Name: 使用荧光团辅助碳水化合物电泳（FACE）方法测定糖原的葡聚糖链长分布 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-31T13:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 13 s
Description: 学习使用荧光团辅助碳水化合物电泳（FACE）技术分析糖原的葡聚糖链长分布和平均链长。该方法利用荧光标记和反向极性电泳分离，为研究糖原代谢相关疾病如Andersen病提供可靠的分子机制解析手段。

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本工作得到了法国国家科学研究中心（CNRS）、里尔大学CNRS以及法国国家研究局（ANR）资助项目的支持 &#34;MathTest&#34; （ANR-18-CE13-0027）

1. 去分支酶孵育
<ol>
	<li>将200 µL浓度为0.5–2 mg/mL的纯化糖原与200 µL 100 mM乙酸盐缓冲液（pH 4.8）混合。加入2 µL异淀粉酶（180 U/mg蛋白）和1.5 µL普鲁兰酶（30 U/mg蛋白）（见材料表），用移液器轻轻吹打混匀，于1.5 mL离心管中42 °C孵育16小时。 
	注：在糖原纯化过程中可能发生降解或淀粉酶污染。为评估游离麦芽寡糖的存在，可平行设置不加去分支酶混合物的对照样品进行孵育。分析时应包含一个标准品（如麦芽庚糖），以确定洗脱时间与聚合度之间的关系。</li>
	<li>在95 °C孵育5分钟以终止反应。</li>
	<li>室温下以16,100 × g离心5分钟，沉淀并去除不溶性物质。</li>
	<li>用移液器移去上清液，并转移至新的标记离心管中。通过加入相当于100 µL的阴/阳离子交换树脂珠（AG-501-X8，见材料表）对上清液进行脱盐处理，并进行振荡。
	<ol>
		<li>持续振荡树脂珠5分钟。用移液器收集样品，转移至新的标记离心管中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>采用冷冻干燥或在30 °C下使用真空浓缩仪（见材料表）将样品干燥。</li>
	<li>将干燥后的样品在室温或-20 °C保存。 
	&#8203;注：样品可保存1个月。</li>
</ol>
2. 还原胺化
<ol>
	<li>将干燥的样品与2 µL的1 M氰基硼氢化钠（溶于四氢呋喃，THF）和2 µL的APTS（5 mg APTS溶于48 µL的15%乙酸中）混合（参见材料表）。</li>
	<li>在42 °C避光孵育16小时。 
	&#8203;注意：氰基硼氢化钠需在佩戴适当的个人防护装备并在化学通风橱中操作。吸入或皮肤接触具有高毒性，可能致命，并可导致严重皮肤灼伤和眼睛损伤。氰基硼氢化钠与乙酸混合时可能产生高毒气体。与水接触时，氰基硼氢化钠会释放易燃气体，可能自燃。从本步骤开始，浓缩样品均需在化学通风橱中操作，并使用适当的个人防护装备。</li>
</ol>
3. FACE 分析
<ol>
	<li>向每个样品中加入46 µL超纯水。</li>
	<li>将样品直接在100 µL微量离心管中用超纯水稀释至1/50，即加入1 µL样品至49 µL超纯水中。在设置FACE期间（5–10分钟），将样品避光保存。</li>
	<li>使用配备激光诱导荧光（LIF）检测器的毛细管电泳仪器进行反极性电泳（参见 材料表）。将极性设置为 &#34;反向模式&#34; 分离时，将LIF设置为488 nm发射波长，检测器设置为512 nm。</li>
	<li>设定注射时间为10秒，注射压力为0.5 psi。</li>
	<li>在裸熔融石英毛细管（长度60.2 cm，内径50 µm，外径375 µm）中，使用超纯水将N-连接碳水化合物分离缓冲液稀释至1/3浓度，以30 kV电压进行APTS标记葡聚糖的分离（参见 材料表). 
	&#8203;注意：N-连接糖分离缓冲液每运行20次后更换一次。</li>
</ol>
4. 数据处理
<ol>
	<li>分别导出包含电泳图谱轮廓和积分数据的 &#34;.ASC &#34; 和 &#34;.CDF &#34; 文件。</li>
	<li>打开 .ASC 文件，根据时间图表绘制相对荧光单位。</li>
	<li>打开 .CDF 文件，首先进行自动积分，并调整以下参数：峰宽、谷对谷积分、最小峰面积。</li>
	<li>手动检查并校正任何不正确的积分事件。</li>
</ol>

<ol><li>Konkolewicz, D., Thorn-Seshold, O., Gray-Weale, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+for+randomly+hyperbranched+polymers%3A+Theory+and+simulation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Chemical+Physics%22%5BJournal%5D)">Models for randomly hyperbranched polymers: Theory and simulation.</a> The Journal of Chemical Physics. 129 (5), 054901(2008).</li>
<li>Deng, B., Sullivan, M. A., Wu, A. C., Li, J., Chen, C., Gilbert, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+for+stopping+chain+and+total-molecule+growth+in+complex+branched+polymers%2C+exemplified+by+glycogen%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">The mechanism for stopping chain and total-molecule growth in complex branched polymers, exemplified by glycogen.</a> Biomacromolecules. 16 (6), 1870-1872 (2015).</li>
<li>Besford, Q. A., Sullivan, M. A., Zheng, L., Gilbert, R. G., Stapleton, D., Gray-Weale, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+cardiac+glycogen+in+healthy+mice%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biological+Macromolecules%22%5BJournal%5D)">The structure of cardiac glycogen in healthy mice.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 51 (5), 887-891 (2012).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+structure+of+glycogen+in+escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22BioMacromolecules%22%5BJournal%5D)">Molecular structure of glycogen in escherichia coli.</a> BioMacromolecules. 20 (7), 2821-2829 (2019).</li>
<li>Ball, S., Colleoni, C., Cenci, U., Raj, J. N., Tirtiaux, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+glycogen+and+starch+metabolism+in+eukaryotes+gives+molecular+clues+to+understand+the+establishment+of+plastid+endosymbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">The evolution of glycogen and starch metabolism in eukaryotes gives molecular clues to understand the establishment of plastid endosymbiosis.</a> Journal of Experimental Botany. 62 (6), 1775-1801 (2011).</li>
<li>Zhang, P., Nada, S. S., Tan, X., Deng, B., Sullivan, M. A., Gilbert, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+glycogen+biosynthesis+through+Monte+Carlo+simulation%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biological+Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Exploring glycogen biosynthesis through Monte Carlo simulation.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 116, 264-271 (2018).</li>
<li>Melendez-Hevia, E., Waddell, T. G., Shelton, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+molecular+design+in+the+evolution+of+metabolism%3A+The+glycogen+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Optimization of molecular design in the evolution of metabolism: The glycogen molecule.</a> Biochemical Journal. 295 (2), 477-483 (1993).</li>
<li>Meléndez, R., Meléndez-Hevia, E., Cascante, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+did+glycogen+structure+evolve+to+satisfy+the+requirement+for+rapid+mobilization+of+glucose%3F+A+problem+of+physical+constraints+in+structure+building%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Evolution%22%5BJournal%5D)">How did glycogen structure evolve to satisfy the requirement for rapid mobilization of glucose? A problem of physical constraints in structure building.</a> Journal of Molecular Evolution. 45 (4), 446-455 (1997).</li>
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<li>Wang, L., Wise, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycogen+with+short+average+chain+length+enhances+bacterial+durability%5BTitle%5D)+AND+%22Naturwissenschaften%22%5BJournal%5D)">Glycogen with short average chain length enhances bacterial durability.</a> Naturwissenschaften. 98 (9), 719-729 (2011).</li>
<li>Kanungo, S., Wells, K., Tribett, T., El-Gharbawy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycogen+metabolism+and+glycogen+storage+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Glycogen metabolism and glycogen storage disorders.</a> Annals of Translational Medicine. 6 (24), 474(2018).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+progress+in+the+structure+of+glycogen+serving+as+a+durable+energy+reserve+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Recent progress in the structure of glycogen serving as a durable energy reserve in bacteria.</a> World Journal of Microbiology and Biotechnology. 36 (1), 14(2020).</li>
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</ol>

作者与本研究无任何利益冲突。

糖原颗粒的理化性质（如大小、形态、溶解度）与构成颗粒的葡聚糖链长度直接相关。生物合成与降解酶之间的任何失衡均会导致链长分布的改变，并 本身 异常糖原的积聚可能对细胞造成危害11. FACE分析是测定糖原链长分布（CLD）的首选方法。如图所示 图2通过测定CLD，可推断糖原的平均链长（ACL），后者反映了糖原颗粒的结构特征。具有较高ACL值的动物糖原与异常颗粒的出现相关。减法分析是一种有效的方法，可用于比较不同遗传背景（突变型与野生型）的两种糖原样品。另一方面，将归一化至最大峰的CLD在对数尺度上作图，其优势在于无需参照物即可比较CLD，从而为我们提供了关于糖原生长机制的信息。
此外，荧光辅助毛细管电泳（FACE）分析是表征糖原代谢酶催化特性的有力技术。例如，所有糖原分支酶均能切割（1 → 4）-α糖苷键，并将寡麦芽糖基团转移至（1 → 6）-α位置或分支点。尽管分支酶具有相似的催化机制，但它们对多糖（如支链淀粉、糖原）的亲和力以及所转移葡聚糖链的长度各不相同，因此可据此加以区分22。因此，可通过一系列孵育实验并结合FACE分析对不同来源的分支酶（如人源、植物源、细菌源）进行表征和分类23。
如引言中所述，HPAEC-PAD 也是一种测定链长分布的替代方法18。这两种技术在根据直链葡聚糖的聚合度（DP）进行分离之前，均需使用异淀粉酶型去分支酶将（1 → 6）-α 糖苷键或分支点完全水解。然而，与 FACE 相比，HPAEC-PAD 方法存在两个缺点：（1）随着葡聚糖链长度的增加，安培脉冲响应减弱，无法提供定量信息。这一质量偏差问题可通过 HPAEC-ENZ-PAD 方法克服，该方法在阴离子交换柱与 PAD 之间引入一个柱后酶反应器24。柱上酶反应器将麦芽寡糖水解为葡萄糖残基，从而实现恒定的脉冲安培响应。（2）HPAEC-PAD 可分离聚合度最高达 70 的葡聚糖链。尽管该分辨率足以用于测定糖原样品的链长分布，但 FACE 可分离聚合度高达 150 的链，因此更适用于淀粉样品17。必须注意的是，HPAEC-PAD 和 FACE 分析各有优缺点。例如，胺化反应需要游离的半缩醛基团与 APTS 的伯胺基团发生反应。这意味着 APTS 标记不能用于缺乏还原性末端的葡聚糖链（如菊粉）。而 HPAEC-PAD 方法则无需还原性末端的存在。HPAEC-PAD 方法的另一个优势在于，阴离子交换柱可承载数毫克的直链葡聚糖，从而可用于纯化特定 DP 的麦芽寡糖或用于酶学测定的 14C 放射性标记麦芽寡糖18,25。最后，尽管质谱技术（如 MALDI-TOF）是一种快速且灵敏的测定链长分布的方法，但该技术的重复性较差，并倾向于高估长链葡聚糖的含量26。然而，该技术仍可用于特定应用，例如通过 MALDI 成像技术绘制糖原在细胞组织中的分布图27。

糖原作为碳源和能量储存物质，是由葡萄糖组成的同多聚物，其结构包含通过(1 → 4)-α糖苷键连接的葡萄糖直链，并通过(1 → 6)-α糖苷键或分支点相互连接。糖原在多种生物体的细胞质中以β-颗粒和α-颗粒的形式存在。β-颗粒是主要在原核生物中观察到的微小水溶性颗粒，直径范围为20–40 nm，其大小可能由糖原代谢酶及空间位阻效应决定1,2。
最初在动物细胞中被描述的较大α颗粒直径可达300 nm，呈花椰菜状。这种特殊结构可能源于多个β颗粒的聚集，也可能由单个β颗粒出芽形成3。有趣的是，最近一项研究报道了在Escherichia coli中存在α颗粒4。然而，与动物细胞中的α颗粒不同，后者在提取过程中会迅速解体，这可能解释了文献中相关数据的缺乏4。真核生物和原核生物中α颗粒的出现涉及系统发育上无关的糖原代谢酶5。这引发了关于此类颗粒功能以及β颗粒之间潜在交联剂性质的问题5。
尽管关于糖原分子形成的两种对立数学模型已被提出6,7,8,9，但普遍认为，β-颗粒的演化是对其代谢功能的响应，即作为高效燃料储备，可快速释放大量葡萄糖。大量证据表明，糖原的性质（如可消化性和在水中的溶解度）与其平均链长（ACL）相关，而ACL将决定分支点的百分比和颗粒大小2,6,7,8,10,11。ACL由葡萄糖残基总数与分支点数量的比值定义。通常，真核生物和原核生物的ACL值分别在11–14和7–23个葡萄糖残基之间变化10。在人类中，多种糖原代谢障碍疾病均源于异常糖原的积累。例如，Andersen病与糖原分支酶活性缺乏有关，导致异常糖原的积聚11。在原核生物中，累积的研究表明，ACL是影响糖原降解速率和细菌存活能力的关键因素12,13。已有报道指出，合成低ACL值β-颗粒的细菌降解更慢，因而能在饥饿条件下存活更长时间。因此，了解β-颗粒的结构对于理解人类糖原贮积病中异常糖原颗粒的形成以及原核生物在营养缺乏环境中的生存至关重要。
自19世纪末法国生理学家Claude Bernard首次从狗肝脏中分离出糖原以来14，已开发出多种技术以详细表征糖原颗粒。例如，透射电子显微镜用于观察糖原形态（α-或β-颗粒）15，用于测定α-1,6糖苷键百分比的质子核磁共振波谱法16，多检测器尺寸排阻色谱法测定分子量，荧光辅助碳水化合物电泳（FACE）17 或使用脉冲安培检测的高性能阴离子交换色谱法（HPAEC-PAD）测定链长分布（CLD）和平均链长（ACL）18.
本研究聚焦于荧光染料辅助的碳水化合物电泳方法，该方法依赖于伯胺对半缩醛基团的还原性胺化反应。早期，首先使用8-氨基-1,3,6-萘三磺酸（ANTS）进行标记；随后，该染料被灵敏度更高的荧光染料8-氨基-1,3,6-芘三磺酸（APTS）所取代19。
<img alt="麦芽三糖标记过程、APTS添加、化学反应图示、荧光分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63392/63392fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：8-氨基-1,3,6-芘三磺酸（APTS）的还原胺化反应。 在还原条件下，8-氨基-1,3,6-芘三磺酸（APTS）的伯胺基团与半缩醛基团发生还原胺化反应 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63392/63392fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
如图1所示，在还原条件下，葡聚糖链还原端的半缩醛基团与APTS的伯胺基团发生相互作用。APTS的磺酸基团带有负电荷，使得葡聚糖链可根据其聚合度（DP）实现分离。该还原胺化反应具有高度可重复性和高效性。对于DP3至DP135的葡聚糖，平均标记效率可达80%，而麦芽糖（DP2）和葡萄糖的标记效率分别可达88%和97%17,20。由于每个APTS分子与一条葡聚糖链的还原端反应，因此可对各条葡聚糖链进行摩尔水平的定量与相互比较。

<table><tbody><tr><td>AG-501-X8 树脂</td><td>BioRad</td><td>#1436424</td><td>室温保存</td></tr><tr><td>100 mM 醋酸钠缓冲液，pH 4.8</td><td></td><td></td><td>将 0.82 g 醋酸钠溶解于 80 mL 水中，用醋酸调节 pH 至 4.8，再加水定容至 100 mL&amp;mdash;室温保存。</td></tr><tr><td>APTS 储备液</td><td>Merck</td><td>09341-5MG</td><td>将 5 mg APT 溶解于 48 mL 0.2 M 醋酸中。-20 &amp;deg;C 保存。</td></tr><tr><td>毛细管</td><td>Sciex Separations, Les Ulis, France</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chromeleon 6.80 SR8 Build 2623</td><td>Thermofisher</td><td></td><td>在打开的窗口中选择：文件&gt;导入/恢复&gt;ANDI/色谱法：点击 &quot;添加&quot;，选择 cdf&amp;nbsp; 文件 &gt; 导入 &gt; 下一步&lt;br/&gt; 选择文件在 Chromeleon 软件中的下载文件夹&gt; 完成后点击 QNT-Editor&gt; 参数 &quot;最小面积&quot;，选择 &quot;范围&quot; 0.05 [信号]*分钟。</td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td>打开 Excel&gt; 新建文件&gt; 保存文件 &gt; 点击文件菜单中的导入 &gt; 在打开的窗口中选择 &quot;csv.&quot; 作为文件类型 &gt; 选择您的 asc 文件 &gt; 将弹出新窗口，第一步：选择 Macintosh 或&amp;nbsp; Windows，第二步和第三步使用默认设置。&gt; Y 值将显示在 A 列中&gt; 手动添加时间列，每个单元格递增 0.25 秒，以对应数据采集频率（4 Hz）。然后绘制图表。</td></tr><tr><td>冷冻干燥装置</td><td>Christ</td><td>alpha 2-4 LO plus</td><td>在冷冻干燥过程之前，样品需在 -80 &amp;deg;C 下保存 1 小时。</td></tr><tr><td>异淀粉酶</td><td>Megazyme</td><td>E-ISAMY</td><td>180 U/mg 蛋白质</td></tr><tr><td>麦芽庚糖</td><td>Merck</td><td>M7753</td><td></td></tr><tr><td>N-连接碳水化合物分离缓冲液</td><td>Sciex Separations, Les Ulis, France</td><td>477623</td><td>4 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>普鲁兰酶</td><td>Megazyme</td><td>E-PULKP</td><td>30 U/mg 蛋白质</td></tr><tr><td>氰基硼氢化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>296813-100ML</td><td>1 M 氰基硼氢化钠的 THF 溶液</td></tr><tr><td>真空浓缩仪</td><td>Eppendorf</td><td>Concentrator 5301</td><td>设定温度为 30 &amp;deg;C。离心至样品完全干燥</td></tr></tbody></table>

使用荧光辅助碳水化合物电泳（face）方法测定糖原的葡聚糖链长度分布

Determination of Glucan Chain Length Distribution of Glycogen Using the Fluorophore-Assisted Carbohydrate Electrophoresis (FACE) Method

糖原颗粒是由葡萄糖基单元通过α-1,4糖苷键连接而成的线性链段组成的支链多糖。这些线性链段通过α-1,6糖苷键相互连接，后者被称为分支点。在多种碳储存形式（例如淀粉、β-葡聚糖）中，糖原可能是生命世界中分布最广泛且最成功的储存多糖之一。葡聚糖链的结构使得大量葡萄糖能够在需要时迅速被储存或供能。过去几十年中，已发展出多种互补技术用于解析糖原颗粒的精细结构。本文介绍荧光标记碳水化合物电泳法（Fluorophore-Assisted Carbohydrate Electrophoresis, FACE）。该方法可定量构成糖原颗粒的葡聚糖链群体。这一参数也称为链长分布（chain length distribution, CLD），可反映颗粒大小及分支百分比，同时也是建立糖原生物合成数学模型的基本前提。

糖原平均链长的测定 
图2 展示了推断糖原链长分布及平均链长（ACL）所需的工作流程。
<img alt="酶促反应流程图：孵育、胺化、FACE 分析、生化研究的数据处理。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63392/63392fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2：测定链长分布（CLD）和平均链长的工作流程。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63392/63392fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
图3展示了市售麦芽六糖和去分支牛肝糖原的电泳图谱。所有实验中在4.13–4.67分钟之间观察到的荧光信号均来自未反应的APTS。标记后的麦芽六糖（DP6）的洗脱时间估计为8.49分钟（图3A）。根据DP6的洗脱时间，鉴定了牛肝糖原的APTS标记葡聚糖（图3B）。在对照样品（未与去分支酶孵育的糖原）中未检测到游离麦芽低聚糖的痕迹（图3C）。
<img alt="显示APTS峰、荧光强度和DP6检测的色谱图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63392/63392fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3：标准品与牛肝糖原的电泳图谱。（A）以麦芽六糖（DP6）这一葡聚糖标准品的洗脱时间（8.49 分钟）作为参考，用于确定去分支酶作用后从牛肝糖原释放的APTS标记葡聚糖的聚合度（DP）（B）。插图显示了聚合度高达44的葡聚糖链的分离结果。同时，对未经处理的牛肝糖原进行APTS标记，以检测样品中是否存在游离麦芽寡糖的痕迹（C）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63392/63392fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
可以得出结论，APTS标记的葡聚糖的释放是由于异淀粉酶和普鲁兰酶活性共同作用于分支点所致。需要注意的是，毛细管电泳图谱可以重新绘制为更合适的格式，以生成包含多个图谱的拼接图。为此，需生成带有“asc”扩展名的DATA文件，并通过选择CSV（逗号分隔值）格式在电子表格程序中打开。然而，导出的荧光值并未与相应的洗脱时间关联，因此必须根据FACE仪器上设置的采集频率手动添加时间信息（例如，4 Hz表示每0.25秒采集一个数据点）。
随后使用FACE仪器的配套应用程序推断峰面积，或导出为扩展名为“cdf”的DATA文件以供其他应用程序使用。将面积值导入电子表格程序，并通过将DP表示为总面积的百分比进行归一化处理（图4）。
<img alt="牛糖原分析；聚合度图表；Excel 数据；分布直方图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63392/63392fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 4"> 
图 4：数据归一化、链长分布及平均链长值。 荧光峰面积被导入电子表格并进行归一化处理。链长分布以每个聚合度（DP）所占的百分比形式展示。平均链长（ACL）通过将每种链长百分比乘以其对应的聚合度后求和计算得出。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63392/63392fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
最后，通过计算每种百分比链长与其相应聚合度的乘积之和，推导出平均链长（ACL）。类似实验对兔肝糖原（图5A）、牛肝糖原（图5B）和牡蛎糖原（图5C）分别进行了三次重复。
<img alt="聚合度分布图；柱状图 A-C 显示了具有 ACL 值的 DP 百分比。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63392/63392fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 5"> 
图 5：商业糖原的链长分布。 兔肝（A）、牛肝（B）和牡蛎糖原（C）在去分支酶（异淀粉酶和普鲁兰酶）存在下进行孵育。随后通过 FACE 分析根据其聚合度（DP）分离 APTS 标记的葡聚糖。麦芽糖（DP2）、麦芽六糖（DP6）和麦芽七糖（DP7）分别为兔肝、牡蛎和牛肝糖原中最丰富的葡聚糖。平均值的标准误（SEM）来自三次独立实验。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63392/63392fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
兔肝糖原的链长分布明显显示出比牛肝糖原（DP 7）或牡蛎糖原（DP6）更高含量的短链麦芽寡糖（DP2）。因此，兔肝糖原的平均链长（ACL = 9.8）低于牛肝糖原（ACL = 11.9）和牡蛎糖原（ACL = 12.6）。需要注意的是，这些市售糖原通常用于测定糖原磷酸化酶或糖原合酶的活性。这表明，糖原代谢酶活性的动力学参数（Vmax 和 Km）的测定结果会因糖原来源的不同而有所差异。
差减分析 
差减分析是一种用于比较两种样品中葡聚糖链分布的简单方法。例如，测定了野生型（WT）Synechocystis PCC6803菌株以及单基因同源glgA1和glgA2突变株产生的糖原的CLD（图6A）。
<img alt="聚合度分析；柱状图与折线图；WT、ΔglgA1、ΔglgA2 的数据比较。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63392/63392fig06.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图6"> 
图6：通过差值分析比较链长分布。（A）利用FACE分析测定从蓝细菌菌株中纯化的糖原的链长分布：野生型（WT）Synechocystis PCC6803 及单基因同源 glgA1 和 glgA2 突变株。标准误（SEM）由三次独立实验推断得出。（B）差值分析通过将WT中每个DP的百分比减去ΔglgA1中对应DP的百分比，以及将WT中每个DP的百分比减去ΔglgA2中对应DP的百分比而获得。这种直接的数学处理可显示突变株中葡聚糖链的变化情况（黑色线条）。（C）根据每种CLD中观察到的最大峰（所有样品均为DP6）对来自Synechocystis野生型及突变株的糖原平均链长分布进行归一化处理。将归一化的CLD绘制在对数坐标上（Nde (DP)）可揭示两个组分，每个组分代表不同的链生长终止机制（更多信息参见参考文献2）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63392/63392fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
需要回顾的是，大多数蓝细菌菌株含有两个编码糖原合酶活性的基因：GlgA1 和 GlgA221。这两种酶均能将 ADP-葡萄糖中的葡萄糖残基转移至线性葡聚糖链的非还原末端。如图6A所示，仅通过观察链长分布谱图来比较样品具有挑战性。差值分析法是通过将各样品间各链长（DP）的百分比相减而实现的（图6B）。野生型（WT）的%DP减去ΔglgA1突变体的%DP所得的差值分析显示，DP3、DP4和DP5存在过剩（负值），而DP10–20含量则降低。相反，野生型与ΔglgA2突变体之间的%DP差值分析则显示出相反的效果。由于GlgA1与GlgA2的差值分析谱图不同，这表明每种糖原合酶同工型在糖原生物合成中具有特定的功能21。
需要注意的是，减法分析仅适用于包含与样品平行进行的参考样本的实验。否则，减法分析可能具有经验性，因其依赖于参考样本归一化的链长分布（CLD）。2015年，Deng 及其合作者在研究小鼠和人类糖原合成终止机制时，提出了一种替代性的糖原CLD绘图与解读方法，以解决这一问题。该方法采用最大峰面积对每个CLD进行归一化，随后将数据以对数尺度作图，突出显示两个组分，后者揭示了链延伸终止的两种不同机制。2通过拟合高DP组分的直线，可直接利用绝对参数（即直线的斜率和截距）进行CLD比较，而无需对参考谱图进行归一化。野生型（WT）的CLD 集胞藻属 PCC6803 菌株和单一同基因型 glgA1 和 glgA2 突变体数据以对数刻度绘制，且为每条曲线确定了拟合线（图6C）。第一个组分在各样本间高度相似，其峰值出现在DP 6处，表明分支酶明确产生此类链的最大值。第二个组分表现为一个宽广的肩峰，此前已在小鼠和人源糖原中有所描述。2第二组分的倾斜在较高的DP下出现 ΔglgA1 且相应拟合线（红线）的斜率低于野生型曲线。因此，GlgA1 的缺失会减缓链延伸在生物合成过程中的终止，而这种终止在小鼠和人类糖原中被认为是由空间位阻所介导的2这些数据表明，剩余的延长酶（即，GlgA2）在链拥挤之前可产生更长的链。在 ΔglgA2相反，观察到拟合线出现更显著的下降，证实了由剩余 GlgA1 产生的链总体上比在空间位阻发生前仅由 GlgA2 合成的链更短。该分析表明，这两种同工型具有不同的动力学特性，或者它们各自与分支酶活性的协同作用存在差异。

本实验方案中，采用荧光辅助碳水化合物电泳（Fluorophore-Assisted Carbohydrate Electrophoresis，FACE）技术测定糖原的链长分布（CLD）和平均链长（ACL）。

使用荧光辅助碳水化合物电泳（FACE）方法测定糖原的葡聚糖链长度分布

糖原颗粒是由葡萄糖基单元通过α-1,4-糖苷键连接而成的线性链组成的支链多糖。这些线性链之间……

该方法有助于更好地理解糖原颗粒的结构组织。这一问题至关重要，因为葡聚糖链的数量，即所谓的链长分布，决定了糖原颗粒的理化性质，例如水溶性。该技术的一个主要优势在于，荧光强度不随葡聚糖链长度的变化而改变。每个葡聚糖分子仅结合一个APTS分子，因此荧光强度与葡聚糖链的数量成正比。辅助毛细管电泳技术领域适用于解析糖原代谢酶的医学机制。例如，我们可以确定分支酶将葡聚糖链转移至受体葡聚糖上后，其聚合度的变化情况。该反应必须在特定条件下进行。因此，必须保护区域免受湿气影响。将200微升浓度为0.5–2毫克/毫升的纯化糖原与200微升pH 4.8的100乙酸缓冲液混合。加入2微升异淀粉酶和1.5微升普鲁兰酶。用移液器轻轻吹打混匀。然后在1.5毫升离心管中于42摄氏度孵育16小时。于95摄氏度孵育5分钟以终止反应。在室温下以16,100 × g离心5分钟，使不溶性物质沉淀并去除。用移液器移除上清液，并将其转移至新的标记管中。将树脂珠加入空的微量离心管后，通过加入相当于100 µL的阴离子阳离子交换树脂珠对上清液进行脱盐处理，并进行振荡混匀。用移液器收集样品，并将其放入新的标记管中。将样品冷冻干燥。将干燥后的样品在室温或 20 摄氏度下保存。将干燥的样品与2微升1摩尔氰基硼氢化钠和四氢呋喃，以及2微升8-氨基-1,3,6-芘三磺酸混合，在避光条件下42摄氏度孵育16小时。向每个样品中加入46微升超纯水。为将样品稀释50倍，取1微升样品加入含有49微升超纯水的100微升微量离心管中。涡旋混匀。在设定仪器界面的同时，将样品置于避光环境中静置5至10分钟。进行反向电泳时，设置方法参数，将进样压力设为 0.5 磅力每平方英寸。然后将极性设为反向模式以进行分离。用超纯水将 N-连接糖类分离缓冲液稀释至原浓度的三分之一。在裸熔融石英毛细管中，使用稀释缓冲液于30千伏条件下进行APTS标记葡聚糖的分离。然后设定进样时间并开始分析。导出包含电泳图谱轮廓的ASC文件和包含积分数据的CDF文件。打开 ASC 文件，根据时间图绘制相对荧光单位。打开 CDF 文件，进行首次自动积分，并使用峰谷到峰谷积分方式和最小面积调整以下参数。手动检查并校正任何不正确的整合事件。在 4.13 至 4.67 分钟之间观察到的荧光信号来源于未反应的 APTS。标记的麦芽六糖（DP 6）的阿留申时间估计为 8.49 分钟。根据DP 6的Aleutian保留时间，鉴定出APTS标记的牛糖原葡聚糖。在未与去分支酶孵育的糖原对照样品中，未检测到游离麦芽寡糖。插图显示了长度达44个葡萄糖单位（DP）的葡聚糖链的分离结果。链长分布以每个DP所占的百分比表示。平均链长通过将每个百分比链长乘以其相应的聚合度后求和计算得出。面部分析显示，麦芽糖和兔肝中含量最丰富的葡聚糖是麦芽糖，牡蛎中为麦六糖，牛肝中为麦七糖。利用面部分析测定了从野生型和突变型蓝细菌菌株中纯化的糖原的链长分布。通过从各突变体每种聚合度（DP）的百分比中减去野生型相应DP的百分比，进行差减分析。根据每种链长分布（CLD）中观察到的最大峰，对来自集胞藻（Synechocystis）野生型及突变体的糖原平均链长分布进行了归一化处理。该技术有助于更深入地理解与糖原代谢缺陷相关的人类疾病，特别是 Andersen 病，该病源于细胞内异常糖原颗粒的积聚。

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科研

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生物化学

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