Name: 软物质纳米压痕的实验和数据分析工作流程 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 4 s
Description: 学习使用纳米压痕技术测量水凝胶和细胞的机械性能，结合开源Python软件进行可重复的数据分析。该方法简化了原子力显微镜级别的力学测量流程，适用于健康与病变样本研究。

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GC 和 MAGO 感谢 CeMi 的所有成员。MSS 感谢相关支持 通过 英国工程与物理科学研究委员会项目资助（EP/P001114/1）
GC：软件（软件开发与算法的贡献）、正式分析（纳米压痕数据的分析）、验证、调查（聚丙烯酰胺凝胶的纳米压痕实验）、数据管理、撰写（初稿撰写、审阅与修改）、可视化（图表与图形）。MAGO：调查（凝胶与细胞样品的制备、细胞的纳米压痕实验）、撰写（初稿撰写、审阅与修改）、可视化（图表与图形）。NA：验证、撰写（审阅与修改）。IL：软件（软件开发与算法的贡献）、验证、撰写（审阅与修改）；MV：概念化、软件（原始软件与算法的设计与开发）、验证、资源、撰写（初稿撰写、审阅与修改）、监督、项目管理、经费获取。MSS：资源、撰写（审阅与修改）、监督、项目管理、经费获取。所有作者均阅读并批准了最终稿件。

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案展示了如何使用市售的光纤顶端纳米压痕仪，在水凝胶和单细胞上稳定地获取力谱纳米压痕数据。此外，还提供了使用基于Python编程的开源软件的操作说明，该软件包含一套精确的纳米压痕数据分析流程。
本方案中的关键步骤 
在执行本方案时，以下步骤被确定为尤为重要。
样品制备
在开始测量之前，必须根据测量的限制条件来制备样品。也就是说，样品需要固定在表面上，并尽可能保持平整。这一点在制备那些不像细胞那样能自然附着于表面的样品（例如水凝胶）时尤为重要。首先，样品不能在溶液中漂浮，否则会干扰测量并可能损坏探针。为此，建议对盖玻片进行化学功能化处理，使水凝胶能够在表面聚合并牢固附着，之后可将该表面在浸没状态下粘接到培养皿上。此外，样品表面应尽可能平整，以确保探针能够一致地检测到表面，并在进行矩阵扫描时沿x和y方向移动过程中避免损坏探针。水凝胶溶液可以在疏水性玻璃载片上聚合，这样得到的水凝胶表面平整且不会粘...

如今，力学在生物学中的基础作用已得到公认1,2。从整个组织到单个细胞，机械特性能够反映被研究生物材料的病理生理状态3,4。例如，受癌症影响的乳腺组织比健康组织更坚硬，这一概念正是常用触诊检测方法的基础5。值得注意的是，最近研究表明，由严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）引起的2019冠状病毒病（COVID-19）伴随着血细胞机械特性的改变，与未感染SARS-CoV-2的个体相比，表现为红细胞变形能力下降，以及淋巴细胞和中性粒细胞刚度降低6。
通常情况下，细胞与组织的力学特性本质上是相互关联的：每种组织都具有特定的力学性质，这些性质同时影响并依赖于其组成细胞及细胞外基质（ECM）的力学特性5。正因如此，研究生物学中力学特性的策略通常涉及构建具有生理相关力学刺激的工程化基底，以阐明细胞对这些刺激的响应行为。例如，Engler 及其同事的开创性研究证明，间充质干细胞的谱系分化由基质弹性所调控，该结论是在软性和刚性二维聚丙烯酰胺（PAAm）水凝胶上研究得出的7。
目前存在多种用于力学表征待研究生物材料的策略，这些策略在空间尺度（即从局部到整体）和变形模式（例如轴向与剪切）上各不相同，因此会得到不同的信息，需谨慎解读3,8,9,10。软性生物材料的力学性能通常以刚度来表示。然而，刚度同时依赖于材料特性和几何形状，而弹性模量则是材料的基本属性，与材料的几何形状无关11。因此，不同的弹性模量与特定样品的刚度相关联，每种弹性模量反映了材料在不同边界条件（例如自由膨胀与受限）下对特定变形模式（例如轴向与剪切）的抵抗能力11,12。纳米压痕实验可通过E来量化材料的力学性能，当生物材料未受侧向约束时，该参数对应于单轴变形（压痕）过程10,11,12。
最常用的方法是定量&#160;E 在微尺度上研究生物系统的方法是原子力显微镜（AFM）13,14,15,16原子力显微镜是一种极为强大的工具，其力分辨率可达皮牛（pN）级别。&#160;分辨率可达亚纳米级。此外，原子力显微镜在与互补的光学和机械工具联用方面具有极高的灵活性，从而扩展了其功能，可从被研究的生物材料中获取大量信息13然而，这些吸引人的特性也伴随着实验装置复杂性所带来的入门门槛。原子力显微镜（AFM）在获得可靠数据之前需要经过 extensive 的培训，且在日常生物材料力学表征中往往并不适用，尤其是当无需其独特的力分辨率和空间分辨率时。
正因如此，一类新型纳米压痕仪由于操作简便，同时仍能提供与原子力显微镜（AFM）相当的数据——具有亚纳牛（sub-nN）级的力分辨率和微米级（µm）的空间分辨率，能够反映细胞在相关尺度下施加和感知的力学作用，近年来日益受到关注2。特别是基于光纤传感技术的套管顶端式纳米压痕装置17,18，在从事力生物学及相关领域研究的科研人员中广受欢迎；已有大量文献利用此类装置报道了生物材料的力学特性，包括细胞19,20、水凝胶8,21以及组织22,23。尽管这些系统具备探测局部动态力学性能（即储能模量和损耗模量）的能力，但目前最常用的方法仍是获得弹性模量（E）的准静态实验8,19,20,21。简而言之，准静态纳米压痕实验&#160;通常以恒定速度对样品进行压入，直至达到预设的目标值（由最大位移、力或压入深度定义），并同时记录悬臂的力和垂直位置，从而获得所谓的力-距离（F-z）曲线。F-z 曲线随后通过确定接触点（CP）转换为力-压入深度（F-δ）曲线，并采用合适的接触力学模型（通常为赫兹模型13）进行拟合，以计算 E。
尽管套管顶式纳米压痕仪的操作类似于原子力显微镜（AFM）测量，但仍有一些特殊之处值得考虑。本文提供了使用商用套管顶式纳米压痕仪从细胞和仿组织水凝胶中稳定获取F-z曲线的逐步操作指南，旨在促进使用此类及其他类似设备的研究团队之间实验流程的标准化。此外，还给出了水凝胶样品和细胞样品制备的最佳建议，并针对实验过程中的常见问题提供了故障排除提示。
此外，纳米压痕实验结果（即弹性模量 E 及其分布）的大部分变异性取决于所采用的数据分析方法，而该过程并非简单。为解决这一问题，本文提供了使用一种新开发的开源软件的操作指南，该软件采用 Python 编程，配备用户友好的图形用户界面（GUI），可用于对 F-z 曲线进行批量分析。该软件支持快速数据筛选、数据过滤、通过多种数值方法计算接触点（CP）、常规 E 值计算，以及一种更为先进的分析方法——弹性谱分析24，从而可估算细胞整体的杨氏模量、肌动蛋白皮层的杨氏模量以及肌动蛋白皮层的厚度。该软件可从 GitHub 免费下载，并可通过添加适当的数据解析器，轻松适配用于分析来自其他系统的数据。需要强调的是，本实验方案也可用于其他光纤端面式纳米压痕装置，以及一般的其他纳米压痕设备，只需根据具体仪器的操作指南对部分步骤进行相应调整即可。本方案在 图1 中进行了示意图式总结。

<table><tbody><tr><td>12 mm 盖玻片</td><td>VWR</td><td>631-1577P</td><td></td></tr><tr><td>35 mm 细胞培养皿</td><td>Greiner CELLSTAR</td><td>627160</td><td></td></tr><tr><td>丙烯酰胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4058</td><td></td></tr><tr><td>丙烯硅烷</td><td>Alfa Aesar</td><td>L16400</td><td></td></tr><tr><td>过硫酸铵</td><td>Merk</td><td>7727-54-0</td><td></td></tr><tr><td>双丙烯酰胺</td><td>Merk</td><td>110-26-9</td><td></td></tr><tr><td>Chiaro 纳米压痕仪</td><td>Optics 11 Life</td><td></td><td>&amp;nbsp;无目录编号</td></tr><tr><td>乙醇</td><td></td><td></td><td>通用</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Gibco</td><td>16140071</td><td></td></tr><tr><td>高糖 DMEM</td><td>Gibco</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>异丙醇</td><td></td><td></td><td>通用</td></tr><tr><td>Kimwipe 擦镜纸</td><td>Kimberly Clark</td><td>21905-026</td><td></td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>VWR</td><td>631-1550P</td><td></td></tr><tr><td>MilliQ 超纯水系统</td><td>Merk Millipore</td><td>ZR0Q008WW</td><td></td></tr><tr><td>OP1550 干涉仪</td><td>Optics11 Life</td><td></td><td>无目录编号</td></tr><tr><td>Optics 11 Life 探针（k = 0.02–0.005 N/m，R = 3–3.5 µm）</td><td>Optics 11 Life</td><td></td><td>无目录编号</td></tr><tr><td>Optics 11 Life 探针（k = 0.46–0.5 N/m，R = 50–55 µm）</td><td>Optics 11 Life</td><td></td><td>无目录编号</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>RainX 防雨剂</td><td>RainX</td><td>26012</td><td></td></tr><tr><td>标准培养皿（90 mm）</td><td>Thermo Scientific</td><td>101RTIRR</td><td></td></tr><tr><td>四甲基乙二胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>110-18-9</td><td></td></tr><tr><td>真空干燥器</td><td>Thermo Scientific</td><td>531-0250</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;软件&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>数据采集软件（v 3.4.1）</td><td>Optics 11 Life</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GitHub Desktop（可选）</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Python 3</td><td>Python Software Foundation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Visual Studio Code（可选）</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

软物质纳米压痕的实验与数据分析流程

Experimental and Data Analysis Workflow for Soft Matter Nanoindentation

纳米压痕指的是一类实验技术，通过使用微米级的力探针来量化软性生物材料和细胞的局部力学特性。该方法在力学生物学、生物材料设计&#160;和组织工程领域中已占据核心地位，能够以接近单个细胞尺寸（μm）的空间分辨率，对软材料进行准确的力学表征。目前获取此类实验数据最常用的方法是使用原子力显微镜（AFM）；尽管该仪器在力（低至pN）和空间（亚纳米级）分辨率方面具有前所未有的优势，但其复杂的操作限制了其在常规测量中的应用，例如难以高效获取杨氏模量（E）等整体力学参数。近年来，基于光纤传感技术的新一代纳米压痕仪因其易于集成、并可在微米级空间分辨率下施加亚纳牛（sub-nN）级力而日益受到关注，因此适用于水凝胶和细胞等样品的局部力学性能探测。
本方案详细介绍了使用商用的光纤顶端传感纳米压痕仪获取水凝胶和细胞纳米压痕数据的实验操作步骤。尽管部分步骤针对本文所用仪器而设定，但只要根据制造商指南对某些步骤进行适当调整，该方案也可作为其他纳米压痕设备的操作参考。此外，本文还介绍了一款新的开源 Python 软件，该软件配备用户友好的图形界面，可用于纳米压痕数据的分析，功能包括对采集异常的力-位移曲线进行筛选、数据滤波、通过多种数值方法计算接触点、常规弹性模量 E 的计算，以及适用于单细胞纳米压痕数据的更高级分析方法。

按照方案，可获得一组 F-z 曲线。该数据集很可能包含有效曲线以及需要在继续分析前剔除的无效曲线。通常情况下，若曲线形状与图4A所示形状不同，则应将其剔除。图5AI展示了在预期弹性模量 E 为 0.8 KPa 的软性聚丙烯酰胺（PAAm）水凝胶上获得的大约100条曲线数据集35，已上传至NanoPrepare图形用户界面（GUI）。大多数曲线呈现出清晰且平坦的基线、过渡区域以及一个与材料表观刚度成正比的斜率区域13。然而，少数曲线表现出与图4A所示形状不同的异常情况，例如基线缺失、未检测到接触或基线呈倾斜状。这些曲线可通过NanoPrepare软件轻松从数据集中移除（图5AII，红色曲线），并以标准JSON格式保存干净的数据集（图...

本方案介绍了一种用于软材料纳米压痕实验的完整工作流程，包括水凝胶和细胞。首先，详细阐述了获取力谱数据的实验步骤；随后，通过一款新开发的开源 Python 软件对这类数据进行分析，该软件可从 GitHub 免费下载。

纳米压痕指的是一类实验技术，其中使用微米级力探针对软材料的局部力学性能进行量化……

本方案提供了使用市售纳米压痕仪测量水凝胶和细胞刚度的逐步操作指南，并介绍了一款开源软件，用于可重复地分析所获得的数据。该方案使我们能够获取类似原子力显微镜的数据，但复杂性却大大降低。因此，本方案不仅对研究健康与病变样品力学特性的科研人员具有实用价值，我们相信其在软材料纳米压痕研究领域也具有更广泛的应用前景。开启仪器并安装实验所选探头后，开始校准探头。在主软件窗口中点击“初始化”。在出现的校准菜单中，于输入框内填写探头信息。接着，用与样品皿相同的培养基填充一个底部平坦的厚壁玻璃培养皿，并将培养基的温度调节至与样品一致。然后，将校准皿置于探针下方。进行液体中校准时，用移液器尖端轻轻接触玻璃卡套，在探针上滴加一滴70%乙醇或异丙醇进行预润湿，使液滴流过悬臂和球形探头尖端。然后，手动将纳米压痕仪的机械臂向下移动，直至探针完全浸入液体中，但仍远离培养皿底部。等待五分钟，使液体达到平衡状态。接下来，在软件的“初始化”菜单中，点击“扫描波长”。干涉仪的屏幕将显示一个进度条。通过导航至干涉仪设备上的“波长扫描”面板，检查光学扫描是否成功。然后，在初始化菜单中，单击“查找表面”以逐步降低探头。当探针接触到玻璃培养皿时，会停止移动。探针与表面接触后，使用主软件窗口上的 y 轴向下箭头按钮将探针向下移动一微米。在实时窗口中观察绿色信号，注意每次一微米步进时基线的变化。然后，从“初始化”菜单中点击“校准”。校准完成后，在弹出窗口中检查旧的和新的校准因子。如果新的校准因子处于文中所述的正确范围内，请点击“使用新因子”。接下来，将压电陶瓷升高 500 微米。然后，通过进入干涉仪桌面的解调选项卡，检查解调圆是否已正确校准。轻轻敲击光学平台或纳米压痕仪，以引入足够的噪声。离散的数据点组成的白色圆形应大致覆盖红色圆形。将含有样品的培养皿放置在显微镜载物台上，并手动移动纳米压痕仪的探针至样品上方的预期位置。在溶液中滑动探针时，注意使探针与样品表面之间保持一到两毫米的距离。等待五分钟，使探针在溶液中达到平衡。使用光学显微镜对准探针。为测量软材料的杨氏模量，点击“配置实验”。添加一个“寻找表面”步骤，并以位移控制方式进行单次压痕，以确定后续自动矩阵扫描所用的实验参数。如果单次压痕成功，则设置包含50至100个点、间距为10至100微米的矩阵扫描。在确认已勾选“自动寻找表面”选项后，单击“使用载物台位置”，以从当前载物台位置开始矩阵扫描。在位移控制下设置矩阵扫描程序。将段数保持为五段，并使用默认的位移程序。如有必要，可修改每一段斜坡的位移程序及其持续时间。切勿超过每秒10微米的应变率。将配置好的实验保存到所需的实验路径中。单击“运行实验”，然后等待实验完成。当所有数据采集完成后，按照文中所述清洁探针并关闭仪器。若需筛选力-位移曲线并生成JSON格式的清理后数据集，请在实验室计算机的命令行中启动 prepare.py。从下拉列表中选择 Optics11 数据格式。如果数据未正确加载，请重新启动图形用户界面并选择 Optics11 Old。然后，点击加载文件夹，选择包含待分析数据的文件夹。使用图形用户界面上右侧的选项卡清理数据集。然后，点击“保存 JSON”，并为清理后的数据集输入适当的名称。如果与当前计算机不同，请将 JSON 文件发送至已安装 NanoAnalysis 软件的计算机。从命令行启动 nano.py 文件。在图形用户界面的左上角，单击“加载实验”并选择 JSON 文件。这将填充文件列表和原始曲线图，以力-位移曲线的形式显示数据集。在统计框中，检查三个参数的数值：激活数量（N activated）、失败数量（N failed）和排除数量（N excluded）。如需更详细地查看某一条特定曲线，可点击该曲线。这将使其在曲线图中以绿色高亮显示。选择单条曲线后，统计框中的 R 和 k 参数将自动填充。在进一步清理数据集后，使用过滤框中提供的滤波器对曲线中的噪声进行过滤。然后，在当前的曲线图中检查经过滤的曲线。经过滤的曲线以黑色显示，未经过滤的曲线则以绿色显示。为确定接触点，请在“接触点”框中选择软件中已实现的一系列数值方法之一。根据文中的说明，调整算法参数以适应数据集，确保正确确定接触点。要查看单条曲线上接触点的识别位置，可通过单击选择该曲线，然后点击“检查”。查看弹出的窗口，确认接触点的位置。然后，点击赫兹分析。这将生成三幅图。检查数据集中每条曲线的力-压痕数据，同时查看以红色显示的平均赫兹拟合结果。然后，检查带有误差带（显示一个标准差）的平均力-压痕曲线，以及以红色显示的平均赫兹拟合结果。接下来，检查由赫兹模型对每条单独曲线拟合得到的杨氏模量的散点图。检查结果框中计算出的平均杨氏模量及其标准偏差，确保其对于当前实验而言是合理的。然后，在保存框中，点击赫兹（Hertz）。在弹出窗口中输入文件名和目录，然后点击保存。将创建一个 tsv 文件。在任何其他软件中打开该 tsv 文件以进行统计分析和进一步绘图。对于细胞纳米压痕数据，点击弹性谱分析。检查生成的两个图，即每条曲线的杨氏模量随压痕深度变化的关系图，以及通过双层模型拟合的平均杨氏模量随压痕深度变化的关系图。分析完成后，点击“保存”框中的 ES。这将导出一个 tsv 文件到指定目录，该文件可用其他任意软件打开并作图。成功的实验结果表现为力-位移曲线的接近段具有清晰、平坦的基线、过渡区域和斜坡区域。使用 NanoPrepare 可轻松将偏离该形状的曲线从数据集中剔除。此处展示了软质聚丙烯酰胺水凝胶和硬质水凝胶的平均力-压痕曲线及其对应的平均赫兹模型。通过绘制杨氏模量的各个数值，获得了两种水凝胶的预期平均杨氏模量。对于细胞纳米压痕实验，平均力-压入深度曲线及相应的平均赫兹模型表明，赫兹模型无法完全描述随着压入深度增加，细胞纳米压痕实验中力的变化趋势。此处展示了拟合至200纳米压入深度的平均弹性模量谱。平均弹性谱在压痕深度为200纳米时开始上升，表明基底对所测得的表观杨氏模量产生了影响。因此，选择200纳米作为赫兹模型和双层模型的拟合范围。如正文所述，对双层模型进行拟合可提取更多关于细胞力学状态的信息，包括细胞肌动蛋白皮层厚度、细胞肌动蛋白皮层模量以及细胞整体模量。在杨氏模量分布方面，赫兹模型与弹性谱方法的直接比较显示出分布重叠且均值相近，证明了弹性谱方法的可行性。准确定位接触点，并在待比较的数据集之间保持所选算法参数的一致性，对于获得可靠的样品间比较结果至关重要。该方法具有广泛的适用性，可用于量化生物样品的局部弹性特性，包括球状体、类器官、组织以及通常意义上的所有软物质。

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