Name: 低输入细胞核分离和多路复用小鼠交感神经节条形码抗体进行单核RNA测序 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-23T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: 了解低输入单核RNA测序方法，用于小鼠心脏交感神经元的细胞核分离与条形码标记。该技术可实现样本多路复用，为神经科学研究提供高效可靠的实验方案。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

感谢 Susan L. Kloet（荷兰莱顿莱顿大学医学中心人类遗传学系）在实验设计和有益讨论方面提供的帮助。感谢 Emile J. de Meijer（荷兰莱顿莱顿大学医学中心人类遗传学系）在单细胞核 RNA 分离及测序文库制备方面提供的协助。本工作由荷兰科学研究组织（NWO）[项目编号 016.196.346，资助对象 M.R.M.J.] 资助。

本方案描述了小鼠颈段和/或颈胸段（星状）神经节进行单核RNA测序（snRNA-seq）所需的全部步骤。实验使用了雌性和雄性C57BL/6J小鼠（15周龄，每种性别n = 2）。另使用一只Wnt1-Cre;mT/mG小鼠以可视化神经节，辅助解剖操作17,18。该小鼠由B6.Cg-Tg(Wnt1-cre)2Sor/J小鼠与B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J小鼠杂交获得。所有动物实验均依照美国国立卫生研究院（NIH）发布的《实验动物护理与使用指南》进行，并经荷兰莱顿大学动物伦理委员会批准（许可证编号AVD1160020185325，莱顿，荷兰）。有关本方案中使用的所有材料、设备、软件和动物的详细信息，请参见材料表。
1. 准备工作
注意：所有步骤均在细胞培养超净工作台中进行。
<ol>
	<li>将镊子和剪刀浸入70%乙醇中20分钟，进行清洁。</li>
	<li>制备神经节培养基：在Neurobasal培养基中添加B-27 Plus（1倍浓度）、L-谷氨酰胺（2 mM）和1%抗生素-抗真菌剂。将神经节培养基于室温预温。</li>
	<li>制备消化液：在神经节培养基中溶解0.25%胰蛋白酶-EDTA（1:1）和1,400 U/mL II型胶原酶。</li>
	<li>为细胞核分离准备新鲜的冷（4 °C）细胞洗涤缓冲液（0.4%牛血清白蛋白[BSA]）和裂解缓冲液（10 mM Tris-HCl、10 mM NaCl、3 mM MgCl2、0.1%非离子型去污剂，以及在无核酸酶水中配制的40 U/mL RNA酶）。</li>
	<li>制备细胞核洗涤缓冲液（含2.0% BSA和0.2 U/µL RNase抑制剂的1×磷酸盐缓冲液[PBS]）。</li>
	<li>制备ST染色缓冲液（ST-SB）（10 mM Tris-HCl、146 mM NaCl、21 mM MgCl2、1 mM CaCl2、2% BSA、0.02% Tween-20，溶于无核酸酶水中）。</li>
</ol>
2. 成年小鼠颈上神经节（SCG）的解剖
<ol>
	<li>处死小鼠并将其置于冰上。 
	注意：在本研究中，共处死4只C57BL6/J小鼠，采用CO2窒息法。若需为其他研究目的采集大量血液，可改用异氟烷麻醉后放血&#160;。</li>
	<li>用大头针将小鼠固定在解剖板上，并用70%乙醇冲洗，以减少毛发扩散（无需剃毛）。</li>
	<li>在体视显微镜下，用剪刀沿中线切开颈部皮肤，移开下颌下腺，并切除胸锁乳突肌，以暴露并定位颈总动脉及其分叉处（图1A，B，见箭头所示）。</li>
	<li>分离左右两侧颈动脉分叉及其附着组织。将每一块分离的组织分别转移至含有冷PBS的3.5 cm培养皿中。</li>
	<li>寻找附着于颈动脉分叉处的颈上神经节（SCG）。在培养皿中进一步清理SCG，去除动脉及其他附着组织（图1E）。</li>
</ol>
3. 成年小鼠星状神经节（StG）的解剖
<ol>
	<li>为分离胃下神经节（StG），先在腹部做正中切口，随后切开膈肌和腹侧胸壁。</li>
	<li>移除心脏和肺以暴露背侧胸腔。在第一肋水平，于颈长肌（musculus colli longus, MCL）前外侧寻找左侧和右侧的胃下神经节（StG）（图1C，D，以虚线标示）。</li>
	<li>用镊子分离左侧和右侧的胃下神经节（StG），并分别转移至含有冷PBS的3.5 cm培养皿中（图1F）。 
	&#8203;</li>
</ol>
4. 小鼠神经节细胞的分离与冷冻保存
步骤4-6总结如下&#160;图2.
<ol>
	<li>用镊子小心地将所有单个的 SCG 和 StG 分别转移至不同的 1.5 mL 微量离心管中。 
	注意：请勿使用移液器吸头转移神经节，因为神经节容易黏附在塑料移液器吸头的管壁上。</li>
	<li>向每支微量离心管中加入 500 µL 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 溶液，并在 37 °C 摇水浴中孵育 40 分钟。 
	注意：此步骤旨在促进后续在胶原酶 II 型溶液中的消化和细胞释放。</li>
	<li>为每个样本准备一支含有 5 mL 神经节培养基的 15 mL 离心管。让神经节在微量离心管底部自然沉降。收集上清液（其中含有极少量神经节细胞），将上清液转移至已准备好的 15 mL 管中，并对每管进行标记。或者，为节省时间，可直接吸除胰蛋白酶-EDTA 上清液而不收集，因为其中几乎检测不到解离的细胞。 
	注意：可保留少量胰蛋白酶-EDTA 溶液（约 10–30 µL）在微量离心管中，以避免将神经节一并移除。此步骤应避免使用移液操作，因其可能损伤神经节，导致后续神经节细胞得率降低&#160;。</li>
	<li>向每支微量离心管中加入 500 µL 胶原酶 II 型溶液，并在 37 °C 摇水浴中孵育 35–40 分钟。在孵育 35 分钟后尝试重悬神经节；若神经节仍保持完整且未解离，可根据需要延长孵育时间或提高胶原酶 II 型溶液的浓度。 
	注意：孵育时间可能因神经节大小而异。</li>
	<li>通过上下吹打约 10 次或直至不再观察到组织团块，将神经节在胶原酶溶液中充分重悬。</li>
	<li>将细胞悬液转移至先前使用的 15 mL 离心管中，该管中已含有来自同一神经节的神经节培养基和胰蛋白酶-EDTA 悬液。使用水平转子离心机在室温下以 300 × g 离心 10 分钟，沉淀细胞。小心弃去上清液。 
	注意：由于神经节细胞来源于单个神经节，细胞沉淀可能非常微小，肉眼难以观察；可保留少量上清液于管中，以防意外弃除细胞沉淀。</li>
	<li>用 270 µL 胎牛血清（FBS，低内毒素）重悬神经节细胞，并将每份细胞-FBS 悬液转移至 1 mL 冻存管中。</li>
	<li>为进行细胞计数，取 5 µL 神经节细胞悬液与 5 µL 0.4% 台盼蓝染液混合，将混合液加入血细胞计数板，在显微镜下计数总细胞数和活细胞数。 
	注意：采用本解离方案，细胞活力（活细胞数/总细胞数 = 活力百分比）通常高于 90%。当神经节来源于 12 至 16 周龄小鼠时，单个神经节（SCG 或 StG）的活细胞数通常在 9,000–60,000 个之间。</li>
	<li>向每支冻存管中的细胞-FBS 悬液中加入 30 µL 二甲基亚砜（DMSO），充分混匀后将冻存管放入处于室温的细胞冻存盒中。将装有冻存管的冻存盒于 -80 °C 保存过夜，次日将冻存管转移至液氮中长期保存，以备后续测序使用。</li>
</ol>
5. 细胞核分离
注意：以下细胞核分离及测序制备操作以四只小鼠分离得到的左右颈上神经节（SCG）（共8个样本）为例。整个操作过程中所有步骤均需保持冰上操作。由于细胞核沉淀量少且不易观察，强烈推荐使用配备摆动吊桶转子的离心机，以便在整个操作过程中更方便地移除上清液。
<ol>
	<li>在15 mL离心管上放置滤网（30 µm），并在其上预先用1 mL神经节培养基冲洗滤网。</li>
	<li>从液氮中取出冻存管，立即在37 °C水浴中快速解冻。当冻存管中仅剩少量冰粒时，即将其从水浴中取出。</li>
	<li>轻轻手动振荡，同时向每支冻存管中滴加1 mL神经节培养基，以回收神经节细胞。可选：为评估细胞回收情况，可在回收后混匀细胞悬液，并取出5 µL用于活细胞计数，具体操作见步骤4.8。</li>
	<li>将每份神经节细胞悬液分别加载至已准备好的滤网（见步骤5.1）上，并用4–5 mL神经节培养基冲洗每个滤网。</li>
	<li>将滤过的细胞悬液在300 × g条件下离心5分钟，小心吸除上清液，并将细胞重悬于50 µL细胞洗涤缓冲液中。</li>
	<li>将细胞悬液转移至低吸附DNA/RNA 0.5 mL微量离心管中。</li>
	<li>在4 °C条件下，以500 × g离心细胞悬液5分钟。</li>
	<li>吸取并去除45 µL上清液，注意不要触碰管底，以免扰动细胞沉淀。</li>
	<li>向沉淀中加入45 µL预冷的裂解缓冲液，使用200 µL移液器枪头轻轻吹打混匀。</li>
	<li>将细胞置于冰上孵育8分钟。</li>
	<li>向每管中加入50 µL预冷的细胞核洗涤缓冲液。不要混匀。</li>
	<li>在4 °C条件下，以600 × g离心细胞核&#160;悬液5分钟。</li>
	<li>小心吸除95 µL上清液，避免破坏细胞核&#160;沉淀。</li>
	<li>向沉淀中加入45 µL预冷的细胞核&#160;洗涤缓冲液。可选：取5 µL细胞核&#160;悬液，与5 µL 0.4%台盼蓝混合后进行计数，并使用血细胞计数板在显微镜下检查细胞核的质量。</li>
	<li>在4 °C条件下，以600 × g离心细胞核&#160;悬液5分钟。</li>
	<li>小心吸除上清液，避免触碰管底，以防扰动细胞核&#160;沉淀。</li>
</ol>
6. 使用标签寡核苷酸（HTO）对细胞核进行条形码标记及多重检测
注意：HTO 染色步骤经过修改和优化，用于根据 Gaublomme 等人先前在皮质组织中的应用15，对标记极少量（神经节）细胞核进行核标记。
<ol>
	<li>向细胞核沉淀中加入 50 µL ST-SB 缓冲液，轻轻吹打 8–10 次，直至细胞核完全重悬。</li>
	<li>每 50 µL ST-SB/细胞核混合液中加入 5 µL Fc 封闭试剂，冰上孵育 10 分钟。</li>
	<li>每管 ST-SB/细胞核混合液中加入 1 µL（0.5 µg）单细胞核标签抗体，冰上孵育 30 分钟。 
	注意：孵育时间较短会导致标签标记效率降低，代表性结果中已对此进行展示。</li>
	<li>向每管中加入 100 µL ST-SB。不要混匀。</li>
	<li>将细胞核悬液在 4 °C 下以 600 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>小心移除 145 µL 上清液，避免扰动细胞核沉淀。</li>
	<li>重复步骤 6.4 和 6.5。尽可能去除上清液，但不要接触管底，以免使细胞核沉淀脱落。</li>
	<li>用 50 µL ST-SB 重悬细胞核沉淀，并轻轻混匀细胞核。</li>
	<li>取 5 µL 细胞核&#160;悬液与 5 µL 0.4% 台盼蓝混合，在显微镜下计数细胞核。代表性图像参见 图 3A，图中显示与台盼蓝混合后加载至血细胞计数板的细胞核。</li>
	<li>将细胞核&#160;悬液在 4 °C 下以 600 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>根据相应的细胞核计数结果，用 ST-SB 重悬细胞核，使每个样本的细胞核浓度达到目标值 1,000–3,000 个细胞核/µL。</li>
	<li>混合样本以获得所需数量的细胞。 
	注意：例如，在本实验中，将 8 个样本等量混合，共获得 25,000 个细胞核，随后立即进行 10x Genomics Chromium 及单细胞核 RNA 测序（snRNA-seq）。当从 12 至 16 周龄小鼠中分离神经节时，细胞核数量通常在 6,000–40,000 个之间。基于液滴的 snRNA-seq 通常仅能捕获约一半加载的细胞核。例如，制备 25,000 个细胞核的混合液，以确保捕获 10,000 个细胞核，满足后续文库构建和测序的需求。</li>
</ol>

<ol><li>McCorry, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology+of+the+autonomic+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pharmaceutical+Education%22%5BJournal%5D)">Physiology of the autonomic nervous system.</a> American Journal of Pharmaceutical Education. 71 (4), 78(2007).</li>
<li>Li, C. -Y., Li, Y. -G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+sympathetic+nerve+sprouting+and+susceptibility+to+ventricular+arrhythmias+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiology+Research+and+Practice%22%5BJournal%5D)">Cardiac sympathetic nerve sprouting and susceptibility to ventricular arrhythmias after myocardial infarction.</a> Cardiology Research and Practice. 2015, 698368(2015).</li>
<li>Ajijola, O. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracardiac+neural+remodeling+in+humans+with+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%3A+Arrhythmia+and+Electrophysiology%22%5BJournal%5D)">Extracardiac neural remodeling in humans with cardiomyopathy.</a> Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 5 (5), 1010(2012).</li>
<li>Nguyen, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+myocardial+infarction+induces+bilateral+stellate+ganglia+neural+remodeling+in+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Pathology%22%5BJournal%5D)">Acute myocardial infarction induces bilateral stellate ganglia neural remodeling in rabbits.</a> Cardiovascular Pathology. 21 (3), 143-148 (2012).</li>
<li>Ajijola, O. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remodeling+of+stellate+ganglion+neurons+after+spatially+targeted+myocardial+infarction%3A+Neuropeptide+and+morphologic+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Rhythm%22%5BJournal%5D)">Remodeling of stellate ganglion neurons after spatially targeted myocardial infarction: Neuropeptide and morphologic changes.</a> Heart Rhythm. 12 (5), 1027-1035 (2015).</li>
<li>Han, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroanatomic+remodeling+of+the+left+stellate+ganglion+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Journals+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Electroanatomic remodeling of the left stellate ganglion after myocardial infarction.</a> Journals of the American College of Cardiology. 59 (10), 954-961 (2012).</li>
<li>Zeisel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+architecture+of+the+mouse+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular architecture of the mouse nervous system.</a> Cell. 174 (4), 999-1014 (2018).</li>
<li>Svensson, V., Vento-Tormo, R., Teichmann, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exponential+scaling+of+single-cell+RNA-seq+in+the+past+decade%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Exponential scaling of single-cell RNA-seq in the past decade.</a> Nature Protocols. 13 (4), 599-604 (2018).</li>
<li>Li, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatosensory+neuron+types+identified+by+high-coverage+single-cell+RNA-sequencing+and+functional+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Somatosensory neuron types identified by high-coverage single-cell RNA-sequencing and functional heterogeneity.</a> Cell Research. 26 (8), 967(2016).</li>
<li>Kokubun, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+TRPV1+and+TRPV2+in+the+human+stellate+ganglion+and+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Distribution of TRPV1 and TRPV2 in the human stellate ganglion and spinal cord.</a> Neuroscience Letters. 590, 6-11 (2015).</li>
<li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-nucleus+RNA-sequencing+pipeline+to+decipher+the+molecular+anatomy+and+pathophysiology+of+human+kidneys%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">A single-nucleus RNA-sequencing pipeline to decipher the molecular anatomy and pathophysiology of human kidneys.</a> Nature Communication. 10 (1), 2832(2019).</li>
<li>Petrany, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleus+RNA-seq+identifies+transcriptional+heterogeneity+in+multinucleated+skeletal+myofibers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Single-nucleus RNA-seq identifies transcriptional heterogeneity in multinucleated skeletal myofibers.</a> Nature Communication. 11 (1), 6374(2020).</li>
<li>Wu, H., Kirita, Y., Donnelly, E. L., Humphreys, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+of+single-nucleus+over+single-cell+RNA+sequencing+of+adult+kidney%3A+rare+cell+types+and+novel+cell+states+revealed+in+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Advantages of single-nucleus over single-cell RNA sequencing of adult kidney: rare cell types and novel cell states revealed in fibrosis.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 30 (1), 23-32 (2019).</li>
<li>Bakken, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleus+and+single-cell+transcriptomes+compared+in+matched+cortical+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types.</a> PLoS One. 13 (12), 0209648(2018).</li>
<li>Gaublomme, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclei+multiplexing+with+barcoded+antibodies+for+single-nucleus+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Nuclei multiplexing with barcoded antibodies for single-nucleus genomics.</a> Nature Communications. 10 (1), 2907(2019).</li>
<li>Zandstra, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetry+and+heterogeneity%3A+part+and+parcel+in+cardiac+autonomic+innervation+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Asymmetry and heterogeneity: part and parcel in cardiac autonomic innervation and function.</a> Frontiers in Physiology. 12, 665298(2021).</li>
<li>Lewis, A. E., Vasudevan, H. N., O'Neill, A. K., Soriano, P., Bush, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+widely+used+Wnt1-Cre+transgene+causes+developmental+phenotypes+by+ectopic+activation+of+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The widely used Wnt1-Cre transgene causes developmental phenotypes by ectopic activation of Wnt signaling.</a> Developmental Biology. 379 (2), 229-234 (2013).</li>
<li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).</li>
<li>Stuart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+integration+of+single+cell+data%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Comprehensive integration of single cell data.</a> bioRxiv. , (2018).</li>
<li>Avraham, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+glial+cells+promote+regenerative+growth+in+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Satellite glial cells promote regenerative growth in sensory neurons.</a> Nature Communications. 11 (1), 4891(2020).</li>
<li>Stoeckius, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Hashing+with+barcoded+antibodies+enables+multiplexing+and+doublet+detection+for+single+cell+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell Hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics.</a> Genome Biology. 19 (1), 224(2018).</li>
<li>Lacar, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+RNA-seq+of+single+neurons+reveals+molecular+signatures+of+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Nuclear RNA-seq of single neurons reveals molecular signatures of activation.</a> Nature Communications. 7 (1), 11022(2016).</li>
<li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+strategy+for+single-nucleus+and+single-cell+transcriptomes+confirms+accuracy+in+predicted+cell-type+expression+from+nuclear+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A comparative strategy for single-nucleus and single-cell transcriptomes confirms accuracy in predicted cell-type expression from nuclear RNA.</a> Scientific Reports. 7 (1), 6031(2017).</li>
<li>Grindberg, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-sequencing+from+single+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">RNA-sequencing from single nuclei.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (49), 19802-19807 (2013).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

本文详细描述了一种实验方案，重点包括：i）成年小鼠颈上神经节和星状神经节的分离，ii）神经节细胞的分离与冷冻保存，iii）细胞核的提取，以及 iv）利用HTO标记对细胞核进行条形码标记，以实现多重检测和单核RNA测序（snRNA-seq）。
通过本方案，可利用常用的胰蛋白酶和胶原酶消化单个神经节，从而轻松获得交感神经节细胞。通过在添加10% DMSO的胎牛血清（FBS）中冷冻保存分离的节细胞，也可实现细胞的长期保存，并在解冻后表现出较高的复苏质量。此外，与传统的单细胞RNA测序相比，采用基于液滴的单细胞核RNA测序（snRNA-seq）结合HTO染色介导的细胞核条形码技术对单个小鼠交感神经节进行分析具有以下优势：i）样本可在所有样本收集完毕前长期保存，直至进行后续细胞核分离；ii）来自多个小型神经节的高质量细胞核可合并进行测序，避免因分批制备样本而引入批次效应；iii）利用细胞核条形码可在测序后追溯各个神经节的明确来源；iv）具有成本效益，仅需进行一次文库构建。重要的是，所述的分离与细胞培养方案为小鼠颈上神经节和星状神经节提供了一种统一的标准化方法，且该方法可能适用于其他神经节（如...

自主神经系统（ANS）是周围神经系统的关键组成部分，负责维持机体的内环境稳态，包括对环境变化和病理状态的适应1。它参与调控全身多个器官系统，如心血管系统、呼吸系统、消化系统和内分泌系统。自主神经系统分为交感神经和副交感神经两个分支。交感神经系统的脊髓分支在位于椎旁双侧的交感干神经节内形成突触。双侧的颈段和胸段神经节，尤其是星状神经节（StG），是心脏交感神经支配的重要组成部分。在疾病状态下，例如心肌缺血时，可发生神经重塑，导致交感神经过度激活2。这种神经重塑已在人类以及多种其他动物物种的多项组织学研究中得到证实3,4,5,6。目前尚缺乏对心肌缺血诱导的心脏交感神经节内神经重塑的详细生物学特征描述，且在健康与疾病状态下，心脏交感神经系统（SNS）内特化神经元细胞类型或亚型的基本生物学特性也尚未完全明确7。
新型技术（如单细胞RNA测序，scRNA-seq）为在单细胞水平上对微小组织进行遗传学表征开辟了途径8,9。然而，由于神经元的体积相对较大，可能会影响这些单细胞技术在人类样本中的优化应用10。此外，单细胞测序需要高通量的细胞以获得足够数量的细胞，因为在测序过程中存在较高的细胞损失率。当研究难以在一次取样中获取足够组织的小型组织时，可能需要多次取样才能获得足够的单细胞用于测序，这带来了挑战。近年来发展的基于微滴的单细胞核RNA测序技术（snRNA-seq）（即10x Chromium平台）使得能够在单核水平上研究生物学差异11,12。对于体积较大的细胞（&#62;30 µm），snRNA-seq相较于scRNA-seq具有优势，因为这些大细胞可能无法被包裹在乳液中的凝胶珠（GEMs）内；同时，snRNA-seq在组织解离程度较高和/或长期保存的样本中也表现出更好的兼容性13,14,15。
心脏交感神经系统（SNS）中神经元细胞及其他细胞的异质性、细胞数量等特征，对于阐明自主神经系统（ANS）在健康与疾病状态下的特性具有重要意义。此外，每个交感神经节对特定器官或区域的特异性支配进一步增加了SNS的复杂性。研究表明，交感神经链中的颈神经节、星状神经节和胸神经节分别支配心脏的不同区域16。因此，有必要对来自各个独立神经节的节内细胞进行单细胞核分析，以研究其生物学结构。
基于液滴的单核RNA测序（snRNA-seq）能够以低于基于孔板测序平台的成本，同时对来自多个样本的数千个细胞群体进行全转录组表达谱分析。该方法使得基于液滴的snRNA-seq更适用于SCG和StG内细胞的表型分类及新亚群的鉴定。值得注意的是，本实验方案提供了一种简明的分步操作流程，用于交感性心脏外源性神经节的鉴定、分离及单核RNA测序，该方法在健康与疾病状态下其他相关器官和组织神经节特征研究中具有广泛的应用潜力。

<table><tbody><tr><td>&lt;强&gt;化学品与试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.25% 胰蛋白酶-EDTA</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>0.4% 台盼蓝染料</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>1450021</td><td></td></tr><tr><td>抗生素-抗真菌剂</td><td>Gibco</td><td>15240096</td><td></td></tr><tr><td>B-27</td><td>Gibco</td><td>A3582801</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶 II 型</td><td>沃辛顿</td><td>LS004176</td><td>使用 1,400 U/mL</td></tr><tr><td>二甲基亚砜</td><td>Sigma Aldrich</td><td>67685</td><td></td></tr><tr><td>乙醇，绝对 &amp;ge;99.5%</td><td>VWR</td><td>VWRC83813.360</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（低内毒素）</td><td>Biowest</td><td>S1810-500</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>25030024</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal 培养基</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>10% 牛血清白蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1595-50ML</td><td>细胞洗涤缓冲液</td></tr><tr><td>DPBS（Ca）&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;，Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;无（游离）</td><td>Gibco</td><td>14190-169</td><td>细胞洗涤缓冲液</td></tr><tr><td>1 M 氯化镁溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1028</td><td>细胞核裂解缓冲液</td></tr><tr><td>Nonidet P40 替代品（非离子去垢剂）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>74385</td><td>细胞核裂解缓冲液</td></tr><tr><td>无核酸酶水（非DEPC处理）</td><td>Invitrogen</td><td>AM9937</td><td>细胞核裂解缓冲液</td></tr><tr><td>Protector RNase 抑制剂，40 U/μL&amp;micro;L</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3335399001</td><td>细胞核裂解缓冲液</td></tr><tr><td>5 M 氯化钠溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59222C</td><td>细胞核裂解缓冲液</td></tr><tr><td>Trizma 盐酸盐溶液，1 M，pH 7.4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2194</td><td>细胞核裂解缓冲液</td></tr><tr><td>10% 牛血清白蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1595-50ML</td><td>细胞核洗涤</td></tr><tr><td>DPBS（Ca）&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;，Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;无（游离）</td><td>Gibco</td><td>14190-169</td><td>细胞核洗涤</td></tr><tr><td>Protector RNase 抑制剂，40 U/μL&amp;micro;L</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3335399001</td><td>细胞核洗涤</td></tr><tr><td>10% 牛血清白蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1595-50ML</td><td>ST染色缓冲液（ST-SB）</td></tr><tr><td>1 M 氯化钙溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21115-100ML</td><td>ST染色缓冲液（ST-SB）</td></tr><tr><td>1 M 氯化镁溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1028</td><td>ST染色缓冲液（ST-SB）</td></tr><tr><td>无核酸酶水（非DEPC处理）</td><td>Invitrogen</td><td>AM9937</td><td>ST染色缓冲液（ST-SB）</td></tr><tr><td>5M 氯化钠溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59222C</td><td>ST染色缓冲液（ST-SB）</td></tr><tr><td>Trizma 盐酸盐溶液，1 M，pH 7.4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2194</td><td>ST染色缓冲液（ST-SB）</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>默克密理博</td><td>822184</td><td>ST染色缓冲液（ST-SB）</td></tr><tr><td>TotalSeq-A0451 抗核孔复合体蛋白条形码1抗体</td><td>Biolegend</td><td>682205</td><td>#抗体</td></tr><tr><td>TotalSeq-A0452 抗核孔复合体蛋白标签2抗体</td><td>Biolegend</td><td>682207</td><td>抗体</td></tr><tr><td>TotalSeq-A0453 抗核孔复合体蛋白Hashtag 3抗体</td><td>Biolegend</td><td>682209</td><td>抗体标记</td></tr><tr><td>TotalSeq-A0461 抗核孔复合体蛋白条形码11抗体</td><td>Biolegend</td><td>682225</td><td>#抗体</td></tr><tr><td>TotalSeq-A0462 抗核孔复合体蛋白标签12抗体</td><td>Biolegend</td><td>682227</td><td>抗体标记</td></tr><tr><td>TotalSeq-A0463 抗核孔复合体蛋白条形码13抗体</td><td>Biolegend</td><td>682229</td><td>抗体标记</td></tr><tr><td>TotalSeq-A0464 抗核孔复合体蛋白条形码14抗体</td><td>Biolegend</td><td>682231</td><td>抗体标记</td></tr><tr><td>TotalSeq-A0465 抗核孔复合体蛋白条形码15抗体</td><td>Biolegend</td><td>682233</td><td>#抗体</td></tr><tr><td>TruStain FcX（人源）</td><td>Biolegend</td><td>422302</td><td>Fc受体封闭液</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;仪器与耗材&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>亮线&amp;nbsp;血细胞计数板</td><td>默克</td><td>Z359629-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5702/R A-4-38</td><td>Eppendorf</td><td>&amp;nbsp;EP022629905</td><td></td></tr><tr><td>CoolCell LX 细胞冻存容器</td><td>康宁</td><td>CLS432003-1EA</td><td></td></tr><tr><td>冻存管</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>479-6840</td><td></td></tr><tr><td>DNA LoBind 0.5 mL Eppendorf管</td><td>Eppendorf</td><td>EP0030108035-250EA</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock 离心管 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30121872</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 35 mm 未经TC处理的培养皿</td><td>康宁</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 15 mL 圆锥形离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td>10773501</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 镊子</td><td>精细科学工具</td><td>11252-40</td><td></td></tr><tr><td>硬化精细剪刀</td><td>精细科学工具</td><td>14091-09</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;冰盘，矩形，4 L，橙色</td><td>康宁</td><td>CLS432106-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Leica MS5</td><td>Leica</td><td></td><td>显微镜</td></tr><tr><td>Moria MC50 剪刀</td><td>精细科学工具</td><td>15370-50</td><td></td></tr><tr><td>诺伊斯弹簧剪</td><td>精细科学工具</td><td>15012-12</td><td></td></tr><tr><td>奥林巴斯 CK2 ULWCD</td><td>Olympus</td><td></td><td>显微镜</td></tr><tr><td>P10</td><td>Gilson</td><td>F144802</td><td></td></tr><tr><td>P1000</td><td>Gilson</td><td>F123602</td><td></td></tr><tr><td>P200</td><td>Gilson</td><td>F123601</td><td></td></tr><tr><td>预分离滤器（30 &amp;micro;m)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Miltenyi Biotec 130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>摇床水浴箱</td><td>GFL</td><td>1083</td><td></td></tr><tr><td>硅片</td><td>橡胶BV</td><td>3530</td><td>解剖板</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;软件和程序包&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>细胞游走器</td><td>V4.0.0</td><td></td><td></td></tr><tr><td>R 编程</td><td>V4.1.1</td><td></td><td></td></tr><tr><td>R Studio</td><td>V1.3.1073</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seurat</td><td>V4.0</td><td></td><td></td></tr><tr><td>tydiverse</td><td>V1.3.1</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;动物&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B6.Cg-Tg(Wnt1-cre)2Sor/J 小鼠</td><td>杰克逊实验室</td><td>JAX 货号 #022501</td><td></td></tr><tr><td>B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J 小鼠</td><td>杰克逊实验室</td><td>JAX 货号 #007576</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J 小鼠</td><td>查尔斯河实验室</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;数据分析代码&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>https://github.com/rubenmethorst/Single-cell-SCG_JoVE</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

低输入量细胞核分离及条形码抗体多重检测小鼠交感神经节用于单细胞核rna测序

Low-input Nucleus Isolation and Multiplexing with Barcoded Antibodies of Mouse Sympathetic Ganglia for Single-nucleus RNA Sequencing

心脏自主神经系统在调控心脏功能（如心率和心肌收缩力）方面起着关键作用，可分为交感神经和副交感神经两个分支。正常情况下，这两个分支之间保持平衡，以维持内环境稳定。然而，心肌梗死、心力衰竭和高血压等心脏疾病状态可诱导参与心脏神经支配的细胞发生重构，这种重构与不良的临床预后相关。
尽管关于心脏自主神经系统的组织学结构和功能已有大量数据，但其在健康和疾病状态下的分子生物学结构在许多方面仍不明确。单细胞RNA测序（scRNA-seq）等新技术有望实现对组织在单细胞分辨率水平上的遗传学表征。然而，神经元相对较大的体积可能阻碍这些技术的标准化应用。本文介绍了一种基于液滴的单细胞核RNA测序（snRNA-seq）方法，用于解析健康和疾病状态下心脏交感神经元的生物学结构。本方案逐步展示了如何对成年小鼠双侧颈上神经节（SCG）和星状神经节（StG）进行分离，并开展snRNA-seq分析。
该方法可实现样本的长期保存，在无法于短时间内一次性收集多个个体/实验的样本时，仍能维持足够的RNA质量。使用标签寡核苷酸（HTOs）对细胞核进行条形码标记，可在测序后实现多重样本的解离与各个神经节样本的溯源。后续分析表明，已成功捕获交感神经节中的神经元、卫星胶质细胞和内皮细胞的细胞核，并通过单核RNA测序（snRNA-seq）加以验证。总之，本方案提供了针对心脏外源性交感神经节进行单核RNA测序（snRNA-seq）的分步操作流程，该方法有望广泛应用于其他器官和组织神经支配研究中。

单核cDNA文库构建与单核RNA测序的质量控制分析 
代表性结果描述了单个混合样本中10,000个捕获细胞核的测序数据，其中基因表达文库深度为25,000 reads/细胞核，标签序列文库深度为5,000 reads/细胞核。 图3B 展示了1的质控结果st 链cDNA、基因表达（GEX）文库和HTO文库，并使用Bioanalyzer进行检测。HTO来源的cDNA预期小于180 bp，而mRNA来源的cDNA则大于300 bp。高质量的GEX文库在300至1,000 bp范围内呈现一个宽峰，HTO文库则在194 bp处显示一个特异性峰。默认使用Cell Ranger进行样本去混样、fastq文件生成及序列比对。Seurat R软件包19 随后用于质量控制和下游分析。
使用 Seurat 内置的去多重化策略通过识别 HTO 来对 snRNA-seq 数据进行去多重化。首先通过 HTO 表达文件可视化每种 HTO 的去...

本方案详细描述了单细胞核测序的低起始量样本制备流程，包括小鼠颈上神经节和星状神经节的解剖、细胞解离、冷冻保存、细胞核分离以及标签条形码标记。

低输入量细胞核分离及条形码抗体多重检测小鼠交感神经节用于单细胞核RNA测序

心脏自主神经系统在调控心脏功能（如心率和心肌收缩力）方面起着关键作用，可分为……

在本 JoVE 实验方案中，我们采用基于液滴的单细胞核 RNA 测序技术，以解析心脏交感神经元在健康与疾病状态下的生物学结构。该方法能够在一段时间内对大量神经元样本进行测序。通过使用带有标签寡核苷酸（hashtag oligos）标记的细胞核，该技术实现了样本的多重检测。该方法有望拓展应用于人类神经节神经元的测序，此前这一研究因细胞体积较大以及难以同时采集样本而面临挑战。本实验操作将由本实验室的研究技术员 Conny van Munsteren 和博士生 Lieke van Roon 演示。首先准备好解剖所需的所有材料，然后将小鼠固定在解剖板上。用70%乙醇润湿小鼠，以减少毛发的散落。使用剪刀沿中线切开颈部皮肤。在体视显微镜下，移开下颌下腺并去除胸锁乳突肌，以暴露颈总动脉及其分叉，以及颈上神经节，并清除附着于其上的组织。分离左右两侧颈总动脉分叉及其附着的组织。将每一块分离的组织转移至分别盛有冷PBS的3.5厘米培养皿中。找到附着于颈动脉分叉处的颈上神经节。通过去除动脉及附着组织，清洁颈上神经节。解剖星状神经节时，先在腹部正中线做一切口，随后打开膈肌和腹侧胸壁。先移除肺脏，再取出心脏，以暴露胸腔背侧。在第一肋骨水平，于颈长肌前外侧定位左侧和右侧星状神经节。用镊子剥离周围组织，解剖双侧星状神经节。将其转移至含有冷PBS的3.5厘米培养皿中。用镊子将上颈神经节和星状神经节分别转移至1.5毫升微量离心管中，然后每管加入500微升0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液，并在摇动水浴中孵育。让神经节沉降至微量离心管底部。将上清液转移至含有5毫升神经节培养基的15毫升离心管中。向微量离心管中加入500微升II型胶原酶溶液，并置于摇动水浴中孵育。孵育后，用移液器将神经节重悬于胶原酶溶液中，直至检测不到组织团块。将细胞悬液转移至先前使用的含有神经节培养基和胰蛋白酶-EDTA悬液的15毫升离心管中。离心细胞悬液并弃去上清液。将沉淀重悬于270微升胎牛血清中，并转移至1毫升冻存管。为进行细胞计数，取5微升神经节细胞悬液与5微升0.4%台盼蓝染液混合。将混合液加入血细胞计数板，于显微镜下计数总细胞数和活细胞数。接下来，向每个冻存管中加入 30 µL 二甲基亚砜，并充分混匀。将冻存管放入细胞冻存盒中，并于 -80 °C 过夜。在 15 mL 离心管上放置孔径 30 µm 的细胞筛，预先准备好。用1毫升神经节培养基预冲洗滤网。从液氮中取出冻存管，立即在37摄氏度水浴中解冻，直至冻存管中仅剩少量冰粒。向每支冻存管中加入1毫升神经节培养基，同时轻轻振荡冻存管以回收神经节细胞。将神经节细胞悬液加入过滤器中，并用4至5毫升神经节培养基冲洗。离心过滤后的细胞悬液。弃去上清液，将细胞重悬于50微升细胞洗涤缓冲液中。将细胞悬液转移至0.5毫升低吸附微量离心管中。离心细胞悬液。此后必须使用配备摆动桶转子的离心机。离心后，移除上清液45微升，注意不要扰动细胞沉淀。加入45微升预冷的裂解缓冲液，轻轻吹打混匀，将细胞置于冰上孵育8分钟，然后向每管中加入50微升冷的细胞核洗涤缓冲液。离心细胞核悬液，并移除95微升上清液，注意不要破坏细胞核沉淀。向沉淀中加入45微升预冷的细胞核洗涤缓冲液，重复离心，并移除上清液。向细胞核沉淀中加入50微升ST-SB，轻轻吹打至细胞核完全重悬，然后加入5微升FC封闭试剂，冰上孵育10分钟。接着，加入1微升单细胞核标签抗体，冰上孵育30分钟。孵育后，向每根试管中加入 100 微升 ST-SB。离心悬浮液，并在不扰动细胞核沉淀的前提下，移除 145 微升上清液。重复离心操作，并移除上清液。将细胞核沉淀重悬于50微升ST-SB中，轻轻混匀。取5微升细胞核悬液，与5微升0.4%台盼蓝混合，用于在显微镜下计数细胞核。再次离心细胞核悬液，并将细胞核沉淀重悬于ST-SB中，调整细胞核浓度至每微升1,000至3,000个。吸取样本以获得所需数量的细胞。文库构建的质量控制分析显示，标签寡核苷酸衍生的cDNA小于180个碱基对。在300至1,000个碱基对范围内出现的宽峰代表高质量的基因表达文库，而194个碱基对处的特异性峰则显示标签寡核苷酸文库。单细胞核RNA测序分析揭示了12个簇，通过UMAP可视化，哈希标签抗体分布于所有簇中。通过Xist的表达确认了哈希标签寡核苷酸的特异性标记：哈希标签1至4标记女性样本，而5至8标记男性样本。通过关键转录本验证了测序数据的质量和分辨率，例如在第5和第7簇中用于交感神经元的TH、DBH和SNAP25，在第0至第3簇中用于卫星胶质细胞的S100B，在第4簇中用于内皮细胞的PECAM1，以及在第8簇中用于基质细胞的ACTA2。在尝试该方法时，需注意正确的样品制备以及配备充足的设备，例如精细解剖剪、锋利镊子，以及配有摆动桶转子的离心机，这些均至关重要。这种针对交感性心脏外源性神经节的单细胞核RNA测序逐步操作方法，有望广泛应用于健康与疾病状态下其他相关器官和组织的神经节特征分析。

low-input-nucleus-isolation-multiplexing-with-barcoded-antibodies

Research

科研

JoVE Journal

Medicine

医学

低输入细胞核分离和多路复用小鼠交感神经节条形码抗体进行单核RNA测序

本文介绍一种从新鲜或冷冻组织中快速分离高质量细胞核的方案，适用于后续的大规模平行RNA测序。方案中包括去污剂-机械法和低渗-机械法两种组织破碎与细胞裂解方法，均可用于细胞核的分离。...

用于大规模并行单核RNA测序的成年脊髓核的分离

本文介绍了一种从成熟脂肪细胞中分离细胞核、通过荧光激活分选进行纯化以及在单细胞水平上进行转录组学分析的实验方案。...

用于单细胞基因组学应用的脂肪组织细胞核分离

单个细胞核的分离依赖于细胞膜的解离和基于去垢剂的透化处理，这些步骤需要优化，且容易引入技术性假象。我们展示了一种无需去垢剂和酶的快速分离完整细胞核的方案，可直接从完整组织中获取适用于单细胞核RNA测序（snRNA-Seq）或ATAC-seq的细胞核。...

使用去污剂和酶解-free方法从完整组织中分离细胞核

肿瘤内异质性是包括胶质瘤在内的各种肿瘤的固有特征。我们开发了一种简单高效的实验方案，通过结合使用多种缓冲液和梯度离心方法，从新鲜冷冻的胶质瘤组织中分离单个细胞核，用于单细胞核RNA测序和ATAC测序研究。...

从新鲜冷冻脑肿瘤组织中分离细胞核用于单核RNA测序和ATAC测序

本文介绍一种从冻存小鼠肾脏中分离高质量细胞核的实验方案，该方法可提高肾髓质细胞类型的代表性，并避免酶解组织解离导致的基因表达异常。...

从成年小鼠肾脏中分离细胞核用于单细胞核RNA测序

本文介绍一种从速冻保存的存档肝组织中分离细胞核的方案，用于单细胞核RNA测序（RNA-seq）、ATAC-seq以及联合多组学分析（RNA-seq和ATAC-seq）。...

从速冻肝组织中分离细胞核用于单细胞多组学分析

本文介绍了一种细胞核制备的实验方案。在将心脏组织经显微解剖和酶解离为单个细胞后，祖细胞被冷冻保存，随后分离出纯度高且具有活性的细胞，用于单核RNA测序以及基于高通量测序的单核转座酶可及性染色质分析。...

从小鼠心脏前体细胞中分离细胞核用于单细胞分辨率下的表观基因组和基因表达谱分析

本研究介绍了一种简单、快速且部分自动化的方案，用于从冷冻的哺乳动物组织中分离高质量的细胞核，以用于后续的单细胞核RNA测序。...

一种简单、快速且部分自动化的从冷冻哺乳动物组织中分离单核用于单核测序的方案

由于人体组织获取受限，肌间脂肪组织（IMAT）的生物学特性在很大程度上尚未被探索。本文介绍了一种从冷冻的人类IMAT样本中分离细胞核并构建文库的详细方案，用于单细胞核RNA测序，以鉴定这一独特脂肪储存库的细胞组成。...

从人间质脂肪组织中分离细胞核及后续单细胞核RNA测序

本文描述了一种部分颈动脉结扎手术，该手术可在小鼠颈总动脉中引起血流紊乱，并在两周内导致动脉粥样硬化形成，四周围内出现斑块内新生血管。我们还介绍了一种从颈动脉内膜分离RNA的新方法，可获得高纯度的内皮细胞RNA。...

小鼠颈动脉部分结扎诱导血流紊乱性动脉粥样硬化模型及颈动脉内皮细胞RNA简易提取方法

了解低输入单核RNA测序方法，用于小鼠心脏交感神经元的细胞核分离与条形码标记。该技术可实现样本多路复用，为神经科学研究提供高效可靠的实验方案。

低输入量细胞核分离及条形码抗体多重检测小鼠交感神经节用于单细胞核RNA测序

探索更多视频