低输入细胞核分离和多路复用小鼠交感神经节条形码抗体进行单核RNA测序

在这个JoVE协议中，我们使用基于液滴的单核RNA测序来表征心脏交感神经元在健康和疾病中的生物学结构。这种方法可以在一段时间内对大量神经元样本进行测序。通过拉取带有标签寡核苷酸条形码的细胞核，该方法允许样品的多路复用。

这种方法有可能扩展到人类神经节的测序神经元，由于其大细胞大小和难以同时收集样本，这一直具有挑战性。来自我们实验室的研究人员Conny van Munsteren和我们实验室的博士生Lieke van Roon将展示该程序，首先收集解剖所需的所有材料，然后将鼠标固定在解剖板上。用70%乙醇润湿小鼠以尽量减少毛皮的分散。

用剪刀做中线切割，打开颈部区域的皮肤。在体视显微镜下，将下颌下腺移开并切除胸骨乳突肌，以暴露颈总动脉及其分叉，以及颈上神经节并去除附着在其上的组织。解剖左右颈动脉分叉及其附着的组织。

将每个解剖的组织转移到含有冷PBS的单独的3.5厘米培养皿中。定位附着在颈动脉分叉上的上颈神经节。通过切除动脉和附着的组织来清洁上颈神经节。

要解剖星状神经节，请在腹部进行中线切口，然后打开横膈膜和腹侧胸壁。切除肺部，然后切除心脏，以暴露胸背。在第一肋骨的水平，定位左和右星状神经节前外侧到肌肉结肠长。

通过去除周围组织，用镊子解剖两个星状神经节。将它们转移到含有冷PBS的3.5厘米培养皿中。使用镊子，将上颈神经节和星状神经节转移到分离的1.5毫升微量离心管中，然后在每个管中加入500微升0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液，并在振荡水浴中孵育。

让神经节沉降在微量离心管的底部。将上清液转移到含有5毫升神经节培养基的15毫升管中。在微量离心管中，加入500微升胶原酶2型溶液，并在振荡水浴中孵育。

孵育后，通过移液将神经节重悬于胶原酶溶液中，直到不再检测到组织团块。将细胞悬浮液转移到先前使用的含有胰蛋白酶-EDTA悬浮液的神经节培养基的15毫升管中。离心细胞悬浮液并丢弃细胞上清液。

将沉淀重悬于270微升胎牛血清中，并将其转移到1毫升的冷冻室中。为了计数细胞，将5微升的神经节细胞悬浮液与5微升的0.4%台盼蓝染料混合。将混合物装入血细胞计数器，并在显微镜下计数总细胞数和活细胞数。

接下来，向每个冷冻管中加入30微升二甲基亚砜并充分混合。将冷冻管转移到细胞冷冻容器中，并将其置于零下80摄氏度过夜。准备15毫升管，顶部装有30微米过滤器。

用1毫升神经节培养基预冲洗过滤器。从液氮中取出冷冻管，并立即在37摄氏度的水浴中解冻，直到冷冻管中留下一小块冰。将1毫升神经节培养基加入每个冷冻管中，同时小心摇晃小瓶以恢复神经节细胞。

将神经节细胞悬浮液加载到过滤器上，并用4至5毫升神经节培养基冲洗。离心过滤细胞悬浮液。除去上清液并将细胞重悬于50微升细胞洗涤缓冲液中。

将细胞悬浮液转移到0.5毫升低结合微量离心管中。离心细胞悬浮液。从现在开始，带有摆动桶转子的离心机至关重要。

离心后，除去45微升上清液而不移位细胞沉淀。加入45微升冷却的裂解缓冲液，移液轻轻混合，将细胞在冰上孵育8分钟，然后向每管中加入50微升冷核洗涤缓冲液。离心细胞核悬浮液并除去95微升上清液而不破坏细胞核沉淀。

向沉淀中加入45微升冷却的核洗涤缓冲液，重复离心，并除去上清液。向细胞核沉淀中，加入50微升ST-SB并轻轻移液直至细胞核完全重悬，然后加入5微升FC封闭试剂并在冰上孵育10分钟。接下来，加入1微升单核标签抗体，并在冰上孵育30分钟。

孵育后，向每个试管中加入100微升ST-SB。离心悬浮液并除去145微升上清液而不破坏细胞核沉淀。重复离心并除去上清液。

将细胞核沉淀重悬于50微升ST-SB中并轻轻混合。取5微升的细胞核悬浮液，并与5微升0.4%台盼蓝混合，在显微镜下计数细胞核。再次，离心细胞核悬浮液并将细胞核沉淀重悬于ST-SB中，以达到每微升1，000至3，000个细胞核的目标细胞核浓度。

拉取样品以达到所需的细胞数。文库制备的质量控制分析显示，标签寡核苷酸衍生的cDNA小于180个碱基对。从300到1， 000个碱基对的广泛峰代表了高质量的基因表达库，而194个碱基对的特定峰显示了标签寡核苷酸库。

单核RNA测序分析显示，通过UMAP可视化的12个簇，并且标签抗体分布在所有簇中。标签寡核苷酸的特定标签由Xist的表达证实。标签1至4标记为女性，而5至8标签男性样本。

测序数据的质量和分辨率通过关键转录本进行验证，例如交感神经元5和7簇中的TH，DBH和SNAP25，卫星神经胶质细胞的簇0至3簇中的S100B，内皮细胞簇4中的PECAM 1和基质细胞的ACTA2 8簇中的ACTA2。在尝试这种方法时，重要的是要记住适当的准备和足够的设备，如精细解剖剪刀，锋利的镊子和带摆动桶转子的离心机是必不可少的。交感神经外源性心神经节的单核RNA测序的逐步方法在表征健康和疾病中支配其他相关器官和组织的神经节方面具有广泛的应用潜力。