Name: 人爆破模拟胚发育和植入的协议 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 9 s
Description: 了解人类囊胚样体形成技术，通过PXGL和N2B27培养基诱导naive hPSC聚集分化，实现70-80%的囊胚形成效率。该方法为早期人类发育研究及辅助生殖技术改进提供重要模型。

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本项目获得了欧洲研究理事会（ERC）在欧盟“地平线2020”研究与创新计划（ERC-Co 资助协议编号101002317，“BLASTOID：人类早期胚胎发生研究平台”）下的资助。H.H.K. 受奥地利科学基金（FWF）莉泽·迈特纳计划 M3131-B 支持。我们感谢 Yasuhiro Takashima 分享 H9 和 H9-GFP 细胞系，感谢 Austin Smith、Peter Andrews 和 Ge Guo 分享 HNES1、Shef6、niPSC 16.2b 和 cR-NCRM2 细胞系。我们感谢 Hossein Baharvand 分享子宫内膜类器官。我们感谢 Joshua M. Brickman 分享从 PrE 分化细胞和 nEND 细胞中提取的 RNA。我们感谢 Shankar Srinivas 分享围植入期胚胎的单细胞 RNA 测序数据。我们感谢 Aleksand Bykov 和 Luisa Cochella 在 SMARTSeq2 文库制备方面的技术协助。我们感谢 IMBA 的下一代测序（NGS）、生物光学和干细胞平台提供的关键支持。

国际干细胞研究学会（ISSCR）发布的《干细胞研究与临床转化指南》建议，人类囊胚样结构的研究只有在经过专门的科学与伦理审查程序评审并获得批准后方可进行3,4。所有实验操作均遵循奥地利科学院分子生物技术研究所（IMBA）人类研究伦理委员会在批准号Rivron_Stellungnahme_2020-04-22下制定的指导原则。遵守这些指南是将研究成果发表于科学期刊的必要条件。
1. 在PXGL条件下培养人 naive 胚胎干细胞
注意：初始态 hPSC 可从相关实验室获得。本研究中使用的细胞系来自 Yasuhiro Takashima（现就职于日本京都 CiRA）和 Austin Smith（现就职于英国埃克塞特 Living Systems Institute）的实验室。 Alternatively，初始态 hPSC 也可通过重置获得 自主研发 来自已启动的hPSC细胞系，如先前所述13,14. 原始态 hPSCs 在多次传代中保持稳定&#62; 15）但培养质量可能随时间变化。如果 naive hPSC 的质量下降，应解冻新一管细胞或重新制备 从头合成 从始发态PSCs获得 naive hPSCs。所有培养基配方详见 补充表1.
<ol>
	<li>制备辐照小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）饲养层
	<ol>
		<li>在传代 naive hPSCs 的前一天，按照以下步骤准备含有辐照 MEF 饲养层的 6 孔细胞培养板。</li>
		<li>每孔加入 1 mL 含 0.1% 明胶的 PBS 溶液，对 6 孔细胞培养板进行包被。于 37 °C 孵育 30 分钟后，吸除明胶溶液。</li>
		<li>将 MEF 培养基预热至 37 °C。</li>
		<li>将冻存的 MEFs 在 37 °C 水浴中解冻，直至仅剩少量冰晶。使用 P1000 移液器加入 1 mL 预热的 MEF 培养基溶解冻存管内容物。</li>
		<li>将细胞悬液转移至 15 mL 离心管中，在 200 × g 条件下离心 4 分钟。吸除上清液，并加入新鲜 MEF 培养基（每孔需足量，共 1.5 mL）重悬 MEF 沉淀。</li>
		<li>使用细胞计数板对细胞进行计数，每孔接种 300,000 个细胞，并将培养板置于 37 °C 正常氧浓度培养箱中培养。 
		注：若 MEFs 随时间发生脱落，可在常规换液时向 PXGL 培养基中补充新鲜 MEFs。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>人 naive 多能干细胞的传代
	<ol>
		<li>在传代 hPSCs 前，于显微镜下观察其形态。典型的克隆呈圆顶状，边缘明亮且清晰。若单个克隆呈现较扁平的形态，或出现分化克隆，则应按照步骤 1.2.8 的说明进行操作。</li>
		<li>吸除培养基，用 PBS 洗涤细胞一次。每孔（6 孔板）加入 500 µL 细胞解离溶液。</li>
		<li>于 37 °C 孵育 5 分钟。使用 P1000 移液器反复吹打数次，使克隆解离为单细胞悬液。</li>
		<li>收集细胞并转移至 15 mL 离心管中，每孔对应加入 1 mL 洗涤缓冲液。在 200 × g 条件下离心 4 分钟。</li>
		<li>吸除上清液，用新鲜 PXGL 培养基（每孔足量，共 1.5 mL）重悬细胞沉淀。常规传代时建议采用 1:3 至 1:6 的传代比例。 
		注：每传代 3–4 次后，或当根据细胞形态判断细胞培养质量下降时（例如群体中出现扁平克隆），应在传代后前 24 小时内在培养基中添加 10 µM Y-27632 及生长因子基底膜提取物（每孔 5 µL）。</li>
		<li>在重新接种 hPSCs 前，先将含有新鲜 MEFs 的培养板用 PBS 洗涤一次，并吸除原有 MEF 培养基。然后使用 P1000 移液器将 1.5 mL hPSCs 细胞悬液接种至含 MEFs 的 6 孔板每孔中。 
		注：确保移液操作能使细胞在孔内均匀分布，以保证克隆大小均一及细胞生长的相对同步性。</li>
		<li>将 hPSCs 置于 37 °C、湿润环境下的低氧条件下培养。24 小时后，hPSCs 应已贴壁。若存在大量未贴壁（漂浮）细胞，则提示细胞活力或贴壁能力存在问题。</li>
		<li>每日更换培养基，每孔加入 1.5 mL PXGL 培养基。每 3–4 天传代一次，或用于类囊胚形成实验。 
		&#8203;注：hPSCs 解冻后，需至少连续传代三次，方可用于类囊胚实验。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 囊胚样结构的形成
<ol>
	<li>幼稚态多能干细胞聚集体的形成
	<ol>
		<li>准备并预热PXGL培养基、N2B27基础培养基、洗涤缓冲液、PBS和聚集培养基，然后开始实验。按照下述步骤从hPSCs悬浮液中去除MEFs，以形成囊胚样结构。</li>
		<li>为排除MEF，将1 mL 0.1%明胶加入6孔板的孔中，制备明胶包被的培养板，在37 °C孵育30–90分钟。</li>
		<li>收获细胞时，吸除培养基，并用 1 mL PBS 洗涤细胞。</li>
		<li>每孔加入500 µL细胞解离溶液（6孔板），于37 °C孵育5 min。</li>
		<li>在显微镜下观察细胞，以监测集落解离为单细胞的情况（少量多细胞团块可在后续通过轻柔吹打进一步解离）。</li>
		<li>用1 mL洗涤缓冲液稀释细胞解离溶液。轻柔吹打5至10次，收集培养板中的细胞。将细胞悬液转移至15 mL离心管中。在200 x g 4 分钟。</li>
		<li>吸弃上清液，将细胞重悬于1.5 mL PXGL培养基中（每6孔板孔），接种至明胶包被的培养板中以去除MEF，并于37 °C孵育60–90分钟。</li>
		<li>将初始细胞接种用于MEF排除后，从微孔中移除PBS，并每微孔芯片加入200 µL基础N2B27培养基平衡微孔，于37 °C孵育60分钟。</li>
		<li>收集含有未贴壁的初始细胞的上清液，转移至15 mL离心管中，在200 x g条件下离心沉淀细胞 g 4 分钟。</li>
		<li>吸弃培养基，将细胞重悬于 1 mL N2B27 基础培养基中。使用细胞计数板对细胞进行计数。在 200 x g 4 分钟。</li>
		<li>吸弃培养基，加入适量含10 µM Y-27632的N2B27培养基，调整细胞密度至每50 µL含30,000个细胞。 
		注意：不同细胞系的最佳初始接种细胞数量可能有所不同。例如，若需在每个微孔中接种50–60个细胞，则在含430个微孔的96孔板的1个孔中接种30,000个细胞（包括部分细胞可能落在微孔外的冗余量）。初始细胞数量不适宜可能导致形成无腔的小细胞聚集体，或形成直径超过250 µm的有腔结构。</li>
		<li>从已平衡的微孔阵列中吸除培养基，加入含10 µM Y-27632的25 µL N2B27培养基。加入50 µL细胞悬液，于37 °C孵育15分钟（直至细胞沉降至微孔底部）。随后，加入125 µL含10 µM Y-27632的N2B27培养基。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>类囊胚发育
	<ol>
		<li>24 小时内，可在微孔芯片上观察到初始人多能干细胞（hPSC）的聚集体（第 0 天）。为启动类囊胚形成，需配制 PALLY 培养基，并按以下步骤操作。</li>
		<li>将 PALLY 培养基在 37 °C 预热 30 分钟。 
		注意：1-油酰基溶血磷脂酸（LPA）和10 µM Y-27632需在使用前添加。LPA 的最佳浓度范围为0.5–5 µM，具体浓度需根据所用的人多能干细胞（hPSC）系进行滴定优化。</li>
		<li>吸除聚集培养基。向微孔中加入 200 µL 预热的 PALLY 培养基。将细胞培养板放回 37 °C 的低氧培养箱中。在第 1 天重复更换培养基。</li>
		<li>第2天，移除PALLY培养基，加入200 µL添加了LPA和10 µM Y-27632的N2B27培养基。 
		注意：第2天时，大部分类胚体继续生长，但部分类胚体开始形成小腔隙。将类胚体在PALLY培养基中持续培养至第4天，或继续培养至 体外 从第2天开始使用培养基（IVC1）。然而，进行此培养基更换可促进成熟类囊胚中原始内胚层（PrE）的形成。</li>
		<li>第3天再次更换培养基。第4天完成类囊胚的形成。 
		&#8203;注意：当类囊胚在形态计量学上达到第7天人囊胚的完全形态发生（例如，直径范围为150–250 µm；一个内细胞团被一层类似滋养外胚层的上皮细胞包围），并已形成极性滋养外胚层样细胞（NR2F2+/CDX2-）和类似原始内胚层（PrE）的细胞（GATA4+）时，可认为其已完全发育。可通过免疫荧光染色或荧光激活细胞分选（FACS）对此进行评估。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 在96孔超低吸附微孔板中形成囊胚样结构
<ol>
	<li>按照上述 2.1.1 - 2.1.11 步骤制备用于形成囊胚样结构的 naive hPSCs 细胞悬液。</li>
	<li>吸除培养基，并加入适量含有 10 µM Y-27632 的 N2B27 培养基，使细胞密度达到每 100 µL 培养基含 70 个细胞。 
	注意：不同细胞系的最佳初始接种细胞数量可能有所不同。例如，对于大多数细胞系，每孔 70 个细胞可能是最佳接种数量。</li>
	<li>将培养板在室温下以 200 × g 离心 2 分钟，使细胞聚集于孔底。</li>
	<li>将培养板置于 37 °C 的低氧培养条件下孵育。24 小时内可在孔中观察到 naive hPSCs 的细胞聚集体（第 0 天）。</li>
	<li>配制 2x PALLY 培养基。向各孔中加入 100 µL 预热的 2x PALLY 培养基。</li>
	<li>将细胞培养板重新放回 37 °C 的低氧培养箱中。24 小时后，吸除一半培养基（100 µL），并替换为 100 µL 预热的 PALLY 培养基。重复此步骤至第 4 天。注意避免吸除细胞聚集体。 
	&#8203;注意：第 2 天时，大多数聚集体持续生长，但部分聚集体出现小的液体填充腔隙。第 4 天时，大多数具有腔隙的结构完成完整的形态发生，形成囊胚样结构。</li>
</ol>
4. 滋养层球体的形成
<ol>
	<li>进行滋养层球体形成时，按照第2.1.1步（去除MEF）至第2.1.12步（接种程序的最后一步）的类囊胚形成方案操作。</li>
	<li>在 naive hPSCs 聚集体形成24小时后，将聚集体培养基更换为添加了3 µM SC-144但不含LIF的PALY培养基，以形成代表早期滋养外胚层的滋养层球体；或更换为添加了2 µM XMU-MP-1的PALLY培养基，以形成代表成熟滋养外胚层的滋养层球体。</li>
	<li>每日更换培养基。第4天时滋养层球体形成完成。</li>
</ol>
5. 使用单细胞RNA测序分析囊胚样细胞的状态及其对应的发育阶段
<ol>
	<li>将摇床培养箱预热至 37 °C，并调至 100 rpm，用于拾取囊胚样结构并进行解离。</li>
	<li>使用配有玻璃毛细管的口吸移液器，从初始的96孔板中收集囊胚样结构，并转移至多个U型底96孔板的孔中。 
	注意：囊胚样结构（blastoids）&#62; 70%）应根据形态计量学标准（大小为150–250 µm，具有独特的内层细胞簇）进行选择，以避免混入非胚泡样结构&#60; 30%).</li>
	<li>在体视显微镜下，用P200加入200 µL PBS洗涤一次。转移至含有50 µL胶原酶的孔中，在摇床培养箱中孵育30分钟。</li>
	<li>将囊胚样结构转移至含有100 µL 10x胰蛋白酶-EDTA的孔中，充分混匀。在摇床培养箱中孵育20分钟。</li>
	<li>使用P200移液器将囊胚样结构解离为单细胞。将细胞转移至含有FACS缓冲液（PBS中含1% FBS）的15 mL离心管中。</li>
	<li>为了捕获三种谱系类似物的特定比例，分别使用 TROP2 和 PDGFRa 抗体对滋养层外胚层（TE）和原始内胚层（PrE）类似物进行染色。 
	注意：与小鼠囊胚相比，人类囊胚中的原始内胚层（PrE）细胞数量较少，这可能反映了通过该方式形成囊胚的发育缺陷 体外 受精（IVF）或物种差异。在囊胚样结构中，原始内胚层类似物（PrE analogs）的数量少于滋养层（TE）和上胚层（EPI）类似物，通过免疫荧光成像计数GATA4+细胞，其占细胞总数的7.4%。此外，解离过程可能引起不同细胞类型比例的偏差，在囊胚样结构解离、PDGFRa标记及流式细胞术（FACS）分析后，PrE类似物仅占细胞总数的1%–2%。</li>
	<li>将来自三种谱系类似物的细胞通过FACS分选至含有裂解缓冲液的384孔板中，用于smart-seq2分析。根据制造商说明书进行DAPI染色，排除标记为死亡的细胞。</li>
	<li>为评估细胞状态（细胞类型和发育阶段），需将类囊胚的转录组数据与适当的对照进行比较。</li>
</ol>
6. 延长培养以评估囊胚样结构的发育进程
<ol>
	<li>在包被有基底膜基质的培养板（玻璃底）上培养人类囊胚样结构。
	<ol>
		<li>用基底膜基质包被培养板。</li>
		<li>目视检查囊胚样结构以评估并记录其形态。 
		注意：只有表现出经典空心球状囊胚形态且具有紧密内细胞团（ICM）的胚状体才具有进一步生长和发育的潜力。</li>
		<li>每孔加入 100 µL CMRL medium-1，将 96 孔板放入培养箱中至少平衡 2 小时，然后再进行类胚体转移。</li>
		<li>在体视显微镜下观察并选择形态良好的类囊胚，将选出的类囊胚转移至含有 100 µl CMRL 培养基-1 的 96 孔板孔中，以去除残留的类囊胚培养基。</li>
		<li>将囊胚样结构转移至含有预平衡CMRL培养基-1的孔中。将培养板放入培养箱，在37°C条件下过夜培养。 
		注意：每个96孔板的孔中最多可培养5个囊胚样结构。单个孔中囊胚样结构过多可能导致多个囊胚样结构聚集形成聚集体。</li>
		<li>次日，在显微镜下目视检查囊胚样结构。若囊胚样结构已贴壁，加入100 µL预平衡的CMRL-1培养基，培养基中添加5%基底膜基质。将培养板放入培养箱中，在37 °C条件下过夜培养。</li>
		<li>次日，在显微镜下观察类囊胚的发育情况。移除一半培养基（100 µL），并加入100 µL预平衡的CMRL media-2培养基，该培养基补充有5%基底膜基质。</li>
		<li>在接下来的几天中，将培养基的一半（100 µL）更换为预先平衡的添加了5%基底膜基质的CMRL-3培养基。将培养板放入培养箱中，在37 °C下过夜培养。每天重复一次，持续4至6天。 体外 培养。 
		注意：我们在延长培养条件下已将囊胚样结构培养至多6天，这相当于第13天的发育时间 体外 培养的人类胚胎</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 类囊胚免疫染色
<ol>
	<li>吸去培养基，用 PBS 洗涤样品 3 次，每次 5 分钟。</li>
	<li>每样本加入 200 µL 冷的含 4% 多聚甲醛（PFA）的 PBS 溶液，在室温下固定 30 分钟。去除 PFA 溶液，用 PBS 洗涤样品 3 次，每次 10 分钟。 
	注意：若囊胚样结构（blastoids）在微孔芯片上培养，需将囊胚样结构从芯片转移至 96 孔圆底板中进行后续步骤。</li>
	<li>每孔加入 100 µL 封闭液（含 0.3% Triton-X 100 和 10% 正常驴血清的 PBS），对囊胚样结构进行透化和封闭处理，孵育 60 分钟。 
	注意：根据一抗的宿主物种，相应调整血清种类。</li>
	<li>去除封闭液，每孔加入 100 µL 用新鲜封闭液稀释的一抗，于 4°C 条件下孵育过夜。 
	注意：一抗的浓度应根据生产商说明书确定。</li>
	<li>用洗涤液（含 0.1% Triton-X 100 的 PBS）洗涤样品 3 次，每次 10 分钟。每孔加入 100 µL 用封闭液稀释的二抗，并加入终浓度为 20 µg/mL 的 Hoechst 核染色剂，在室温下避光孵育 1 小时。 
	注意：二抗的浓度应根据生产商说明书确定。</li>
	<li>用洗涤液洗涤样品 3 次，每次 10 分钟。成像前，将样品转移至含 PBS 的玻璃底 µ 载玻片中。 
	注意：封片剂的选择应根据成像所用物镜类型决定。例如，使用油镜时，可用含 80% 甘油的 PBS 作为封片剂。</li>
</ol>

奥地利科学院分子生物技术研究所已提交专利申请 EP21151455.9，该专利描述了人类囊胚样结构形成及囊胚样结构-子宫内膜相互作用检测的方案。HK、AJ、HHK 和 NR 是本专利的发明人。其他所有作者声明不存在竞争利益。

在本研究中，我们逐步展示如何利用一种简单且稳健的方案，以高效率建立人源囊胚样结构（blastoids）。通过将 naive PXGL hPSCs 进行聚合并实施三重抑制，可在 4 天内高效（&#62; 70%）且有序地生成三种囊胚类似结构。若起始状态不理想，则可能影响囊胚样结构的效率与质量（例如出现非靶细胞）。值得注意的是，我们已测定 PXGL hPSCs 中约有 5% 的细胞处于着床后阶段，这些细胞可能限制高质量囊胚样结构的形成。除了反映囊胚上胚层状态的初始 naive PXGL 状态外，另一个关键因素是用于形成囊胚样结构的培养基。为了快速形成类囊胚结构并防止生成非靶向的类着床后细胞，我们提出三重通路抑制（Hippo、ERK、TGF-β）至关重要。尽管不同细胞系在 ERK/TGF-β 抑制条件下生成囊胚样结构的效率各不相同（通常约为 10%-20%），但在严格采用形态测量学和谱系特化标准评估下，添加 LPA 可使所有细胞系均达到同样高的囊胚样结构生成率。LPA 可能通过抑制 Hippo 通路发挥作用，该通路在小鼠和人类早期发育中上胚层与滋养外胚层之间的首次谱系分离过程中具有关键作用8,51。LPA 显著提高囊胚样结构的形成效率，表明囊胚中由 Hippo 通路介导的内外细胞命运决定机制在囊胚样结构形成过程中被重新利用。目前的一个局限在于，由于现有培养人囊胚或囊胚样结构（在相当于形成后第 7–13 天）的方案尚不够优化，我们尚无法评估该模型在多大程度上能够准确模拟着床后的发育过程。
利用单细胞RNA测序（scRNAseq）、适当的参考图谱和生物信息学方法，可轻松分析囊胚样细胞的转录组状态。此前的转录组分析显示，于PXGL培养基中培养的人多能干细胞（hPSCs）相较于 primed 状态，更接近囊胚期上胚层细胞。若参考图谱仅包含囊胚期细胞，则数据分析可能存在局限性。为了评估是否存在潜在的非靶向细胞，参考图谱应纳入来自着床后胚胎的细胞。未来，若能建立包含人类着床前及着床后概念体所有组织的参考图谱，将对囊胚样细胞的标准化评估极具价值。此外，整合多组学的单细胞参考图谱，例如同时包含转录组、染色质可及性和DNA甲基化数据的图谱，将进一步推动该领域发展。最后，建立标准化的生物信息学分析方法，以定量评估胚胎模型细胞与参考概念体之间的相似性，并准确识别非靶向细胞，将有助于无偏倚地分析和比较研究结果。
总体而言，通过同时抑制Hippo、TGF-β和ERK三条信号通路所形成的囊胚样结构（blastoids）具备以下四个特征：1）形态发生效率高；2）细胞谱系特化顺序正确；3）在转录组水平上具有高度纯的囊胚样细胞；4）能够模拟着床前后发育过程。这些囊胚样结构的特性将有助于建立关于囊胚发育和着床过程的科学假说，但它们并不能重现胚胎发育的早期阶段。与人类囊胚在获取和应用上的局限性相比，囊胚样结构更适用于开展基因功能和药物筛选研究，以深入探究囊胚发育与着床的机制。未来，这些基础研究成果有望推动体外受精（IVF）培养基配方的优化、促进受精后避孕药物的开发，并改善早期妊娠的临床管理。

实验模型的缺乏限制了对人类早期胚胎发生的理解。目前关于人类胚胎发育特有特征的认识主要来源于多余的 体外 体外受精（IVF）胚胎被捐赠用于研究。然而，胚胎来源有限、实验操作困难以及胚胎质量参差不齐等因素制约了科学研究的开展。相比之下，一种高度忠实的 体外 人类胚胎模型将允许进行复杂的实验操作，从而为人类胚胎研究提供一种符合伦理的补充途径1,2,3,4一种先前建立的小鼠囊胚模型结合了小鼠胚胎干细胞和滋养层干细胞5在此详细方案中，描述了一种利用 naive 多能干细胞生成符合基本囊胚标准的人类囊胚模型的方法。6.
人类囊胚样结构的四个标准。 此处，为了建立人类囊胚样结构（blastoids）的标准化定义，我们提出四个最低标准。尽管这些标准并非详尽无遗，但可作为评估能否形成人类囊胚样结构的参数基础（图1A）。(1) 囊胚样结构应在形态学及三类谱系类比物的生成方面高效形成，这三类谱系分别为上胚层（epiblast, Epi）、滋养外胚层（trophectoderm, TE）和原始内胚层（primitive endoderm, PrE）。效率低下可能提示初始细胞状态不充分和/或培养条件不足（例如囊胚样结构培养基）。(2) 囊胚样结构应按照发育顺序（先Epi/TE，后PrE/极化TE）7,8 和时间进程（诱导约3天；相当于胚胎第5–7天）7,9 依次生成三类谱系的类比物。(3) 囊胚样结构应能形成囊胚阶段的类比结构，但不应发育至着床后阶段（例如着床后上胚层、滋养层细胞或羊膜细胞）。(4) 最后，囊胚样结构应具备模拟囊胚着床及后续发育功能特征的能力。采用本实验方案，人类囊胚样结构可利用多种细胞系高效形成（&#62;70%），可在4天内依次生成囊胚的细胞类比物，且这些类比物在转录组水平上与真实囊胚阶段高度相似（基于多项分析，相似度&#62;96%）6,10,11。最后，这些囊胚样结构能够稳健地建立胚体-反胚体轴（embryonic-abembryonic axis），从而可通过极化区域与激素刺激的子宫内膜细胞相互作用，并在延长培养中（时间等效于胚胎第13天）稳健地扩增各谱系。
初始细胞状态的重要性。人类多能干细胞（hPSCs）可以在不同的状态下被稳定，这些状态试图精确地模拟特定的发育阶段。这些状态由培养条件维持，尽管目前仍不理想，但可将细胞限制在类似于着床前（~&#160;胚胎第5-7天）或着床后（~胚胎第8-14天）的上胚层阶段12。转录组分析显示，在PD0325901、XAV939、Gö6983和白血病抑制因子（LIF）中培养的人类多能干细胞（称为PXGL naive hPSCs）13,14&#160;相较于在成纤维细胞生长因子（FGF）2和激活素中培养的hPSCs15&#160;（称为primed hPSCs12）以及人类扩展多能干细胞（hEPSCs）16&#160;（参见文献17,18,19中的分析），更接近囊胚期上胚层。相应地，primed hPSCs的转录组最接近食蟹猴着床后/原肠胚形成前阶段的上胚层20。其他分子标准，如转座子表达、DNA甲基化和X染色体状态，也证实naive状态的多种变异比primed状态更接近囊胚期上胚层17,21。最后，已成功利用PXGL培养条件直接从囊胚中建立naive hPSC细胞系22。
人类早期囊胚细胞尚未决定其发育命运。 小鼠的谱系特化始于囊胚阶段之前的桑葚胚阶段23。相反，细胞解离与重聚集实验表明，人类早期囊胚的滋养外胚层细胞尚未完全决定其命运24。相应地，通过对人类囊胚细胞进行单细胞RNA测序（scRNAseq）分析发现，首次谱系特化（滋养层/上胚层）发生在囊胚腔形成之后7。这种延迟的人类谱系决定过程与以下观察结果一致：人类多能干细胞（hPSCs）具有形成滋养层细胞的能力25,26,27&#160;，而小鼠多能干细胞则主要限定于上胚层谱系。这些综合观察提示， naive hPSCs 可能代表囊胚阶段的细胞状态，并保留形成三种囊胚谱系的潜能。最近有研究提出，hPSCs 形成胚外类似结构的能力在从 naive 状态向 primed 状态转变过程中，会从倾向于形成滋养外胚层转向倾向于形成羊膜27。因此，naive hPSCs 更接近于着床前阶段17,18,21&#160;，相较于 primed hPSCs27、hEPSCs16, 或中间重编程状态28，其形成滋养层细胞的能力更强，而后三者更倾向于形成着床后类似结构10&#160;（图1B）。因此，起始细胞状态对于形成恰当的胚外类似结构至关重要。尽管目前尚缺乏对所转化的滋养外胚层类似结构进行全面的平行比较分析，但反映早期囊胚状态的 PXGL naive 状态似乎对构建高保真度类囊胚至关重要。
通过抑制信号通路诱导细胞命运特化与形态发生 Hippo 信号通路的抑制是小鼠、牛和人类滋养层细胞特化的一种保守机制9,29,30此外，自2013年以来已知，抑制NODAL信号通路（A83-01）、抑制细胞外信号调节激酶（ERK；PD0325901或等效物），并激活骨形态发生蛋白（BMP）信号通路，可促使始发态人多能干细胞（primed hPSCs）启动与滋养层谱系相关的转录调控网络25,31,32,33,34此外，最近多项研究还证实，抑制NODAL和ERK信号通路并激活BMP信号可促进 naive hPSCs 向滋养层细胞分化25,31,32,33,34最后，如果滋养层特化由 naive 状态启动，细胞将重现滋养外胚层发育进程的某些方面26然而，能够反映囊胚滋养外胚层的自我更新细胞系尚未建立稳定 体外在滋养层细胞特化之后，激活表皮生长因子（EGF）和Wnt信号通路并同时抑制HDAC，可能促进滋养层细胞的发育进程34,35&#160;并稳定细胞，建立可代表着床后细胞滋养层的人类滋养层干细胞系（hTSCs）18,35此类细胞系既可来源于胚泡，也可来源于胎盘组织35.
第二种胚外谱系称为原始内胚层（PrE），在滋养层细胞之后由上胚层指定形成7,9。与小鼠的PrE36不同，人类PrE被认为不依赖于FGF信号通路37,38。通过使用激活素A、Wnt和LIF诱导信号通路，已从 naive hPSCs 建立了代表胚外内胚层（称为nEnd）的细胞系39。与胚胎抑制实验结果不一致的是，体外研究表明，ERK抑制可阻止此类nEND细胞的形成in vitro39。迄今为止，尚未直接从囊胚中成功分离出此类细胞系。
近期，通过结合先前为hTSCs35&#160;和nEND细胞39&#160;开发的培养基的不同变体，已构建出早期胚胎模型，从而利用转化生长因子-β（TGF-β）、EGF和Wnt信号通路的激活剂28,40。这些胚胎模型形成效率较低（10%–20%），且产生的细胞更类似于着床后而非着床前阶段10，包括着床后上胚层、滋养层、羊膜、原肠胚、中胚层组织（约胚胎第14天）以及细胞滋养层的类似物10。相反，对Hippo、ERK和TGF-β通路的三重抑制&#160;可高效引导形成包含囊胚样细胞的囊胚样结构41。除起始细胞状态外，我们提出三重通路抑制（Hippo、ERK、TGF-β）是形成高保真囊胚样结构的第二个关键参数（图1B）。
使用单细胞RNA测序评估细胞状态与对应发育阶段。 囊胚样结构中组成细胞的状态可通过单细胞RNA测序（scRNAseq）分析进行评估。通过仅使用囊胚样细胞，以及与反映着床后阶段的启动态人多能干细胞（primed hPSCs）或人滋养层干细胞（hTSCs）进行比较，可衡量其转录组特征与特定胚胎发育阶段的相似性。20,35通过使用不同定义水平进行聚类分析，可以揭示当定义水平降低时亚群如何逐步合并，从而反映聚类之间的相似性。尽管聚类数量的最优性可以被量化42高分辨率聚类还能揭示微小异常亚群的存在，例如反映着床后的发育阶段10不同簇之间差异表达的基因可通过评估定义阶段特异性谱系的参考基因集的表达水平，提供其在发育过程中对应基因的功能信息。这使得可通过无监督距离图谱（例如，利用富集度最高的基因）或基因集富集分析（GSEA）来量化囊胚样体亚群的富集程度。43使用该类囊胚培养方案，仅形成三个主要细胞簇，其转录组特征分别对应囊胚的三个谱系。其中一个簇包含初始的 naive hPSCs 以及类囊胚中的上胚层类似细胞。对不同时间点细胞的分析揭示了谱系特化的时序性（滋养层细胞在24小时内开始特化，原始内胚层细胞在60小时内开始特化）。高分辨率聚类分析鉴定出一个表达原肠胚形成阶段胚胎特异性基因的细胞亚群（占3.2%，可能为中胚层或羊膜来源）。值得注意的是，初始的 naive hPSCs 中也包含约5%的类似着床后阶段的细胞，与先前报道一致。44在第二次分析中，可将类囊胚细胞合并 计算机模拟 参考细胞取自不同发育阶段的胚胎45,46,47&#160;以推断发育阶段的对应关系。此处，从植入前胚胎中分离的细胞45,46, 体外 培养的囊胚45以及原肠胚形成期的胚胎47&#160;被用作参考点。利用该方案，定量分析发现，通过高分辨率聚类揭示的不匹配的胚状体细胞确实与着床后中胚层和羊膜聚类在一起。在后续步骤中，转录组基准分析应结合转座子表达、DNA甲基化以及X染色体状态的分析，这些同样可提供发育阶段的重要标志21.
评估人类囊胚样结构的轴向形成及其他功能特性。 成熟的囊胚具有胚性-反胚性轴的形成特征，该轴可调控滋养层细胞以实现着床。利用本囊胚样结构培养方案，可观察到明显的轴向形成，表现为近端滋养层细胞（例如 NR2F2+/CDX2-）的成熟，这些细胞仅在激素刺激条件下才具备与子宫内膜类器官细胞黏附的能力48,49。与未形成上胚层的滋养层球体进行比较发现，这些内部细胞可诱导相邻的滋养层细胞成熟，从而介导与子宫内膜的初始黏附。当在为食蟹猴囊胚设计的延展培养基中培养时50，囊胚样结构的三个谱系均可持续扩增六天（相当于第13天的发育时间），尽管其组织结构并未反映该发育阶段的真实形态。
高效、高保真人类囊胚样结构的意义 由于难以获取人类胚胎且在遗传和物理操作上存在技术困难，因此在人类胚胎中验证在模式生物中发现的发育原理本质上具有挑战性。一种高效且高保真的人类囊胚样模型将能够实现高通量的遗传和药物筛选，而这正是科学与生物医学发现的基础。此外，引入复杂的遗传修饰以调控并记录生物学过程，将有助于补充此类研究。总体而言，我们提出，对 naive PXGL 状态的人多能干细胞（hPSCs）进行三重抑制（Hippo、TGF-β、ERK）有助于高效生成符合四项最低标准的高保真人类囊胚样结构。该方案具有可扩展性和多功能性，适用于提出靶向性假设，随后可在人类囊胚中进行验证。因此，人类囊胚样结构并不会取代人类胚胎的研究使用 体外 研究可能成为一种有力手段，通过此前难以实现的实验方法，推动科学和生物医学发现进程。本方案展示了如何构建人类囊胚样结构（blastoids），以及如何分析其中包含的细胞。

<table><tbody><tr><td>Neurobasal 培养基</td><td>in house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>in house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100X N2 添加剂</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>50X B27 添加剂</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>100X Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050038</td><td></td></tr><tr><td>100 mM 丙酮酸钠</td><td>Gibco</td><td>11360039</td><td></td></tr><tr><td>MEM-非必需氨基酸</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>1 M Hepes</td><td>in house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mM 2-巯基乙醇</td><td>Thermofisher</td><td>31350010</td><td></td></tr><tr><td>100X 青霉素-链霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7979</td><td></td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Medchem express</td><td>HY-10254</td><td></td></tr><tr><td>XAV-939</td><td>Medchem express</td><td>HY-15147</td><td></td></tr><tr><td>G&amp;ouml; 6983</td><td>Medchem express</td><td>HY-13689</td><td></td></tr><tr><td>人重组白血病抑制因子</td><td>in house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>A83-01</td><td>Medchem express</td><td>HY-10432</td><td></td></tr><tr><td>1-油酰溶血磷脂酸（LPA）</td><td>Peprotech</td><td>2256236</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Medchem express</td><td>HY-10583</td><td></td></tr><tr><td>CMRL 培养基</td><td>Gibco</td><td>21530027</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut 血清替代物（KSR）</td><td>Thermofisher</td><td>10-828-028</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Biozym</td><td>B423201</td><td>细胞解离溶液</td></tr><tr><td>Geltrex</td><td>Thermofisher</td><td>A1413302</td><td>生长因子基底膜提取物</td></tr><tr><td>TROP2 抗体</td><td>R&amp;amp;D systems</td><td>MAB650</td><td></td></tr><tr><td>PDGFR&amp;alpha; 抗体</td><td>R&amp;amp;D systems</td><td>AF307</td><td></td></tr><tr><td>SC-144</td><td>Axon</td><td>2324</td><td></td></tr><tr><td>XMU-MP-1</td><td>Med Chem Express</td><td>HY-100526</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td></td><td></td><td>基底膜基质</td></tr><tr><td>Countess 细胞计数板</td><td>Thermo fisher</td><td></td><td>细胞计数载玻片</td></tr><tr><td>DAPI 染色液</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-111-570</td><td></td></tr></tbody></table>

模拟囊胚发育与着床的人类胚状体实验方案

Protocol for Human Blastoids Modeling Blastocyst Development and Implantation

由干细胞形成的类人囊胚模型（类囊胚）将有助于推动科学与医学的进步。然而，其预测能力取决于该模型能否高效、及时且忠实地重现囊胚发育过程中的各个阶段（形态发生、细胞命运决定、模式形成），并生成反映囊胚阶段特征的细胞类型。本文表明，在PXGL培养条件下培养的 naïve 人类多能干细胞，若同时对Hippo、转化生长因子-β（TGF-β）和细胞外信号调节激酶（ERK）通路进行三重抑制，可高效地发生形态发生，形成类囊胚（&gt;70%）。这些类囊胚的发育时间与真实胚胎相符（约4天），依次产生滋养层和上胚层的类似结构，随后形成原始内胚层和极滋养层的类似结构，从而逐步重现囊胚阶段的细胞命运决定顺序。最终生成的细胞在转录组水平上与真实囊胚高度相似（&gt;96%），仅包含少量类似着床后阶段的细胞。类囊胚能够有效建立胚内-胚外轴，其极化区域（NR2F2+）逐渐成熟，形成明确的极性结构，并具备定向黏附于激素刺激的子宫内膜细胞的能力，这一行为与体内（in utero）着床过程相似。此类人类类囊胚是一种可扩展、多功能且符合伦理的体外（in vitro）模型，可用于研究人类早期发育与着床过程。

通常，在 PXGL 培养条件下（图 2A）培养的 naive hPSCs 会形成聚集体并出现空腔结构，在 PALLY 诱导后 48 至 72 小时之间出现，并在 96 小时内达到 150–250 µm 的直径（图 2B）。通过优化（1）接种细胞数量、（2）N2B27 预培养聚集阶段的持续时间（0 至 24 小时）、（3）各化学组分的浓度（尤其是 LPA）以及（4）PALLY 处理的持续时间，诱导效率可达 70%–80%，该效率依据形态测量参数（总体大小为 150–250 µm、单个规则空腔、单个内细胞团；图 2C、D）及三种谱系的存在来定义。初始细胞状态不佳和/或诱导条件不理想将导致囊胚样结构形成效率降低或无法形成。为确保最高效率并仅生成着床前阶段的类比结构，使用高质量的 naive PXGL hPSCs 培养物至关重要。可通过流式细胞术（FACS）检测表面标志物 SUSD2（naive 状态）和 CD24（primed 状态）阳性细胞的比例来评估细胞状态。此外，针对脱靶的胚外谱系（如羊膜、胚外中胚层）的其他特异性表面标志物也将有所帮助，但据我们所知，目前尚无可用标志物。如果获得的形成效率低于报道结果，则需仔细检查囊胚样结构培养基中的所有组分，尤其是以 PBS 重悬的 LPA——作为一种 GPCR 配体，其稳定性可能低于以 DMSO 重悬的合成分子。在大多数情况下，即使产率未达最佳，所形成的空腔结构仍包含三种囊胚谱系。三种囊胚谱系的出现及胚胎-反胚胎轴的形成可通过免疫荧光染色标志物加以确认（EPI：NANOG、OCT4；TE：GATA3、极化滋养外胚层 NR2F2、壁滋养外胚层：CDX2；PrE：GATA4；图 2E、G）。仅由滋养层（TE）构成的滋养层球（trophospheres）有助于进一步解析细胞间通讯的作用。滋养层球可在诱导后 96 小时内以 50%–60% 的效率形成（图 2H、I）。囊胚样结构的形成不仅可在自制的微孔阵列中进行，也可在 commercially available 的超低吸附 96 孔板中通过优化诱导条件实现（见实验方案及 图 2J）。囊胚样结构还具备进一步发育的能力，最长可体外发育额外 6 天，相当于胚胎发育第 13 天，可通过 in vitro 分化方案实现（图 2K）。
为了进一步表征囊胚样细胞的细胞状态，必须使用单细胞RNA测序技术。通常应用UMAP来可视化细胞状态的分布，并在其基础上进行无监督聚类分析，以评估各个细胞状态之间的接近程度。单细胞数据分析中的不同参数可能会影响细胞在UMAP图中的显示方式，从而导致聚类呈现出不同的空间位置、相对位置和形态（图3A）。然而，在本分析中，无论采用何种参数进行聚类和数据可视化，细胞均表现出高度可重复的明显不同聚类特征，从而能够高置信度地区分出三种囊胚谱系。我们使用了来自不同发育阶段获取的胚胎细胞作为参考。这些数据集的整合显示，大多数来自囊胚样结构的滋养外胚层类似细胞与着床前滋养外胚层聚类在一起，而不与着床后滋养层细胞聚类（图3B）。这些结果也得到了一个独立研究联盟的证实10。
当将卡内基第7阶段（CS7）的原肠胚引入参考图谱时，少量类囊胚细胞（3%）与这些胚胎的中胚层和羊膜谱系聚类（图3C）。当将类羊膜细胞引入参考图谱时，少量类囊胚细胞（&lt; 2%）与这些类羊膜细胞聚类。
总体而言，只有具备单个规则腔体、单个内细胞团簇、整体大小在150-250 µm之间、包含囊胚三个谱系的转录组学类似物，并且基本不含其他谱系（如羊膜、中胚层、胚外中胚层）的结构，才被视为人类类囊胚。
<img alt="人源胚样体标准示意图；谱系特化、形成过程、着床前后建模；单细胞RNA测序。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63388/63388fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：生成高保真胚样体的四个特征与两种策略。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63388/63388fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="使用 naive hPSC 在 PALLY 培养体系中形成类囊胚的过程示意图与图表。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63388/63388fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2：由 naive hPSC 聚集体衍生的类囊胚和滋养层球体。（A）相差显微图像，显示在 PXGL 培养基中与经辐照的 MEF 共培养的 naive hPSC。比例尺：50 µm。（B）相差显微图像，显示 naive hPSC 聚集体在含有 500 nM LPA 的非黏附性水凝胶微孔阵列上培养时的形态变化（PALLY 培养基）。比例尺：200 µm。（C）在微孔阵列上培养 96 小时后形成的类人囊胚。比例尺：400 µm。（D）在优化 LPA 浓度的 PALLY 培养条件下，不同 naive hPSC 系所形成的含有类人囊胚的微孔百分比的定量分析（n = 3 个微孔阵列）。（E）类人囊胚的免疫荧光染色结果，包括上胚层（EPI）标志物（黄色）NANOG 和 OCT4；滋养外胚层（TE）标志物（青色）CDX2 和 GATA3；以及原始内胚层标志物（洋红色）SOX17 和 GATA4。比例尺：100 µm。（H-I）基于对 OCT4、GATA3 和 GATA4 的免疫荧光染色，对类囊胚（培养 96 小时）中各谱系细胞数量（左）和细胞占比（右）的定量分析。（G）类人囊胚的免疫荧光染色结果，显示 CDX2（青色）和 NR2F2（洋红色）。（F）分别通过添加 3 µM SC144（H）或 2 µM XMU-MP-1（I）在微孔阵列上诱导形成的早期和晚期滋养层球体的相差显微图像。（J）在含 500 nM LPA 的超低吸附 96 孔板中培养的 naive hPSC 聚集体的形态变化的相差显微图像（PALLY 培养基）。（K）在植入后培养条件下培养 6 天的类囊胚的相差显微图像（左）和免疫荧光染色图像（右），染色标志物为 OCT4（黄色）、GATA3（青色）和 GATA4（洋红色）。比例尺：100 µm。本图改编自6,10。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63388/63388fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="UMAP 图谱；单细胞 RNA 分析；类囊胚、原肠胚及胚胎细胞的比较" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63388/63388fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 3"> 
图 3：通过单细胞测序对类囊胚组成进行表征。（A）基于不同参数对来自类囊胚不同时间点（24 h、60 h、96 h）、naive hPSCs、primed hPSCs 和 hTSC（代表着床后细胞滋养层）的单细胞转录组进行无监督聚类分析，并在 UMAP 图谱上展示。（B）将来自类囊胚（96 h）、naive hPSCs 和 primed hPSCs 的细胞转录组与已发表的人类胚胎数据集整合，包括着床前、围植入期（in vitro 培养的囊胚）以及原肠胚形成期（卡内基第7阶段，即 E16–19）阶段。单个细胞根据其在人类胚胎中的来源（左）、类囊胚来源的细胞或干细胞（中）以及无监督聚类分析结果（右）进行着色。（C）将来自类囊胚、naive hPSCs、primed hPSCs 的细胞转录组与已发表的原肠胚形成期（卡内基第7阶段，即 E16–19）胚胎数据集整合后的 UMAP 图谱。单个细胞根据其在人类胚胎中的来源（左）、类囊胚来源的细胞或干细胞（中）以及无监督聚类分析结果（右）进行着色。本图改编自6。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63388/63388fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的高清版本。</a>
补充表1：本研究中使用的所有培养基成分。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63388/Supplementary%20Table%201%20_RE.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>

一种高效、及时且有序地生成类胚泡细胞的人类胚状体形成方案。

由干细胞形成的类人胚泡模型（blastoid）将有助于推动科学与医学进步。然而，其预测能力将取决于……

由于人类胚胎的可获得性较低且存在伦理问题，人类胚胎研究受到限制，因此获得能够真实模拟早期人类发育的个体模型将有助于科学和医学的进步。该技术预测人类发育的能力取决于其能否有效重现囊胚细胞决定和形态发生的序列，包括发育的顺序和节奏，此类模型将确保形成真正反映囊胚阶段的细胞。未来，人类囊胚样结构（blastoids）可能被用于识别治疗靶点并促进临床前建模，例如优化体外受精培养基，或开发非激素类避孕药。演示该实验步骤的人员为 Harunobu Kagawa、Alok Javali、Heidar Heidari Khoei、Theresa Maria Sommer 和 Giovanni Sestini。首先，准备并预热 PXGL 培养基、N2B27 基础培养基、洗涤缓冲液、PBS 和聚集培养基。在形成胚状体时，需从 hPSC 悬液中去除 MEFs。为排除MEF，通过向六孔板的孔中加入1毫升0.1%明胶制备明胶包被的培养板。将培养板在37摄氏度孵育30至90分钟。收集细胞时，移除培养基，并用1毫升PBS洗涤细胞。向六孔板的每个孔中加入 500 µL 细胞解离溶液，在 37°C 下孵育 5 分钟。在显微镜下观察细胞，以监测集落解离为单个细胞的过程。用 1 mL 洗涤缓冲液稀释细胞解离溶液。用移液器轻柔吹打5到10次，从培养板中收集细胞。将细胞悬液转移至15毫升离心管中。在200 RCF下离心4分钟，沉淀细胞。吸去上清液，然后将细胞重悬于每孔1.5毫升的PXGL培养基中。将细胞接种至明胶包被的培养板中用于MEF去除，并在37摄氏度孵育60至90分钟。一旦初始态细胞接种用于MEF去除后，即从MicroWells中移除PBS，并向每个MicroWell芯片中加入200微升基础N2B27培养基以平衡孔内环境，于37摄氏度孵育60分钟。收集含有未贴壁的初始细胞的上清液，转移至15毫升离心管中，在200 RCF下离心4分钟以沉淀细胞。弃去培养基，将细胞重悬于1毫升N2B27基础培养基中。使用细胞计数板对细胞进行计数。在200 RCF条件下离心4分钟。弃去上清液，加入适量含有10 µM Y27632的N2B27培养基，调整细胞密度至每50 µL含30,000个细胞。从已平衡的微孔阵列中移除培养基，加入含10 µM Y27632的25 µL N2B27培养基。加入50 µL细胞悬液，于37°C孵育15分钟，使细胞沉降至微孔底部。随后加入125 µL N2B27培养基，补充10 µM Y27632。24 小时内，将在 MicroWell 芯片上观察到 naive hPSCs 的聚集体。通过配制 PALY 培养基启动类囊胚的形成，并将其在 37 摄氏度预热 30 分钟。移除聚集培养基，向微孔中加入 200 微升预热的 PALY 培养基。将细胞培养板放回 37 摄氏度的低氧培养箱中。在第 1 天重复更换培养基。第2天，移除PALY培养基，加入200微升N2B27培养基，添加LPA和10 µM Y27632。第3天重复换液。第4天完成类囊胚的形成。按照前述方法制备未分化的hPSC细胞悬液用于囊胚样结构形成。弃去培养基，加入适量含有10微摩尔Y27632的N2B27培养基，使细胞密度达到每100微升培养基含70个细胞。为使细胞在孔板底部聚集，将孔板在室温下以200 × g离心2分钟。在37摄氏度的低氧培养条件下孵育培养板。24小时内，可在孔中观察到初始态hPSC的细胞聚集体。向孔中加入100微升新鲜配制并预热的两倍浓度PALY培养基。将细胞培养板放回37摄氏度的低氧培养箱中。24小时后，弃去一半培养基，并加入100 µL预热的PALY培养基。重复此步骤至第4天。按照前述方法制备初始态HPSC细胞悬液以形成滋养层球体。初始态HPSC聚集体在24小时形成后，将聚集体培养基更换为不含LIF的PALY培养基，并添加3 µM SC144，以形成代表早期滋养外胚层的滋养层球体。为形成代表成熟滋养外胚层的滋养层球体，将聚集体培养基更换为PALY培养基，并添加2 µM XMUMP1。每天更换培养基。到第四天时，滋养层球体完全形成。为评估细胞状态，将类囊胚和滋养层球体的转录组数据与相应的对照组进行比较，包括类植入后的人滋养层干细胞。在PXGL培养基中培养的 naive hPSCs 经 PALY 诱导后，于48至72小时之间形成聚集体并出现空腔结构，在96小时内直径达到150至250 µm。根据形态测量参数及三种谱系的存在情况，诱导效率达到70%至80%。Trophospheres 在诱导后96小时内以50%至60%的效率形成。在优化的诱导条件下，Blastoid 可在市售的超低吸附96孔板中成功形成。采用单细胞RNA测序技术进一步表征囊胚样细胞状态。无论使用何种参数进行数据聚类与可视化，细胞均表现出高度可重复的显著不同聚类特征，从而能够可靠地区分出三种囊胚谱系。在24至60小时期间，PXGL多能干细胞形成了类似于上胚层和滋养外胚层的结构。随后在60至96小时之间，形成极性滋养外胚层和原始内胚层的类似结构。这与囊胚内细胞谱系特化的顺序一致，因此类囊胚重现了谱系特化的发育序列。将类囊胚的数据集与来自不同发育阶段胚胎细胞的参考数据集进行整合分析显示，97%的类囊胚细胞与囊胚期细胞聚类在一起，而不与植入后胚胎的细胞聚类。独立分析证实，随着时间推移，这些干细胞形成的细胞在转录水平上与人类胚胎第5天至第7.5天的细胞相匹配。这正是人类胚泡形成的发育阶段。研究还证实，类胚体中超过95%的细胞具有与胚泡三种细胞谱系相匹配的转录组，而约3%的细胞偏离目标，与着床后阶段的细胞相匹配。值得注意的是，我们观察到最初的二维培养物中也包含约 5% 的非靶细胞。通过观察特定标志物的表达模式，例如囊胚滋养层细胞的 CDX2 和囊胚上胚层的 PRMD14，也可以可视化相应的发育阶段。初始 PXGL 培养的质量至关重要，初始聚集体中的细胞数量同样关键，可通过 MicroWells 进行控制。24小时后，细胞聚集体的总体大小应约为50至70微米。具有完整阶段的类囊胚高效形成，为研究人类胚胎的着床过程及着床后发育开辟了道路。

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科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

人爆破模拟胚发育和植入的协议

在本视频中，我们演示了小鼠囊胚的分离以及从囊胚中建立滋养层干细胞的方法。同时介绍了维持干细胞特性的培养条件，以及在体外诱导其分化的方案。...

从小鼠囊胚中分离滋养层干细胞

单个胚胎细胞的命运可能受到继承分子和/或邻近细胞信号的影响。利用卵裂期非洲爪蟾胚胎的命运图谱，可以鉴定出单个卵裂球并进行分离培养，以评估继承分子与细胞间相互作用各自的贡献。...

用于检测胚胎发育过程中细胞命运决定的卵裂球外植实验

MicroSecure玻璃化冷冻技术是一种非商业化、无菌封闭式玻璃化冷冻装置系统，符合美国食品药品监督管理局（FDA）的优良生产规范和组织处理规范。由于行业内已停用疏水性带塞胚胎...

改良型MicroSecure玻璃化冷冻：一种安全、简便且高效的人类囊胚冷冻保存方法

本文介绍了一种时间延时形态测量方案，用于追踪囊胚在玻璃化冷冻前干预过程中的收缩强度以及复温后重新扩张的过程。该方案可应用于 体外...

囊胚玻璃化冷冻与复温过程中行为客观评估的形态计量学方案

囊胚活检和玻璃化冷冻对于高效开展胚胎植入前遗传学检测至关重要。该方法在授精后第5至7天，依次打开透明带并获取7-8个滋养层细胞，可最大限度减少所需操作次数，并降低胚胎暴露于非最佳环境条件下的风险。...

人类囊胚活检与玻璃化冷冻

本文介绍了一种方法，用于解冻玻璃化保存的人类囊胚，将其在体外培养至着床时期，消化为单细胞，并收集早期滋养层细胞以供进一步研究。...

单细胞收集围植入期人类胚胎中的滋养层细胞

本方案描述了建立简单高效胚胎移植的方法 体外...

体外胚胎植入模型的建立

本研究中，我们介绍了一种对斑马鱼幼鱼进行伊文思蓝染料（EBD）分析的简便方法。该技术是表征骨骼肌完整性和建立斑马鱼肌肉营养不良模型的有力工具，也是开发新型治疗手段的重要方法。...

伊文思蓝染色法分析斑马鱼幼鱼骨骼肌完整性

微阵列技术能够对全基因组范围内的转录本进行定量检测和基因表达谱分析。因此，本实验方案提供了一种优化的技术流程，采用定制的双色牛微阵列，利用第7天的牛胚胎，以证明使用极少量总RNA的可行性。...

转录组分析 体内 利用双色微阵列平台制备牛植入前胚胎

本文介绍了一种利用改良版蒂里尔社会应激测试（Trier Social Stress Test,...

一种针对脆弱墨西哥裔美国青少年的改良版特里尔社会应激测试

了解人类囊胚样体形成技术，通过PXGL和N2B27培养基诱导naive hPSC聚集分化，实现70-80%的囊胚形成效率。该方法为早期人类发育研究及辅助生殖技术改进提供重要模型。

模拟囊胚发育与着床的人类胚状体实验方案

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