Name: RNA干扰在美洲蟑螂中的应用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: 学习利用RNA干扰技术研究美洲蟑螂的分子机制，通过基因敲低探索其发育、再生及行为调控。该方法适用于非模式生物，为昆虫遗传学研究提供简便有效的实验手段。

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本研究得到国家自然科学基金（项目编号：32070500、31620103917、31330072 和 31572325，授予 C.R.、Sh.L.）、广东省自然科学基金（项目编号：2021B1515020044 和 2020A1515011267，授予 C.R.）、广东省科学技术厅（项目编号：2019B090905003 和 2019A0102006）、广州市科学技术局（项目编号：202102020110）以及深圳市科技计划项目（项目编号：KQTD20180411143628272，授予 Sh.L.）的资助。

P. americana 品系最初由 Dr. Huiling Hao 提供。该物种已通过近交方式维持繁殖30年9。
1. 美洲大蠊（P. americana）的孵化与喂养
<ol>
	<li>采集美洲大蠊（P. americana）的新鲜卵鞘（产卵后立即采集），在25 °C、60%湿度的黑暗培养箱中培养约25天。孵化前3天将温度和湿度&#160;提高至30 °C和75%。</li>
	<li>使用孔径为4 mm的筛子将孵化出的若虫与卵鞘分离。</li>
	<li>将若虫饲养于圆柱形容器（直径12 cm，高10 cm）中，置于28 °C、70%湿度的黑暗环境中。在容器内壁边缘涂抹凡士林，防止蟑螂逃逸。提供大鼠饲料、水和庇护所（蛋托）。注意观察若虫活动情况，并定期清理粪便和杂物。</li>
</ol>
2. 选择合适龄期的若虫
<ol>
	<li>使用玻璃管挑出刚蜕皮的 P. americana （体色为白色）。将它们置于新的容器中，并等待合适的阶段进行处理。 
	&#8203;注意：在上述饲养条件下约19天后，3龄若虫中的rd 蜕皮后的若虫即可用于注射。刚蜕皮的蟑螂体色为白色，若虫的龄期通过蜕皮次数来确定。</li>
</ol>
3. 带有T7启动子的目标片段的制备
<ol>
	<li>以美洲大蠊（P. americana）的cDNA为模板，设计成对引物进行PCR扩增，获得长度为300-800 bp的目标基因DNA片段9。随后将PCR产物克隆至pTOPO载体（见材料表）中进行测序。</li>
	<li>以目标片段DNA为模板，设计一对新的引物，在其5'端加入T7启动子序列（5'-GGATCCTAATACGACTCACTATAGG-3'），再次进行PCR扩增，获得两端均带有T7启动子的目标片段9。</li>
</ol>
4. 转录与dsRNA合成 体外
<ol>
	<li>在反应体系中加入10 µL T7 2X Buffer、2 µL 酶混合物T7 Express（见材料表）和2 µg PCR产物（步骤3.2中获得），用ddH2O补至总体积20 µL。手动轻轻颠倒混匀，37 °C孵育30分钟，70 °C孵育10分钟，然后缓慢冷却至室温。</li>
	<li>用ddH2O按1:200比例稀释RNase A溶液（4 µg/µL）。然后向体系中加入1 µL RQ1无RNase DNase（1 U/µL）和1 µL稀释后的RNase A溶液（见材料表）。 
	注：此时单个反应体系体积为22 µL。</li>
	<li>37 °C孵育30分钟。然后加入总体积10%的乙酸钠（当同时进行N个反应时，总体积为N × 22 µL）和三倍总体积的异丙醇。</li>
	<li>手动轻轻颠倒混匀，冰上放置5分钟，4 °C下以13,000 × g离心10分钟。</li>
	<li>用移液器吸除上清液，用75%乙醇（含25%焦碳酸二乙酯（DEPC）处理水）洗涤沉淀，然后在4 °C下以13,000 × g离心5分钟。</li>
	<li>再次吸除上清液。室温下空气干燥沉淀15分钟。用约100 µL DEPC水溶解双链RNA（dsRNA），然后将dsRNA稀释至终浓度2 µg/µL。 
	&#8203;注：dsRNA可在-80 °C保存6个月。</li>
</ol>
5. 将dsRNA溶液装入注射器
<ol>
	<li>提前在显微注射泵（参见材料表）中设置好程序，以确保每次注射的体积保持一致。使用注射器前，用DEPC水冲洗注射器8–10次，以清洁注射器。</li>
	<li>将10 µL注射器安装到显微注射泵上，启动泵，用10 µL的dsRNA溶液（步骤4.6中制备）充满注射器。向3龄若虫（参见步骤2）注射1 µL dsRNA，并确保溶液未泄漏至体外。</li>
</ol>
6. 向美洲大蠊（P. americana）注射dsRNA
<ol>
	<li>用高浓度的 CO2 麻醉蟑螂2 将蟑螂放入容器中，直至其不再移动，然后立即进行注射。</li>
	<li>用镊子轻轻夹起蟑螂，用手将蟑螂移向针头。接着，将针头插入 通过 两个腹部体节与表皮水平方向之间的间隙。约&#160;插入深度，越浅越好。</li>
	<li>然后，将dsRNA溶液注射到蟑螂体内。最后，抽出针头。确保针尖尽可能靠近表皮，以避免损伤内部器官。 
	注意：注射应在解剖显微镜下进行。</li>
	<li>将注射后的蟑螂放入干净的生物测定容器中。静置约10-20分钟，使其从CO₂麻醉中恢复。2 效应。在容器上标记注射日期、dsRNA 类型及剂量、以及虫龄 P. americana.</li>
	<li>将注射后的蟑螂置于28 °C、70%湿度的黑暗环境中，提供水、饲料和庇护所，并定期观察蟑螂表型的可能变化。</li>
</ol>
7. 沉默效果验证与表型分析
<ol>
	<li>使用任何可用的分子生物学技术（如定量实时 PCR（qRT-PCR）和蛋白质印迹法）评估 RNA 干扰的效率。有关详细的 qRT-PCR 和蛋白质印迹实验步骤，请参见参考文献1,12。</li>
	<li>为观察和分析与 RNA 干扰相关的表型，应使用适用于活体动物的显微镜。 
	注意：RNA 干扰可能影响蜚蠊的形态、行为、蜕皮、附肢再生及其他生理活动。表型出现的具体频率需根据具体条件进行计算。</li>
</ol>

<ol><li>Miller, S. C., Miyata, K., Brown, S. J., Tomoyasu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+systemic+RNA+interference+in+the+red+flour+beetle+Tribolium+castaneum%3A+Parameters+affecting+the+efficiency+of+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Dissecting systemic RNA interference in the red flour beetle Tribolium castaneum: Parameters affecting the efficiency of RNAi.</a> PloS One. 7 (10), 47431(2012).</li>
<li>Fire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).</li>
<li>Ambesajir, A., Kaushik, A., Kaushik, J. J., Petros, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference%3A+A+futuristic+tool+and+its+therapeutic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Saudi+Journal+of+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">RNA interference: A futuristic tool and its therapeutic applications.</a> Saudi Journal of Biological Sciences. 19 (4), 395-403 (2012).</li>
<li>Younis, A., Siddique, M. I., Kim, C. K., Lim, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+%28RNAi%29+induced+gene+silencing%3A+A+promising+approach+of+hi-tech+plant+breeding%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">RNA interference (RNAi) induced gene silencing: A promising approach of hi-tech plant breeding.</a> International Journal of Biological Sciences. 10 (10), 1150-1158 (2014).</li>
<li>Bellés, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+Drosophila%3A+RNAi+in+vivo+and+functional+genomics+in+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Entomology%22%5BJournal%5D)">Beyond Drosophila: RNAi in vivo and functional genomics in insects.</a> Annual Review of Entomology. 55, 111-128 (2010).</li>
<li>French, A. S., Meisner, S., Liu, H., Weckström, M., Torkkeli, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+analysis+and+RNA+interference+of+cockroach+phototransduction+indicate+three+opsins+and+suggest+a+major+role+for+TRPL+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Transcriptome analysis and RNA interference of cockroach phototransduction indicate three opsins and suggest a major role for TRPL channels.</a> Frontiers in Physiology. 6, 207(2015).</li>
<li>Hennenfent, A., Liu, H., Torkkeli, P. H., French, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+supports+a+role+for+Nanchung-Inactive+in+mechanotransduction+by+the+cockroach%2C+Periplaneta+americana%2C+tactile+spine%5BTitle%5D)+AND+%22Invertebrate+Neuroscience%3A+IN%22%5BJournal%5D)">RNA interference supports a role for Nanchung-Inactive in mechanotransduction by the cockroach, Periplaneta americana, tactile spine.</a> Invertebrate Neuroscience: IN. 20 (1), 1(2020).</li>
<li>Immonen, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EAG+channels+expressed+in+microvillar+photoreceptors+are+unsuited+to+diurnal+vision%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">EAG channels expressed in microvillar photoreceptors are unsuited to diurnal vision.</a> The Journal of Physiology. 595 (16), 5465-5479 (2017).</li>
<li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genomic+and+functional+landscapes+of+developmental+plasticity+in+the+American+cockroach%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The genomic and functional landscapes of developmental plasticity in the American cockroach.</a> Nature Communications. 9 (1), 1008(2018).</li>
<li>Zhao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Grainy+head+signaling+regulates+epithelium+development+and+ecdysis+in+Blattella+germanica%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Science%22%5BJournal%5D)">Grainy head signaling regulates epithelium development and ecdysis in Blattella germanica.</a> Insect Science. 28 (2), 485-494 (2021).</li>
<li>Lozano, J., Belles, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+repressive+function+of+Kr%C3%BCppel+homolog+1+on+insect+metamorphosis+in+hemimetabolous+and+holometabolous+species%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Conserved repressive function of Krüppel homolog 1 on insect metamorphosis in hemimetabolous and holometabolous species.</a> Scientific Reports. 1, 163(2011).</li>
<li>Philip, B. N., Tomoyasu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+knockdown+analysis+by+double-stranded+RNA+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology+%28Clifton%2C+N.+J%29%22%5BJournal%5D)">Gene knockdown analysis by double-stranded RNA injection.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N. J). 772, 471-497 (2011).</li>
<li>Zheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+interference-based+specific+and+efficient+gene+inactivation+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">CRISPR interference-based specific and efficient gene inactivation in the brain.</a> Nature Neuroscience. 21 (3), 447-454 (2018).</li>
<li>Garbutt, J. S., Bellés, X., Richards, E. H., Reynolds, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistence+of+double-stranded+RNA+in+insect+hemolymph+as+a+potential+determiner+of+RNA+interference+success%3A+Evidence+from+Manduca+sexta+and+Blattella+germanica%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Persistence of double-stranded RNA in insect hemolymph as a potential determiner of RNA interference success: Evidence from Manduca sexta and Blattella germanica.</a> Journal of Insect Physiology. 59 (2), 171-178 (2013).</li>
<li>Parrish, S., Fleenor, J., Xu, S., Mello, C., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+anatomy+of+a+dsRNA+trigger%3A+differential+requirement+for+the+two+trigger+strands+in+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Functional anatomy of a dsRNA trigger: differential requirement for the two trigger strands in RNA interference.</a> Molecular Cell. 6 (5), 1077-1087 (2000).</li>
<li>Lemonds, T. R., Liu, J., Popadić, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+contribution+of+the+melanin+pathway+to+overall+body+pigmentation+during+ontogenesis+of+Periplaneta+americana%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Science%22%5BJournal%5D)">The contribution of the melanin pathway to overall body pigmentation during ontogenesis of Periplaneta americana.</a> Insect Science. 23 (4), 513-519 (2016).</li>
<li>Jackson, A. L., Linsley, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise+amidst+the+silence%3A+Off-target+effects+of+siRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%3A+TIG%22%5BJournal%5D)">Noise amidst the silence: Off-target effects of siRNAs.</a> Trends in Genetics: TIG. 20 (11), 521-524 (2004).</li>
<li>Patel, M., Peter, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+DISE-inducing+shRNAs+by+monitoring+cellular+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle+%28Georgetown%2C+Tex%29%22%5BJournal%5D)">Identification of DISE-inducing shRNAs by monitoring cellular responses.</a> Cell Cycle (Georgetown, Tex). 17 (4), 506-514 (2018).</li>
<li>Ventós-Alfonso, A., Ylla, G., Montañes, J. C., Belles, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNMT1+promotes+genome+methylation+and+early+embryo+development+in+cockroaches%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">DNMT1 promotes genome methylation and early embryo development in cockroaches.</a> iScience. 23 (12), 101778(2020).</li>
<li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+in+RNAi+efficacy+among+insect+species+is+attributable+to+dsRNA+degradation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Variation in RNAi efficacy among insect species is attributable to dsRNA degradation in vivo.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 77, 1-9 (2016).</li>
<li>Bi, F., Liu, N., Small Fan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((interfering+RNA%3A+A+new+tool+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">interfering RNA: A new tool for gene therapy.</a> Current Gene Therapy. 3 (5), 411-417 (2003).</li>
</ol>

作者声明不存在利益冲突。

本报告描述了一种在P. americana中实施RNA干扰的逐步方法学策略；值得注意的是，该方法经微小调整后也可应用于其他蟑螂（例如Blattella germanica）以及多种其他昆虫。然而，RNA干扰的基因沉默效率并不总是足够高，与基因敲除策略相比存在明显劣势13。基因水平的残留效应可能干扰对真实表型的观察。为确保RNA干扰处理成功，需考虑多个关键条件，包括动物的生理状态、对照组的选择、dsRNA分子的长度与浓度、避免脱靶效应（OTE）的可能性，以及不同组织对dsRNA的敏感性差异。
身体状况 P. americana 
健康的动物是RNAi及不同基因功能研究成功的基础 P. americana此外，为了保持实验的一致性，仅选择在相同条件下饲养的蟑螂。并且只选用龄期大于3的若虫rd 三龄若虫（孵化后约19天）可用于实验，因为 younger 若虫体型过小，无法...

RNA干扰（RNAi）是一种在进化上保守的机制，自安德鲁·菲尔（Andrew Fire）和克雷格·梅洛（Craig Mello）2建立双链RNA（dsRNA）介导的基因沉默策略以来，RNAi已逐渐成为在多种生物中抑制基因表达的重要反向遗传学工具1。在细胞内，dsRNA被Dicer酶切割为21-23个核苷酸长度的小片段，即小干扰RNA（siRNA），从而激活RNAi通路。随后，siRNA被整合到RNA诱导的沉默复合体（RISC）中，该复合体与靶标mRNA结合，导致mRNA被切割，最终使基因功能丧失3,4,5。在昆虫中，目前已在多个目中报道了大量系统性RNAi实验，包括直翅目（Orthoptera）、等翅目（Isoptera）、半翅目（Hemiptera）、鞘翅目（Coleoptera）、脉翅目（Neuroptera）、双翅目（Diptera）、膜翅目（Hymenoptera）、鳞翅目（Lepidoptera）和蜚蠊目（Blattodea）5,6,7,8。
蜚蠊（Blattaria）因其快速的生长周期、对环境的强大适应能力以及高度的发育可塑性，成为发育与变态研究中重要的昆虫类群9。在发现RNA干扰（RNAi）技术适用于蜚蠊之前，由于缺乏有效的遗传操作手段，相关研究主要集中于蜚蠊的防治。蜚蠊卵鞘独特的结构使得基于CRISPR-Cas9系统的胚胎注射基因敲除难以实施。此外，蜚蠊多数组织（如 P. americana）表现出强烈的系统性RNAi反应，通过注射一种或多种靶向的双链RNA（dsRNA），可快速获得功能缺失的表型9,10,11。这些特性使RNAi成为研究 P. americana 基因功能不可或缺的技术。
尽管已有文献报道在美洲大蠊（P. americana）的功能基因研究中使用RNA干扰（RNAi）技术，但此前尚无详细或逐步的操作说明。本报告提供了一套针对美洲大蠊（P. americana）的RNAi实验逐步操作指南，该方法也可用于其他蟑螂的基因功能研究。此外，本指南不仅限于蜚蠊目（Blattodea），稍加修改后还可应用于多种其他昆虫。

<table><tbody><tr><td>701 N 10 &amp;micro;L 注射器 (26s/51/2)</td><td>Hamilton</td><td>PN:80300</td><td>注射</td></tr><tr><td>培养箱</td><td>宁波江南仪器厂</td><td>RXZ-380A-LED</td><td>用于蜚蠊的孵化与饲养</td></tr><tr><td>微量注射泵</td><td>Alcott 生物技术公司</td><td>ALC-IP600</td><td>注射</td></tr><tr><td>pTOPO-Blunt 克隆试剂盒</td><td>Aidlab 生物技术公司</td><td>CV16</td><td>用于基因克隆</td></tr><tr><td>定量实时荧光 PCR 系统</td><td>Bio-Rad</td><td>CFX Connect</td><td>用于 qRT-PCR 分析</td></tr><tr><td>T7 RiboMAX Express RNAi 系统</td><td>Promega</td><td>P1700</td><td>用于合成 dsRNA，包含 RNase A 溶液 (4 &amp;mu;g/&amp;mu;L)、乙酸钠 3.0 M (pH 5.2)、酶混合液 T7 Express、无核酸酶水、Express T7 2× 缓冲液、RQ1 无 RNase 的 DNase</td></tr><tr><td>PCR 扩增仪</td><td>Bio-Rad</td><td>S1000</td><td>用于 DNA 扩增</td></tr></tbody></table>

rna干扰技术在美国大蠊中的应用

Applications of RNA Interference in American Cockroach

蜚蠊是一种卫生害虫，但由于其易于饲养且具有不完全变态的特征，成为昆虫发育与变态研究中的重要物种。结合其基因组序列已得到充分注释的优势，美洲大蠊（Periplaneta americana）已成为重要的不完全变态昆虫研究模型。由于基因敲除技术手段的缺乏，基于RNA干扰（RNAi）的有效基因沉默技术在P. americana的功能基因研究中变得不可或缺。本实验方案详细描述了在P. americana中实施RNAi的操作技术，内容包括：（1）选择合适发育阶段的P. americana个体，（2）注射实验条件的准备，（3）双链RNA（dsRNA）的注射，以及（4）基因沉默效率的检测。RNAi是P. americana中一种强大的反向遗传学工具。大多数P. americana组织对细胞外dsRNA具有敏感性。该方法操作简便，研究人员可通过单次或多次靶向dsRNA注射快速获得功能缺失的表型，从而更有效地利用P. americana开展发育与变态相关研究。

图1 显示注射成功。应将带有微细针头的微量注射器水平放置在增压器上图1A）。针头插入 通过 腹部体节之间沿表皮水平方向的间隙（图1B）。确保液体进入 P. americana 腹部。针头角度过陡会损伤内脏器官（图1C），而注射不当会导致dsRNA溶液从腹部泄漏出来（图1D）。如果有任何dsRNA泄漏，该动物需弃用，并重新进行一次注射。 P. americana 注射过程中需要完全麻醉。
与其他生物学实验一样，在进行RNAi处理时需要设置对照组。必须确认处理差异是由靶向RNAi引起的，而非由dsRNA的脱靶效应、注射过程中的损伤或CO2 麻醉。此处 Ddc (多巴脱羧酶）和 <e...

本方案详细描述了美洲大蠊（P. americana）中RNAi操作技术的逐步操作指南。

RNA干扰技术在美国大蠊中的应用

蜚蠊作为一种卫生害虫，因其易于饲养且具有不完全变态发育特性，成为昆虫发育与变态研究中的重要物种……

该方案提供了一种简便的方法来研究美洲大蠊，这是一种常见的卫生害虫，同时也是传统中医药中有益的昆虫。通过敲低特定基因，将有助于探索美洲大蠊多种生命活动的分子机制。该技术的主要优势在于，它能够在美洲大蠊或其他不适合进行基因编辑的类似昆虫中实现基因敲低。该技术可用于探索美洲大蠊的多个研究领域，如遗传与表观遗传调控、组织发育过程、附肢再生、交配行为以及其他有趣的生物学特性。该技术操作简便，适用性广泛。我们建议在DSRA注射处理期间保持动物健康。我认为初学者经过几次练习后即可轻松掌握该技术。首先，使用孔径为四毫米的筛子将孵化出的若虫从卵鞘中分离出来。用玻璃管挑取白色的新鲜麦芽化的 P.americana。将 P.americana 置于新的容器中，等待其达到适合处理的阶段。在反应体系中加入 10 µL T7 2X 缓冲液、2 µL T7 Express 酶混合物以及 2 µg 的 PCR 产物。最后，用双蒸水将总体积调至 20 微升。轻轻颠倒混匀，于 37 摄氏度孵育 30 分钟，然后在 70 摄氏度孵育 10 分钟。将 4 微克/微升的 RNase A 溶液用 DEPC 水按 1 比 200 的比例稀释。然后向体系中加入1微升浓度为每微升1单位的RQ1无RNase的DNase和1微升稀释的RNase A溶液。在37摄氏度孵育30分钟。随后加入总体积10%的乙酸钠和相当于总体积三倍的异丙醇。轻轻倒置混匀，然后置于冰上5分钟，在4摄氏度下以13,000 g离心10分钟。用移液器弃去上清液。接着用75%乙醇洗涤沉淀，再用25%经DEPC处理的水洗涤，随后在4摄氏度下以13,000 g离心5分钟。再次去除上清液，在室温下将沉淀晾干15分钟。然后用约100微升DEPC水溶解双链RNA，并将其稀释至终浓度为2微克/微升。设置显微注射泵的程序，以确保每次注射的体积保持一致。然后用DEPC水抽吸清洗注射器8到10次。将10微升注射器安装到显微注射泵上。启动泵，用10微升双链RNA溶液填充注射器。用二氧化碳麻醉蟑螂，然后用镊子轻轻夹起，并用手将蟑螂送至针头处。接着，将针头从腹部体节之间的缝隙水平刺入，方向与表皮相对。注射双链RNA溶液时，确保针尖尽可能靠近表皮，以避免损伤内部器官。最后，拔出针尖。将注射后的蟑螂放入干净的生物测定容器中。等待约10至20分钟，使其从二氧化碳的作用中恢复。用注射日期、双链RNA的类型和剂量以及美洲大蠊（P. americana）的龄期标记容器。选择 Ddc（多巴脱羧酶）和 Dpp（decapentaplegic）基因作为两个示例，以观察注射双链RNA后黑化蟑螂的表型，同时以 dsMocK 作为阴性对照（其在动物体内无靶标）。通过qRT-PCR检测RNA干扰效率。基因显著被敲低，其中dsDdc的P值小于0.01，dsDpp的P值小于0.05。Ddc基因敲低的美洲大蠊（P. americana）由于黑色素合成受阻而表现为白色表皮。在注射dsDpp的实验中，RNA干扰破坏了附肢的再生过程。昆虫应保持健康状态，并在无损伤的情况下进行注射。该技术为无法进行基因编辑的昆虫（如美洲大蠊）提供了一种探索基因功能的简便方法。

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科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

RNA干扰在美洲蟑螂中的应用

RNA干扰技术已被证明在分析Drosophila气管发育中基因功能方面非常有效。本文展示了姜实验室用于将dsRNA注射到果蝇胚胎中以敲低基因表达的详细实验方案。该技术有望用于筛选Drosophila组织和器官发育所必需的基因。...

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壳聚糖/干扰RNA纳米颗粒介导的病媒蚊虫幼虫基因沉默

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向Anopheles gambiae蛹体内递送RNAi触发物

本文介绍了在实验室中饲养中间型胚发育甲虫——斑拟 beetles（Dermestes maculatus，D.

中国台湾甲虫 Dermestes maculatus 的饲养及双链RNA介导的基因敲低

本论文通过口服摄入包裹在脂质体中的双链RNA，展示了德国小蠊中肠基因表达的耗竭。...

RNA干扰的实际应用：利用脂质体载体口服递送双链RNA至蟑螂

本文展示了通过植物维管组织口服递送双链RNA（dsRNA）以实现韧皮部汁液取食昆虫RNA干扰（RNAi）的新型技术。...

通过口服递送双链RNA在韧皮部及刺吸式口器昆虫中诱导RNA干扰的方法

本方案描述了一种我们已标准化并多年用于将特定量的核酸直接递送至蚊子和家蝇血淋巴的显微注射方法。该方案可实现极低的注射死亡率，并允许进行与剂量相关的繁殖力测定。...

蚊虫与家蝇中可重复的dsRNA显微注射及产卵生物测定

RNA干扰是一种广泛应用且强大的技术，可用于在特定发育阶段调控基因表达。本文中，我们描述了在水生潜水甲虫Thermonectus...

水生甲虫中RNA干扰作为在特定发育时间点操控基因表达的有力工具

通过细菌产生的双链RNA（dsRNA）进行口服给药，是一种常用于Caenorhabditis...

有效的口服RNA干扰（RNAi）给药至成年Anopheles gambiae蚊子

本文介绍了一种针对松材线虫（Bursaphelenchus...

RNA干扰技术在松材线虫 Bursaphelenchus xylophilus 中的应用

RNA干扰（RNAi）技术在许多体型微小的寄生性天敌昆虫中的应用面临巨大挑战，例如 赤眼蜂属 黄蜂。本研究阐明了一种高效的RNAi方法 赤眼蜂（Trichogramma dendrolimi）. 本方法为研究基因调控提供了一个可靠的模型 赤眼蜂属...

卵寄生蜂松毛虫赤眼蜂（Trichogramma dendrolimi Matsumura）中的RNA干扰

学习利用RNA干扰技术研究美洲蟑螂的分子机制，通过基因敲低探索其发育、再生及行为调控。该方法适用于非模式生物，为昆虫遗传学研究提供简便有效的实验手段。

RNA干扰技术在美国大蠊中的应用

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