制备 58铁-转铁蛋白。B) 体内 给药 58铁-转铁蛋白。C组织采集与保存。D) 通过ICP-MS定量胎盘和胚胎肝脏中金属物种的处理。缩写：Fe = 铁；NTA = 次氮基三乙酸；Tf = 转铁蛋白；PPS = 蛋白沉淀液；Sup = 上清液；TCA = 三氯乙酸；ICP-MS = 电感耦合等离子体质谱 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63378/63378fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>

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EN 是 Intrinsic LifeSciences 和 Silarus Pharma 的科学联合创始人，并担任 Protagonist、Vifor、RallyBio、Ionis、Shield Therapeutics 和 Disc Medicine 的顾问。VS 声明不存在利益冲突。

铁在许多生物过程中具有重要作用，其在体内的转运和分布具有高度动态性并受到严格调控。稳定铁同位素为评估铁稳态动态提供了可靠且便捷的替代方案，可取代放射性同位素。该实验方案中的关键步骤是准确记录所有组织的重量和体积。铁是一种元素，既不能被合成，也不能被分解。因此，只要仔细记录所有重量和体积数据，即可通过计算精确追踪系统内全部铁的去向。如文中所述，该方法可用于区分血红素铁与非血红素铁来源。然而，若无需区分铁的存在形式，仅需测定总铁含量，则可通过仅使用浓硝酸（HNO3）处理组织来简化实验流程，具体操作如方案第4.2步所述。需要注意的是，若组织在分析前未进行灌注处理，尤其是胎盘等高度血管化的组织，残留血液可能导致组织中血红素铁含量被高估。
选择转铁蛋白结合铁作为研究对象，因为它是胎盘摄取铁的主要来源16,17。在小鼠中全局敲低TFR1会导致胚胎在E12.5之前死亡，表明转铁蛋白结合铁对发育至关重要。其他铁形态，如铁蛋白和非转铁蛋白结合铁...

铁对于多种代谢过程至关重要，包括生长发育、能量生成和氧气运输1。铁稳态的维持是一个动态且协调的过程。铁在十二指肠从食物中被吸收，并与铁转运蛋白转铁蛋白（transferrin, Tf）结合，通过血液循环输送到全身。几乎所有细胞都利用铁参与酶促反应，铁被整合到新生红细胞的血红蛋白中，并由巨噬细胞从衰老的红细胞中回收再利用。当体内铁过量时，铁储存在肝脏中，并通过出血或细胞脱落而丢失。循环中铁的含量取决于铁的消耗与供给之间的平衡，其中铁的供给受到肝脏激素铁调素（hepcidin, HAMP）的严格调控，HAMP是铁稳态的核心调节因子1。铁调素通过封闭铁输出蛋白ferroportin（FPN）或诱导其泛素化并降解，从而限制血液中铁的生物可利用性2。功能性FPN减少会导致膳食铁吸收降低、肝脏中铁的隔离增加以及巨噬细胞中铁的再循环减少1。
铁调素（hepcidin）受铁状态、炎症、促红细胞生成作用以及妊娠的影响（详见文献3综述）。鉴于铁稳态具有高度动态性，了解并测量总铁池、铁的分布与周转至关重要。动物研究传统上依赖放射性铁同位素来测定铁代谢动态，该方法虽然灵敏度高，但操作繁琐。然而，在包括本研究在内的近期研究中4，已采用非放射性的稳定铁同位素（58Fe）来测定妊娠期间的铁转运过程5,6,7,8,9。稳定同位素是研究营养素代谢的有力工具（详见文献10综述）。在人体研究中应用稳定铁同位素已表明：i）铁吸收在妊娠末期增加5,6；ii）膳食铁向胎儿的转运依赖于母体的铁状态7；iii）母体摄入的血红素铁比非血红素铁更容易被胎儿利用8；iv）铁向胎儿的转运与母体铁调素水平呈负相关8,9。这些实验通过检测血清中铁同位素或其在红细胞（RBCs）中的掺入量来评估铁代谢；然而，仅测量掺入红细胞的铁可能低估真实的铁吸收量9。在本研究中，同时检测了组织中血红素铁和非血红素铁的含量。
妊娠期间，铁元素对于支持母体红细胞容量的增加以及通过胎盘向胎儿转运以支持其生长发育至关重要11。胎儿体内的铁储备完全依赖于铁通过胎盘的转运。在人类12和啮齿类动物4,13妊娠期间，铁调素（hepcidin）水平显著下降，从而增加血浆中铁的可利用性，促进其向胎儿的转运。
胎盘铁转运的基本原理最初是在20世纪50至70年代利用放射性示踪剂（59Fe 和 55Fe）进行表征的。这些研究确定，铁通过胎盘的转运是单向的14,15，而转铁蛋白结合双铁（diferric transferrin）是胎盘和胎儿获取铁的主要来源16,17。目前对胎盘铁转运的理解已更为全面，但仍有一些关键的铁转运蛋白和调控机制尚未明确。小鼠模型对于理解铁的调控与转运至关重要18，因为其关键转运蛋白和机制与人类极为相似。人和小鼠的胎盘均为血绒毛膜型（hemochorial），即母体血液直接与胎儿绒毛膜接触19。然而，两者在结构上仍存在一些显著差异。
合体滋养层是胎盘中分隔母体与胎儿血液循环的细胞层，可主动转运铁及其他营养物质20在人类中，合体滋养层为单层融合细胞。相比之下，小鼠胎盘则包含两层合体滋养层。21，Syn-I 和 Syn-II。然而，Syn-I 与 Syn-II 界面处的缝隙连接允许营养物质在两层之间扩散22,23因此，这些细胞层发挥着类似于人类合体滋养层的单一合胞体层功能。Rossant 和 Cross 综述了人类与小鼠胎盘之间的其他相似性与差异。21胎盘铁转运由母体血液中的转铁蛋白结合铁（iron-Tf）与合体滋养层顶膜侧的转铁蛋白受体（TfR1）结合而启动24该相互作用通过网格蛋白介导的内吞作用诱导铁-转铁蛋白/转铁蛋白受体1（iron-Tf/TfR1）内化25铁随后在酸性内体中从转铁蛋白（Tf）释放26，通过一种尚未明确的铁还原酶还原为亚铁离子，并由一种尚未确定的转运蛋白从内体转运至细胞质。铁在合体滋养层细胞内的分子伴侣机制仍有待阐明。最终，铁通过定位于合体滋养层基底侧或面向胎儿侧膜上的铁输出蛋白FPN转运至胎儿侧（详见综述于27).
为了理解转铁蛋白受体1（TfR1）、铁转运蛋白（FPN）和铁调素（hepcidin）的生理与病理调控如何影响胎盘铁转运，研究中采用了稳定铁同位素，以定量测定铁从母体循环向胎盘及胚胎的转运过程体内4。本文介绍了向妊娠小鼠制备和给予同位素标记的转铁蛋白-铁的方法、组织样本的处理以用于电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）分析，以及组织中铁浓度的计算方法。稳定铁同位素的体内应用可被推广至不同动物模型，用于研究生理和病理条件下的铁代谢调控与分布。

<table><tbody><tr><td>58Fe-铁金属</td><td>Trace Sciences International</td><td>Fe-58</td><td></td></tr><tr><td>Amicon ultra-15 离心滤器，30 kDa 截留分子量</td><td>Millipore Sigma</td><td>UFC903024</td><td></td></tr><tr><td>离心管，15 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-49B</td><td></td></tr><tr><td>离心管，50 mL</td><td>Millipore Sigma</td><td>CLS430829</td><td></td></tr><tr><td>离心机，Sorvall Legend Micro 17 微型离心机</td><td>Fisher Scientific</td><td>75002432</td><td></td></tr><tr><td>离心机，Sorvall Legend RT</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>精密操作擦拭纸</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666</td><td></td></tr><tr><td>饲料：缺铁型（4 ppm 铁）</td><td>Envigo Teklad</td><td>TD.80396</td><td></td></tr><tr><td>饲料：标准饲料（185 ppm 铁）</td><td>PicoLab</td><td>5053</td><td></td></tr><tr><td>解剖剪，30 mm 刃口</td><td>VWR</td><td>25870-002</td><td></td></tr><tr><td>镊子，4-1/2 英寸长度</td><td>McKesson</td><td>157-469</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>匀浆器，Bio-Gen PRO200</td><td>PROScientific</td><td>01-01200</td><td></td></tr><tr><td>人脱铁转铁蛋白（apo-Tf）</td><td>Celliance</td><td>4452-01</td><td>已不再供应，替代品：Millipore 616419</td></tr><tr><td>盐酸（HCl）</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144S-500</td><td></td></tr><tr><td>过氧化氢（H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;），35 wt.% 水溶液</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-88216-36</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素注射器，BD Lo-Dose U-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826-79</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>VETone</td><td>502017</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷蒸发器</td><td>Summit Anesthesia Solutions</td><td></td><td></td></tr><tr><td>金属加热块</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>带平头螺旋盖的微量离心管</td><td>VWR</td><td>16466-064</td><td></td></tr><tr><td>微量离心管，1.5 mL 低吸附</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-320</td><td></td></tr><tr><td>微量离心管，2.0 mL 低吸附</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-321</td><td></td></tr><tr><td>Millex-GP 注射式滤器，0.22 &amp;micro;m，聚醚砜材质，33 mm，伽马射线灭菌</td><td>Millipore Sigma</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>次氮基三乙酸（NTA）</td><td>Sigma</td><td>72560-100G</td><td></td></tr><tr><td>针头，25 G × 5/8 英寸，皮下注射通用型</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826AA</td><td></td></tr><tr><td>pH 试纸，塑料包被，pH 5.0–9.0</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-640-519</td><td></td></tr><tr><td>剃须刀片，0.22 mm</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>天平（克级）</td><td>Mettler Toledo</td><td>PB1502-S</td><td></td></tr><tr><td>天平（毫克级）</td><td>Mettler Toledo</td><td>Balance XS204</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠（NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;）</td><td>Sigma</td><td>S5761-500G</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠（NaCl）</td><td>Fisher Scientific</td><td>S671-3</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠（NaOH）</td><td>Fisher Scientific</td><td>SS266-1</td><td></td></tr><tr><td>无菌注射器，滑动接头（1 mL）</td><td>Fisher Scientific</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>三氯乙酸（TCA）</td><td>Fisher Scientific</td><td>A322-500</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;软件&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageLab</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SigmaPlot</td><td>Systat</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

定量测定小鼠胎盘中的铁转运 在体 内 使用非放射性铁同位素

Quantitating Iron Transport Across the Mouse Placenta In Vivo Using Nonradioactive Iron Isotopes

铁对妊娠期间的母体和胎儿健康至关重要，人类维持一次健康妊娠大约需要1克铁。胎儿体内的铁完全依赖于通过胎盘的铁转运，而这种转运过程的紊乱可能导致不良妊娠结局。在小鼠中，传统上测量胎盘铁通量依赖于放射性铁同位素，这种方法虽然灵敏度高，但操作繁琐。稳定铁同位素（57Fe 和 58Fe）为人类妊娠研究提供了非放射性的替代方案。
在生理条件下，转铁蛋白结合铁是胎盘摄取铁的主要形式。因此， 58转铁蛋白-铁通过静脉注射给予妊娠母鼠，以直接评估胎盘铁转运，并规避母体肠道铁吸收这一混杂因素的影响。采用电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）定量胎盘及小鼠胚胎组织中的同位素铁含量。这些方法也可应用于其他生理或疾病动物模型系统中，用于定量分析 体内 铁动态

一项早期研究利用稳定的铁同位素测量铁的转运，结果表明，母体铁缺乏会导致胎盘铁输出蛋白FPN表达下调4。FPN是目前已知唯一的哺乳动物铁输出蛋白，其在胚胎发育过程中的缺失会导致胚胎在E9.5之前死亡29。为了确定FPN表达的降低是否在功能上导致胎盘铁转运减少，研究人员将58Fe-Tf经静脉注射至妊娠母鼠体内，并在母体铁缺乏条件下定量分析了胎盘和胚胎中的铁含量。
为了解母体铁状态如何影响胎盘铁转运，研究人员在小鼠中建立了铁缺乏模型4。雌性 C57BL/6 小鼠在妊娠前及整个妊娠期间均饲喂低铁饮食（4 ppm 铁）或标准饲料（185 ppm 铁），持续 2 周。该饮食方案导致与饲喂标准饲料的小鼠相比，母鼠在 E12.5、E15.5 和 E18.5 时的肝脏非血红素铁、血清铁及血红蛋白水平降低4。在 E18.5 时，来自铁缺乏母鼠的胚胎其肝脏铁含量较低，并表现为低血清铁和贫血，而...

本文演示了如何制备和施用转铁蛋白结合的非放射性同位素铁，用于小鼠妊娠期间铁转运的研究。同时描述了定量胎盘胎儿各部分中同位素铁含量的方法。

铁在妊娠期间对母体和胎儿健康至关重要，人类维持一次健康妊娠大约需要1克铁。胎儿……

该方案具有重要意义，因为它使研究人员能够在无需使用放射性物质的情况下，在活体内追踪和定量铁的分布。由于可在同一样本中同时检测多种稳定的铁同位素，该技术可用于研究来自不同来源的铁的吸收、调控和分布情况。首先，将12 M盐酸加入供应商提供的玻璃小瓶中的铁-58中，并将瓶盖松松盖上。为了溶解铁，将溶液在60摄氏度下加热一小时。如果仍未完全溶解，将溶液在室温下于通风橱中静置过夜以促进溶解。随后，为了制备氯化铁溶液，将溶液加热至60摄氏度并打开瓶盖，以促进残留的氯化亚铁氧化。 每50微升溶液中加入1微升35%过氧化氢，以进一步促进氧化反应。将氯化铁溶液置于60摄氏度的通风橱中，敞口放置以蒸发样品。然后用超纯水将氯化铁重新溶解至100毫摩尔。根据初始金属重量计算所需水量。接下来，通过将制备好的氯化铁溶液与氮川三乙酸在1:5摩尔比下，在20毫摩尔碳酸氢钠存在条件下于室温孵育5分钟，制备1毫升的三价铁氮川三乙酸盐。然后将500毫克去铁转铁蛋白溶解于4毫升转铁与加样缓冲液中，并将4毫升该去铁转铁蛋白溶液加入15毫升离心管中已制备的三价铁氮川三乙酸盐溶液中。为了使硝酸铁-氮川三乙酸络合物最大限度地结合到脱铁转铁蛋白上，请检查溶液 pH 值是否为 7.5，并在必要时用碳酸氢钠或盐酸调节 pH 值。将混合物在室温下孵育 2.5 小时。随后，将铁-58 标记的转铁蛋白溶液转移至分子量截留柱中，通过离心去除未结合的过量硝酸铁-氮川三乙酸络合物以及游离的氮川三乙酸。离心后，加入10毫升转铁蛋白加载缓冲液并离心柱子，重复此步骤两次以洗涤柱子。然后用10毫升生理盐水洗涤柱子，并再次离心。最后，使用0.22微米注射器滤器对铁-58标记的转铁蛋白溶液进行除菌，于4摄氏度保存，直至使用。在生理盐水中配制浓度为 35 毫克每毫升的铁-58 转铁蛋白溶液。然后将麻醉后的妊娠小鼠置于加热垫上，缓慢而小心地将铁-58 转铁蛋白溶液注射至眶后窦。注射后 6 小时，处死小鼠，并使用无菌镊子和解剖剪小心取出子宫。在羊膜囊内连同部分子宫组织一起，切下一个包含单个胎儿和胎盘的胎盘-胎儿单位。接着，小心切开子宫和羊膜囊，注意不要扰动胎儿和胎盘。然后掀开羊膜囊，取出胎儿和胎盘。剪断脐带后，用干净的擦拭纸轻轻吸干胎儿和胎盘表面的多余羊水，并记录整个胎盘的重量。用剃刀片将每个胎盘切成两半。将每半放入一个2 mL离心管中，并在液氮中迅速冷冻。为收集胚胎肝脏，处死胚胎后将其固定，使腹部暴露。使用解剖剪在脐带附着处做一小切口。将解剖剪的一端插入切口，沿正中平面朝冠状面方向剪开约1/4英寸。然后进行横断面切割以暴露胎肝。使用镊子取出胎肝，并记录整个胚胎肝脏的重量。将整个胚胎肝脏放入一个2毫升的离心管中，并在液氮中快速冷冻。将组织在 -80 摄氏度下长期保存。为定量胎盘和胎肝中的非血红素铁，将胎盘半块和完整的胎肝解冻，然后称量胎盘半块的重量。向组织样本中加入 400 µL 蛋白质沉淀溶液，并使用电动匀浆器匀浆组织。将样本在 100 °C 下孵育 1 小时，然后在室温水中冷却 2 分钟。打开管盖以释放压力，然后再次盖紧管子。离心样品使组织碎片沉淀后，小心将上清液转移至新标记的管中，用于ICP-MS分析。接下来定量测定血红素铁，记录离心后所得沉淀物的重量。然后将沉淀物溶于10毫升浓度为70%的浓硝酸中，并加入1毫升30%的过氧化氢。将样品加热至200摄氏度，持续15分钟，随后送样进行ICP-MS分析。ICP-MS 测量可检测两种不同的铁同位素。最丰富的铁同位素铁-56 反映了组织中慢性铁离子的变化。另一种同位素铁-58 则反映了注射铁在体内分布的急性变化。铁-56 测定证实，与铁充足的妊娠相比，铁缺乏妊娠的胚胎肝脏中铁储备减少。铁-58 测定证实，在铁缺乏妊娠中，六小时内转运至胚胎肝脏的铁量少于铁充足妊娠。操作过程中，务必记录组织的重量。这些重量数据对于计算铁浓度是必需的。由于铁-58无需特殊操作防护和处理处置，未处理的组织可用于其他分析，包括但不限于蛋白质印迹（western blotting）或定量PCR（qPCR）。

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科研

JoVE Journal

Biology

生物学

使用非放射性铁同位素定量体内通过小鼠胎盘的铁转运

我们开发了一种新型手术方法，用于将生物活性物质直接注入小鼠胎儿的气管。与常用的羊膜内注射相比，该递送途径在靶向胎儿小鼠肺组织方面效率更高。迄今为止，该操作程序尚未在小鼠模型中报道过。...

一种在胎鼠模型中进行气管内给予生物活性物质的新型外科手术方法

在本视频中，我们介绍一种基于比色法测定小鼠肝组织中非血红素铁含量的方法。在还原剂存在下，以邻菲啰啉磺酸钠作为显色底物，可将三价铁还原为可螯合的二价铁。...

基于浴酚蒽啉磺酸盐的比色法检测：一种简单快速测定小鼠肝组织中非血红素铁含量的方法

利用胎盘评估外源性物质和纳米材料转运速率的方法 离体 人胎盘灌注模型

我们介绍了一种在足月时研究人类胎盘生理学的详细方法。in...

四血管采样法在人类胎盘生理学整合研究中的应用 在体 内

我们介绍一种利用三种方法评估靶向胎盘药物递送安全性和有效性的系统：体内成像用于监测纳米颗粒的聚集，高频超声用于监测胎盘和胎儿发育，高效液相色谱法（HPLC）用于定量组织中的药物递送量。...

综合评估胎盘靶向药物递送的有效性与安全性的三种互补方法

本文介绍了一种离体母胎血管灌注方案，可用于将待测物质注入母体血管系统，以评估外源性颗粒或药理学物质通过胎盘的转运情况，同时研究胎盘生理功能的变化。...

啮齿类动物胎盘的离体灌注

本文提供了一种利用简单且成熟的比色法测定动物组织中非血红素铁含量的实验方案，该方法可在大多数实验室中轻松实施。...

基于浴铜灵的比色法测定组织非血红素铁含量

用于评估铁（Fe）生物可利用度的Caco-2细胞生物测定法是一种经济且用途广泛的手段，可用于评估来自食物、食品制品、补充剂、膳食乃至饮食方案中铁的生物可利用度。该方法已通过与人体研究的充分验证，代表了铁生物可利用性研究领域的先进水平。...

测定食物铁生物利用度的Caco-2细胞生物测定法

我们介绍了一种使用外部软件定量测定肿瘤T2*弛豫时间的标准化方案。通过采集多回波梯度回波图像，并将其输入软件，以生成肿瘤T2*图并测量肿瘤T2*弛豫时间。...

注射氧化铁纳米颗粒后肿瘤T2*弛豫时间的测量

我们描述了一种荧光检测方法，可快速且低成本地验证新化合物是否具有螯合铁的能力。该方法通过检测化合物能否竞争性地取代弱铁螯合荧光探针钙黄绿素（Calcein）与铁的结合，从而在发生螯合反应时产生可量化的荧光增强信号。...

一种可量化且低成本的无细胞荧光方法，用于验证新型化合物的铁螯合能力

本方案介绍了评估组织（尤其是脑组织）中铁沉积分布和含量的方法。方案详细说明了样本制备、普鲁士蓝/DAB染色、图像采集和数据分析的操作步骤。...

通过普鲁士蓝/DAB染色法评估5xFAD小鼠脑内铁沉积

学习使用非放射性铁-58同位素定量小鼠妊娠期间胎盘铁转运的方法。该技术通过ICP-MS检测稳定同位素，可安全追踪铁在母体与胎儿组织中的分布，为研究孕期铁代谢提供新工具。

定量测定小鼠胎盘中的铁转运在体内使用非放射性铁同位素

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