快速高尔基染色法用于海马和前额叶皮层树突棘的可视化
2021年12月3日
该方案描述了快速高尔基染色法的一种改良方法，可适用于神经系统的任何部分，用于对大鼠海马和内侧前额叶皮层中的神经元进行染色。
尽管高尔基染色技术相对简单，但仍有一些关键步骤较为棘手，若操作不当，将导致细胞无法用于分析。该技术可实现高尔基染色神经元的快速、可重复标记，且由于均值的标准误较小，便于不同实验之间的比较。
该技术最具挑战性的部分是切割冷冻切片机切片，因为组织的一致性和固定状态较为特殊，因此要将切片平整地贴附在载玻片上具有一定难度，需要经过练习才能掌握。首先，在预冷的冷冻切片机持块器上放置少量组织包埋介质。将脑组织块安装到持块器上时，需用手套包裹组织块使其一侧轻微融化，然后将其置于组织介质上。
使用冷冻喷雾处理刀片和组织块。切片时使用防滚板或刷子保持切片平整。在–22 °C条件下，用冷冻切片机切割100 µm厚的切片。
如果可能，使用室温载玻片进行解冻贴片，并迅速将其与切片贴合。或者，将载玻片保留在冰冻切片机中使其保持冷冻状态。用预冷的镊子或冷毛笔转移切片，然后进行解冻贴片。
将三到四个冠状切片贴附于载片上。每切完一片后，用纸巾擦拭刀片。若刀片需要进一步清洁，使用100%乙醇清洗，并在切割下一片前晾干。
将载玻片放入支架中，间隔足够距离以确保溶液能够接触到切片。将切片先后浸入蒸馏水中两次，每次四分钟，然后将其放入高尔基浸渍液中10分钟。分开盖玻片，确保仅将单个盖玻片覆盖在切片上。
在载玻片上加入足量封片剂，然后将盖玻片覆盖在载玻片上。盖好盖玻片后，将载玻片放置于任何非多孔性纸张上干燥3至5天，并在干燥过程中轻微移动载玻片，尤其是在第一天之后，以防止粘连。随后将载玻片转移至载玻片盒中，并最好在观察前干燥至少三周。
为了分析内侧前额叶皮层和海马CA1区锥体神经元的树突棘密度，使用图像分析程序测量树突长度。用手工计数器计数树突上的树突棘，并记录树突长度及树突棘数量。进行分析时，应选择胞体和树突均被浸渍染色、且树突连续并可与邻近细胞清晰区分的神经元。
该图展示了海马体CA1区高尔基染色细胞在低倍和高倍镜下的示例。该图说明了一项实验，在该实验中，经过环境富集后，青春期雄性和雌性大鼠CA1区及内侧前额叶皮层的锥体细胞基底树突棘密度增加。切片过程中保持足够低温具有挑战性，为此我们使用了大量冷冻喷雾以实现这一目的。
随后，将切片转移到载玻片上并使其平整干燥也较为困难。该技术用于观察神经解剖学特征，可单独使用，也可与其他神经解剖学示踪方法结合使用。
查看完整文字稿并访问数千部科学视频
概述
本研究详细介绍了一种改良的快速高尔基染色法，可特异性地对大鼠海马和内侧前额叶皮层中的神经元进行染色。该技术能够有效标记神经元，从而实现对神经解剖学特征的分析。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 神经解剖学
- 细胞生物学
背景
- 高尔基染色技术是一种成熟的神经元染色方法。
- 该技术可用于研究树突结构和树突棘密度。
- 该方法可适用于 nervous system 内不同区域。
- 由于组织的一致性，使用冰冻切片机切片时存在挑战。
研究目的
- 改进现有的高尔基染色法，以实现更优的神经元标记。
- 研究特定脑区中树突棘的密度。
- 探讨环境因素对神经元形态的影响。
使用的方法
- 大鼠脑组织的快速高尔基浸渍技术。
- 使用冷冻切片机精确切割100微米厚的切片。
- 正确将切片贴附到载玻片上的解冻技术。
- 在高尔基溶液中孵育以实现有效的神经元染色。
- 分析过程包括使用图像分析软件测量树突长度和计数树突棘。
主要结果
- 该技术实现了可重复的神经元标记，适用于后续分析。
- 证据显示，环境富集后锥体神经元的树突棘密度增加。
- 在雄性和雌性青春期大鼠中均成功检测到基底树突棘密度的变化。
结论
- 本研究验证了改良的高尔基法作为神经解剖学分析的一种可靠方法。
- 树突棘密度的研究有助于理解神经元可塑性。
- 未来应用可能包括评估环境因素对脑形态的影响。
常见问题
行业重要性概述
这种快速高尔基染色方法提供了一种可重复、低变异性的技术，用于可视化与神经精神疾病模型相关的关键脑区中的树突棘密度。该技术能够对海马体和前额叶皮层中的突触结构进行一致的定量分析，从而支持中枢神经系统药物发现项目中的靶点验证和机制去风险化。其与冷冻组织储存的兼容性以及极低的实验间变异性，增强了该方法在纵向临床前研究中的检测可靠性。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：能够在与疾病相关的神经环路中，对突触可塑性和树突形态的治疗假设进行探究。
- 操作价值：提供每10 µm树突上标准化的定量树突棘密度测量结果，便于不同实验间的可靠比较。
- 预测价值：通过将结构神经解剖学特征与环境富集及药物模型中的功能结果相关联，支持生物学层面的风险评估。
筛选与检测方法开发
- 检测准备就绪性：可稳定获得浸润良好的神经元，背景杂质极少，能够实现可靠的树突棘可视化与计数。
- 可重复性：不同实验间树突棘密度差异极小，保证了检测的精确性和统计效能。
- 可扩展性：允许脑组织积累并冷冻保存至处理阶段，便于批量处理，提高发现研究流程中的工作效率。
转化与临床前研究
- 疾病相关性：适用于与认知、抑郁和精神分裂症模型相关的海马体和前额叶皮层区域。
- 转化连续性：可将树突棘密度分析作为与生物标志物一致的读出指标，用于评估化合物对神经元结构的影响。
- 机制性风险降低：将结构变化（例如，环境富集后树突棘密度增加）与功能可塑性关联，支持中枢神经系统项目中的靶点信心。
流程与工作流整合
该方法适用于从早期靶点验证到临床前表型筛选的整个发现流程，尤其适用于以中枢神经系统为焦点、评估神经可塑性和突触完整性的研究项目。
- 发现生物学：以树突结构和树突棘密度作为突触健康和神经元连接性的替代指标，支持相关假设的验证。
- 筛选：提供可定量、可重复的输出结果（每10 µm树突上的树突棘数量），适用于高内涵分析及化合物效应的比较。
- 分析：通过图像分析和人工计数，实现不同条件下树突棘密度的统计学比较，均值标准误差较低，提升数据可信度。
- 转化研究：提供与学习和记忆模型中功能结果相关的结构表型读数，支持临床前验证研究。
- 企业级复用：作为一种标准化、可重复使用的神经解剖学研究平台，适用于多种脑区和疾病模型。
运营与企业影响
- 科学价值：通过降低突触可塑性评估中的机制模糊性，提高靶点验证的预测可信度。
- 操作价值：通过一致的浸渍效果、低背景信号和最小的实验间变异，增强实验的可重复性和标准化水平。
- 战略价值：提供可靠的神经解剖学数据，优先筛选对树突结构具有明确作用的化合物，从而优化“推进/终止”决策。
- 项目组合影响：通过量化与认知和行为终点相关的中枢神经系统结构生物标志物，实现基于风险评估的项目推进。
实施注意事项
- 需要具备冰冻切片机切片和组织处理的专业技能，以在-22°C切片过程中保持切片的平整性和完整性。
- 依赖于正确的解冻贴片技术以及防卷板或刷子的使用，以防止切片在载玻片转移过程中受损。
- 需要标准化的染色时间（在高尔基溶液中10分钟）和封片介质的应用，以确保神经元标记的一致性。
- 涉及较长的干燥时间（最初3–5天，随后至少3周），在成像前需提前规划工作流程。
- 依赖经过培训的人员使用图像分析工具和手动计数器准确进行树突棘计数和长度测量。
