人源肝脏微生理系统用于体外评估药物性肝毒性 In Vitro

该方案描述了如何利用微生理系统在体外评估药物诱导的肝损伤，该系统可维持高功能性和代谢活跃的肝微组织长达四周。此方法是一种针对人类的特异性细胞培养模型，能够准确检测新型化合物导致药物性肝损伤的风险，其预测能力优于简单的二维培养，甚至比更复杂的三维培养更具预测性。该技术可作为一系列临床前安全性测试的一部分，用于判断某种化合物是否适合启动临床研发。

可测试多种不同的模式。通过将控制器连接到细胞培养孵育箱中的对接站外壳，开始建立肝脏微生理系统。确保将新鲜的干燥剂添加到位于控制器后部的干燥剂罐中。

按下船型摇杆开关启动控制器后，等待五分钟，使系统稳定并达到压力。从包装中取出每块培养板。接着，向储液端加入500 µL预热的接种用高级DMEM培养基，对每个孔进行预润处理。

将驱动器放置到培养箱中的对接站上。完成后，在控制器屏幕上选择引物程序，直至液体流过滤膜支撑物。为覆盖表面通道，向所有孔中加入 1.1 毫升接种用高糖 DMEM 培养基。

将带有培养板的驱动器放入37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中孵育后，连接对接站并运行孵育程序。将PHHs和HJCs冻存管置于37摄氏度水浴中，直至仅剩少量冰晶时完成解冻。解冻后，轻柔地将最多两管PHHs直接用移液器转移至含有预热的冷冻保存肝细胞复苏培养基（CHRM培养基）的离心管中。

然后用1 mL CHRM从冻存管中冲洗残留的细胞。将冻存管中的HKCs轻轻吹打并转移至含有10 mL冰上预冷的接种用高级DMEM培养基的50 mL离心管中。随后，于室温下以100 × g分别离心两种细胞10分钟。

离心后，吸除上清液，然后每管加入一毫升培养基，将肝细胞（PHHs）重悬于预热的接种用高级DMEM培养基中，将肝基质细胞（HKCs）重悬于冰上预冷的接种用高级DMEM培养基中。轻轻摇动使细胞重悬，随后置于冰上。细胞悬浮后，进行细胞计数并记录细胞活力。

细胞存活率必须高于85%。接下来，将驱动器从对接站断开，并将其放入微生物安全柜（MBSC）中。然后，从支架上方的通道、储液区和培养腔中吸除培养基，每个培养孔中保留0.2毫升的残留体积，液面刚好位于支架上方。在将驱动器放回培养箱中的对接站之前，向培养腔中加入400微升接种用高糖DMEM培养基，并运行培养基更换程序3分钟。

三分钟后，将驱动器从对接站断开，并将其放回 MBSC 中。从上述支架处吸除培养基，直至每个孔的储液端停止点，随后轻轻摇动试管使原代人肝细胞（PHH）重新悬浮，并将所需体积的细胞悬液加入每个培养孔中。小心地用移液器加入细胞悬液，确保细胞在孔板支架上均匀分布。

小心重悬人角质形成细胞（HKCs），并将细胞悬液加入每个培养孔中。待所有孔中均含有两种细胞类型后，将微生理系统（MPS）驱动器放置于培养箱内对接站上，先不进行物理连接，静置一小时。一小时后，将驱动器连接至对接站，并运行接种程序。

当程序在两分钟时自动暂停后，将驱动器从培养箱中取出，并缓慢向通道中加入 1,000 微升接种用高糖 DMEM 培养基，使总体积达到 1.4 毫升。随后将培养板放回培养箱，继续运行剩余的接种程序八小时。第四天时，在控制器上暂停程序，并将驱动器和培养板从对接站上断开。

将它们转移至MBSC中。使用移液器从每个孔中手动收集约一毫升培养基用于可溶性生物标志物分析，注意勿触碰支架，以免干扰细胞培养。将收集的培养基标记为第4天样品，并进行乳酸脱氢酶和尿素检测作为质量控制检查，以确保接种成功。

接下来，根据板图通过更换培养基对每个孔进行给药。操作完成后，将驱动器放回培养箱中的对接站，并运行孵育程序。第六天，将驱动器和培养板从对接站断开，并转移至MBSC。

使用移液器从每个孔中收集约一毫升培养基，标记为给药后48小时样品，并将样品储存在-80摄氏度，用于后续检测。在第8天，用镊子将支架从孔板中取出，放入含有500微升不含钙和镁的DPBS的24孔板中，每孔放置一个支架，注意不要扰动微组织。在倒置光学显微镜下以10倍放大倍数拍摄每个支架的图像。

在第四天给药前，通过乳酸脱氢酶（LDH）释放和尿素合成对形成的肝微组织进行质量控制检测。在第八天，检测了多种健康和肝脏相关指标，如白蛋白、尿素、CYP3A4、ATP，以确认微组织中肝脏功能的高水平及可重复性。相差显微镜观察及肝微组织的免疫荧光染色显示，HKCs在PHH微组织中分布均匀。

肝脏微组织急性暴露于曲格列酮后产生毒性，可通过丙氨酸氨基转移酶（ALT）和乳酸脱氢酶（LDH）的释放以及白蛋白和尿素生成的迅速减少来检测。ATP含量和CYP3A4活性进一步证实了曲格列酮引起的毒性，其EC50值与其他检测终点高度一致。在MPS中培养8天后拍摄的明场显微镜图像显示，对照组中肝脏微组织健康，细胞在支架内均匀分布。

在使用阳性对照和曲格列酮处理的重复实验中观察到组织死亡或降解。此外，还研究了吡格列酮暴露后的肝毒性。未检测到乳酸脱氢酶（LDH）或丙氨酸氨基转移酶（ALT）的释放，但在暴露48小时后观察到白蛋白和尿素生成有轻微减少。

在高浓度吡格列酮条件下，观察到ATP含量轻微降低。EC50值由剂量-反应曲线生成。显微镜观察显示，在最高两个测试浓度的吡格列酮暴露96小时后，微组织出现轻微改变。

在本研究中，使用细胞活力高于85%且质量良好的细胞，对于在微生理系统中生成高功能性和健康的三维微组织至关重要。通过此方法，我们可在疾病模型（如非酒精性脂肪性肝炎或使用肝实质和非实质细胞三重共培养的非酒精性脂肪肝病模型）上评估腺苷以及药物-药物相互作用和药物诱导的肝损伤。