人爆破模拟胚发育和植入的协议

对人类胚胎的研究受到其低可用性和伦理问题的限制，因此获得忠实复制早期人类发育的个体模型将支持科学和医学进步。该技术预测人类发育的能力取决于其根据发育序列和速度有效地再现囊胚细胞测定和形态发生序列的能力，并且这种建模将确保形成真正反映囊胚阶段的细胞。将来，人类胚泡可用于识别治疗靶点并有助于临床前建模，例如，改进体外受精培养基，或开发非激素避孕药。

演示该程序的将是Harunobu Kagawa，Alok Javali，Heidar Heidari Khoei，Theresa Maria Sommer和Giovanni Sestini。首先，准备和预热 PXGL 培养基、N2B27 基础培养基、洗涤缓冲液、PBS 和聚集培养基。从hPSC悬浮液中排除用于形成胚层的MEF。

对于MEF排除，通过将一毫升0.1%明胶加入六孔板的孔中来制备明胶包被板。将板在37摄氏度孵育30至90分钟。要收获细胞，请除去培养基，并用一毫米PBS洗涤细胞。

向六孔板的每个孔中加入500微升细胞分离溶液，并在37摄氏度下孵育五分钟。在显微镜下检查细胞，以跟踪集落解离成单细胞。用一毫升洗涤缓冲液稀释细胞分离溶液。

通过轻轻移液5至10次从平板中收集细胞。将细胞悬浮液转移到15毫升管中。以200 RCF旋转细胞四分钟。

除去上清液，并将细胞重悬于每个孔中1.5毫升PXGL培养基中。将细胞接种在明胶包被的平板上进行MEF排除，并将板在37摄氏度下孵育60至90分钟。一旦将幼稚细胞接种以进行MEF排阻，从MicroWells中除去PBS，并用每个MicroWell芯片的200微升基础N2B27培养基平衡孔，并在37摄氏度下孵育60分钟。

收集含有未附着的幼稚细胞的上清液。将其转移到15毫升的管中，并在200 RCF下旋转细胞四分钟。丢弃培养基，并将细胞重悬于一毫升N2B27基础培养基中。

使用细胞计数载玻片对细胞进行计数。以200 RCF旋转细胞四分钟。弃去培养基，加入适量的含有10微摩尔Y27632的N2B27培养基，得到每50微升30， 000个细胞的细胞密度。

从平衡的MicroWell阵列中取出培养基，并用10微摩尔Y27632加入25微升N2B27培养基。加入50微升细胞悬浮液，在37摄氏度下孵育15分钟，使细胞落入微孔的底部。然后加入125微升N2B27培养基，辅以10微摩尔Y27632。

在24小时内，将在MicroWell芯片上观察到幼稚的hPSC的聚集体。通过制备PALY培养基启动胚层形成。在37摄氏度下预热30分钟。

取出聚集培养基，并向微孔中加入200微升预热PALY培养基。将细胞培养板放回37摄氏度的缺氧培养箱中。在第一天重复更换介质。

第二天，取出PALY培养基，加入200微升N2B27培养基，补充LPA和10微摩尔Y27632。在第三天重复更换介质。在第四天完全形成胚泡。

如前所述，准备用于胚泡形成的幼稚hPSC细胞悬浮液。弃去培养基，加入适量的含有10微摩尔Y27632的N2B27培养基，得到每100微升培养基70个细胞的细胞密度。要将孔底部的细胞聚集在孔中，请在室温下以200 RCF离心板两分钟。

在缺氧培养条件下将板在37摄氏度孵育。在24小时内，将在井上观察到幼稚的hPSC的聚集体。向孔中加入100微升新鲜制备并预热的两倍PALY培养基。

将细胞培养板放回37摄氏度的缺氧培养箱中。24小时后，丢弃一半的培养基，并用100微升预热的PALY培养基代替。重复该步骤，直到第四天。

如前所述，准备用于对流层形成的幼稚HPSC细胞悬浮液。一旦24小时后形成幼稚HPSC的聚集体，用PALY交换聚集培养基，不含LIF，补充三个微摩尔SC144以形成代表早期滋养外胚层的滋养层。为了形成代表成熟滋养外胚层的滋养层，用PALY交换聚集培养基，并补充两个微摩尔XMUMP1。

每天刷新培养基。在第四天完全形成滋养层。为了评估细胞状态，将来自胚层和滋养层的转录组数据与适当的对照进行比较，包括植入后样的人滋养层干细胞。

在PXGL中培养的幼稚hPSCs在PALY诱导后48至72小时之间出现聚集和空化结构，并在96小时内达到150至250微米的直径。基于形态学参数和3个谱系的存在，诱导效率达到70~80%，在诱导后96 h内以50~60%的效率形成滋养层。在优化的诱导条件下，在市售的超低附着 96 孔板中成功形成胚层。

单细胞RNA测序技术用于进一步表征胚泡细胞状态。无论用于执行数据聚类和可视化的参数如何，细胞都会显示明显可重复的不同聚类谱，从而可以自信地区分三个囊胚谱系。在24至60小时之间，PXGL多能干细胞形成外胚层和滋养外胚层的类似物。

然后在60到96小时之间，形成极性滋养外胚层和原始内胚层的类似物。这是囊胚内的规范序列，因此胚泡概括了谱系规范的发展序列。将胚泡数据集与不同发育阶段从胚胎中分离的细胞的参考数据集合并，表明来自胚泡的细胞97%与囊胚细胞聚集，但与植入后胚胎的细胞不聚集在一起。

独立分析证实，随着时间的推移，干细胞在第五天到第7.5天之间形成的细胞与人类胚胎的细胞具有转录匹配。这确实是人类囊胚形成的发育阶段。他们还证实，囊胚中超过95%的细胞具有与囊胚的三个细胞谱系相匹配的转录组，而3%的细胞是脱靶的，并且与植入后阶段相匹配。

值得注意的是，我们观察到我们最初的2D培养物也包含约5%的离靶细胞。等效发育阶段也可以通过观察特定标志物的表达模式来可视化，例如囊胚滋养外胚层的CDX2和胚泡上胚层的PRMD14。初始PXGL培养的质量绝对至关重要，初始聚集体内的细胞数量也至关重要，可以使用MicroWells进行控制。

24小时后细胞聚集体的总大小应约为50至70微米。相位全胚层的有效形成为研究人类胚胎的植入和植入后发育过程铺平了道路。