定量测定小鼠胎盘中的铁转运 在体 内 使用非放射性铁同位素

该方案具有重要意义，因为它使研究人员能够在无需使用放射性物质的情况下，在活体内追踪和定量铁的分布。由于可在同一样本中同时检测多种稳定的铁同位素，该技术可用于研究来自不同来源的铁的吸收、调控和分布情况。首先，将12 M盐酸加入供应商提供的玻璃小瓶中的铁-58中，并将瓶盖松松盖上。

为了溶解铁，将溶液在60摄氏度下加热一小时。如果仍未完全溶解，将溶液在室温下于通风橱中静置过夜以促进溶解。随后，为了制备氯化铁溶液，将溶液加热至60摄氏度并打开瓶盖，以促进残留的氯化亚铁氧化。

每50微升溶液中加入1微升35%过氧化氢，以进一步促进氧化反应。将氯化铁溶液置于60摄氏度的通风橱中，敞口放置以蒸发样品。然后用超纯水将氯化铁重新溶解至100毫摩尔。

根据初始金属重量计算所需水量。接下来，通过将制备好的氯化铁溶液与氮川三乙酸在1:5摩尔比下，在20毫摩尔碳酸氢钠存在条件下于室温孵育5分钟，制备1毫升的三价铁氮川三乙酸盐。然后将500毫克去铁转铁蛋白溶解于4毫升转铁与加样缓冲液中，并将4毫升该去铁转铁蛋白溶液加入15毫升离心管中已制备的三价铁氮川三乙酸盐溶液中。

为了使硝酸铁-氮川三乙酸络合物最大限度地结合到脱铁转铁蛋白上，请检查溶液 pH 值是否为 7.5，并在必要时用碳酸氢钠或盐酸调节 pH 值。将混合物在室温下孵育 2.5 小时。随后，将铁-58 标记的转铁蛋白溶液转移至分子量截留柱中，通过离心去除未结合的过量硝酸铁-氮川三乙酸络合物以及游离的氮川三乙酸。

离心后，加入10毫升转铁蛋白加载缓冲液并离心柱子，重复此步骤两次以洗涤柱子。然后用10毫升生理盐水洗涤柱子，并再次离心。最后，使用0.22微米注射器滤器对铁-58标记的转铁蛋白溶液进行除菌，于4摄氏度保存，直至使用。

在生理盐水中配制浓度为 35 毫克每毫升的铁-58 转铁蛋白溶液。然后将麻醉后的妊娠小鼠置于加热垫上，缓慢而小心地将铁-58 转铁蛋白溶液注射至眶后窦。注射后 6 小时，处死小鼠，并使用无菌镊子和解剖剪小心取出子宫。

在羊膜囊内连同部分子宫组织一起，切下一个包含单个胎儿和胎盘的胎盘-胎儿单位。接着，小心切开子宫和羊膜囊，注意不要扰动胎儿和胎盘。然后掀开羊膜囊，取出胎儿和胎盘。

剪断脐带后，用干净的擦拭纸轻轻吸干胎儿和胎盘表面的多余羊水，并记录整个胎盘的重量。用剃刀片将每个胎盘切成两半。将每半放入一个2 mL离心管中，并在液氮中迅速冷冻。

为收集胚胎肝脏，处死胚胎后将其固定，使腹部暴露。使用解剖剪在脐带附着处做一小切口。将解剖剪的一端插入切口，沿正中平面朝冠状面方向剪开约1/4英寸。

然后进行横断面切割以暴露胎肝。使用镊子取出胎肝，并记录整个胚胎肝脏的重量。将整个胚胎肝脏放入一个2毫升的离心管中，并在液氮中快速冷冻。

将组织在 -80 摄氏度下长期保存。为定量胎盘和胎肝中的非血红素铁，将胎盘半块和完整的胎肝解冻，然后称量胎盘半块的重量。

向组织样本中加入 400 µL 蛋白质沉淀溶液，并使用电动匀浆器匀浆组织。将样本在 100 °C 下孵育 1 小时，然后在室温水中冷却 2 分钟。

打开管盖以释放压力，然后再次盖紧管子。离心样品使组织碎片沉淀后，小心将上清液转移至新标记的管中，用于ICP-MS分析。

接下来定量测定血红素铁，记录离心后所得沉淀物的重量。然后将沉淀物溶于10毫升浓度为70%的浓硝酸中，并加入1毫升30%的过氧化氢。将样品加热至200摄氏度，持续15分钟，随后送样进行ICP-MS分析。

ICP-MS 测量可检测两种不同的铁同位素。最丰富的铁同位素铁-56 反映了组织中慢性铁离子的变化。另一种同位素铁-58 则反映了注射铁在体内分布的急性变化。

铁-56 测定证实，与铁充足的妊娠相比，铁缺乏妊娠的胚胎肝脏中铁储备减少。铁-58 测定证实，在铁缺乏妊娠中，六小时内转运至胚胎肝脏的铁量少于铁充足妊娠。操作过程中，务必记录组织的重量。

这些重量数据对于计算铁浓度是必需的。由于铁-58无需特殊操作防护和处理处置，未处理的组织可用于其他分析，包括但不限于蛋白质印迹（western blotting）或定量PCR（qPCR）。