Name: 快速高尔基染色用于海马体和前额叶皮层树突状脊柱可视化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 58 s
Description: 学习快速高尔基染色技术用于大鼠海马体和前额叶皮层神经元可视化，实现树突棘密度分析。该方法可重复标记神经元，为神经解剖学研究提供可靠工具。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本工作由圣心大学本科生研究计划资助项目支持。

所有实验程序均经圣心大学机构动物照护与使用委员会批准，并符合美国国立卫生研究院《实验动物照护与使用指南》的规定。
1. 脑组织的分离与灌注
<ol>
	<li>使用前24小时将高尔基染色试剂盒中的溶液A和B预先混合，并保存于避光瓶中或置于暗处。配制约80 mL的A和B混合液，以便在24小时后更换溶液。储存于密封瓶中。 
	注意：无需用生理盐水或甲醛溶液灌注。</li>
	<li>采用二氧化碳安乐死后，立即用断头器处死大鼠，并在数秒内取出脑组织。如有需要，可用生理盐水冲洗脑组织，但通常无需此步骤。
	<ol>
		<li>将脑组织腹面朝下放置于非多孔表面，使下丘脑可见（因为切面需位于其前后两侧），然后按照 图1 所示，将脑组织切成前部（包含前额叶皮层）和后部（包含海马）两个组织块。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将组织块放入预先混合的A和B溶液中，确保完全浸没。确保A和B溶液的体积足以完全覆盖组织块。将组织块储存于棕色瓶中，或用铝箔包裹的透明瓶中（以避光），并在室温下避光保存。</li>
	<li>24小时后更换新溶液，并继续在室温下避光保存13天。 
	注意：若用于小鼠脑组织，无需切块，可将整个脑组织直接放入溶液中。若染色的脑区大小不同，则在A和B溶液中的处理时间可能需要通过反复试验确定。</li>
	<li>两周后，组织块已充分渗透A和B溶液，此时将组织块转移至冷冻保护液（即高尔基染色试剂盒中的溶液C），在4 °C下放置48–72小时。 
	注意：冷冻保护完成后，组织块可冷冻保存直至后续处理。此外，请注意试剂盒中的所有溶液均应收集并作为危险废物处理。</li>
	<li>将脑组织腹面朝下置于干冰上的载玻片上进行冷冻。冷冻后可立即在恒冷箱切片机上切片，或于-80 °C保存直至使用恒冷箱切片机切片。 
	&#8203;注意：切勿使用液氮冷冻，否则会导致组织产生裂纹。</li>
</ol>
2. 脑组织切片
<ol>
	<li>在预冷的冷冻切片机样品头表面放置少量组织介质。通过戴手套的手轻微融化组织块的一面，然后将其放置在组织介质上，从而将组织块固定在冷冻切片机样品头上。 
	注意：无需对组织进行包埋。包含海马的组织块比包含前额叶皮层的组织块更容易切片，因为后者位于胼胝体前方，且两侧半球彼此分离。</li>
	<li>在 -22 °C 下使用冷冻切片机切割 100 µm 厚的切片，并将其贴附至涂胶载玻片上。也可使用厚度达 150 µm 的切片。每张载玻片尽量贴附 3–4 张冠状切片，以减少需要处理的载玻片数量。采用以下方法之一，在切片转移至载玻片前保持其冷冻状态。 
	注意：这些切片未经过常规固定处理，因此容易迅速融化。应让切片在载玻片上自然融化。若切片在贴附前即开始融化，则无法使其平整地贴附于载玻片上。有多种方法可用于实现此目的。
	<ol>
		<li>在切片过程中，使用冷冻喷雾对刀片和组织块进行冷却。根据室内温度和湿度情况，可能需要对每张切片都进行喷雾冷却。切割时使用防卷板或毛笔使切片保持平整。 
		注意：确保备有足够的冷冻喷雾。在切割 20 个组织块时，可能需要使用多罐喷雾。</li>
		<li>若条件允许，可采用室温载玻片进行贴片——即将载玻片迅速与切片接触以实现贴附。经过练习后，可一次贴附多张切片。若此方法不成功，则将载玻片保留在冷冻切片机内使其保持极低温，并使用冷镊子或冷毛笔转移切片，随后进行融化贴附。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>每次切片后，使用纸巾清洁刀片。若刀片需要更彻底清洁，则使用 100% 乙醇（EtOH）擦拭，并在下次切片前使其完全干燥。</li>
	<li>切片贴附至载玻片后，将载玻片平放在纸板制的载玻片托盘上，在避光条件下室温干燥数小时至最多 48 小时。切勿覆盖载玻片托盘。在进行高尔基染色前，必须确保切片完全干燥。干燥后的切片应平放于载玻片托盘中，在避光条件下保存直至进行高尔基染色。 
	&#8203;注意：干燥过程不会对切片造成任何损伤。</li>
</ol>
3. 脑组织的染色与脱水
<ol>
	<li>在玻璃染色皿中进行染色。染色前立即混合溶液D和溶液E。根据方案，加入一份溶液D、一份溶液E和两份蒸馏水。对于玻璃染色皿，配制200 mL溶液以完全浸没组织切片。对于Koplin染色缸，所需体积较少。</li>
	<li>将载玻片放入支架中，各支架之间需留出足够间距，以确保溶液能够充分接触组织切片。</li>
	<li>在进行高尔基浸渍染色前，先将切片置于蒸馏水中处理4分钟（重复两次），然后放入高尔基浸渍染色液中染色10分钟。每处理70个切片后更换一次染色液。当蒸馏水变黄时应及时更换。 
	注意：染色步骤的时间至关重要。时间过短会导致染色不足，时间过长则会引起过度染色，从而在分析时难以区分树突。一旦离开染色液，后续时间控制的重要性降低。</li>
	<li>按以下步骤脱水：70%乙醇（5分钟）、95%乙醇（5分钟；两次）、100%乙醇（5分钟；两次）、透明剂（5分钟；三次）。所有溶液应频繁更换，尤其是100%乙醇和透明剂，以确保切片保持无水状态。 
	注意：无需经过50%乙醇步骤。由于高尔基浸渍染色本身已提供足够的对比度，因此无需进行复染。其他透明剂的效果均不如本实验所用者（见材料表）。</li>
	<li>使用60 mm长的玻璃盖玻片封片，并加入足量封片介质。应尽量减少气泡产生。如有需要，可小心取下并重新封片（即使数周后也可操作）。操作时应缓慢进行，以免损伤组织切片（因封片介质用量较多，故可实现此操作）。 
	注意：使用大量封片介质虽略显杂乱，但十分必要，因为必须使用足够量的介质以覆盖厚达100 µm的组织切片。</li>
	<li>为确保每个切片上仅加盖一个盖玻片，应在操作前预先将盖玻片分离开。</li>
	<li>封片完成后，将载玻片平放在任何非多孔性纸上干燥3至5天，并在干燥过程中轻微移动载玻片，尤其是在第一天之后，以防止粘连。3至5天后将载玻片转移至玻片盒中，并理想情况下继续干燥至少3周后再进行观察。保持载玻片平放，以降低产生气泡的可能性。</li>
</ol>
4. 树突棘密度的测定
<ol>
	<li>为分析 mPFC 和海马 CA1 区锥体神经元的树突棘密度，请检查最外侧的次级基底树突和最外侧的三级顶树突，具体如步骤 4.1.1 所述（图 2）。
	<ol>
		<li>选择一条树突，使用图像分析程序测量其长度，用手动计数器计数该树突上的树突棘数量，并记录树突长度和树突棘数目。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>每只脑样本中每个区域（mPFC、CA1）分析六颗细胞。每组至少定量六只脑样本，方法如前所述7,8。选择符合以下标准的神经元进行分析：细胞体和树突染色清晰完整；树突可与邻近细胞区分且连续无中断。</li>
	<li>在1000倍油镜下使用光学显微镜手动计数树突棘，并使用图像分析程序测量树突长度。通过将树突棘数量除以树突长度计算树突棘密度，结果以每10 µm树突上的树突棘数量表示。 
	注意：目前已有更为精密的方法可用于区分树突棘亚型及树突结构特征，但在1000倍光学显微镜下手动计数可快速获得结果，从而判断是否需要进一步深入研究。尽管已尽力保持所采样树突的一致性，但树突粗细的自然变异仍可能影响计数结果。</li>
</ol>

<ol><li>Pannese, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Golgi+Stain%3A+invention%2C+diffusion+and+impact+on+neurosciences%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+History+of+the+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">The Golgi Stain: invention, diffusion and impact on neurosciences.</a> Journal of the History of the Neurosciences. 8 (2), 132-140 (1999).</li>
<li>Bentivoglio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Original+Histological+Slides+of+Camillo+Golgi+and+His+Discoveries+on+Neuronal+Structure%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">The Original Histological Slides of Camillo Golgi and His Discoveries on Neuronal Structure.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 13, 3(2019).</li>
<li>Swanson, L. W., Newman, E., Araque, A., Dubinsky, J. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSwanson%2C+LW+%22The+Beautiful+Brain%3A+The+Drawings+of+Santiago+Ramon+y+Cajal%22">The Beautiful Brain: The Drawings of Santiago Ramon y Cajal</a>. , Abrams. 208(2017).</li>
<li>Dall'Oglio, A., Ferme, D., Brusco, J., Moreira, J. E., Rasia-Filho, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%26%2334%3Bsingle-section%26%2334%3B+Golgi+method+adapted+for+formalin-fixed+human+brain+and+light+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">The &#34;single-section&#34; Golgi method adapted for formalin-fixed human brain and light microscopy.</a> Journal of Neuroscience Methods. 189 (1), 51-55 (2010).</li>
<li>Gabbott, P. L., Somogyi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%27single%27+section+Golgi-impregnation+procedure%3A+methodological+description%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">The 'single' section Golgi-impregnation procedure: methodological description.</a> Journal of Neuroscience Methods. 11 (4), 221-230 (1984).</li>
<li>Gould, E., Frankfurt, M., Westlind-Danielsson, A., McEwen, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+forebrain+astrocytes+are+sensitive+to+thyroid+hormone%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Developing forebrain astrocytes are sensitive to thyroid hormone.</a> Glia. 3 (4), 283-292 (1990).</li>
<li>Gould, E., Woolley, C. S., Frankfurt, M., McEwen, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gonadal+steroids+regulate+dendritic+spine+density+in+hippocampal+pyramidal+cells+in+adulthood%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Gonadal steroids regulate dendritic spine density in hippocampal pyramidal cells in adulthood.</a> Journal of Neuroscience. 10 (4), 1286-1291 (1990).</li>
<li>Woolley, C. S., Gould, E., Frankfurt, M., McEwen, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+occurring+fluctuation+in+dendritic+spine+density+on+adult+hippocampal+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Naturally occurring fluctuation in dendritic spine density on adult hippocampal pyramidal neurons.</a> Journal of Neuroscience. 10 (12), 4035-4039 (1990).</li>
<li>Frankfurt, M., Salas-Ramirez, K., Friedman, E., Luine, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cocaine+alters+dendritic+spine+density+in+cortical+and+subcortical+brain+regions+of+the+postpartum+and+virgin+female+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Synapse%22%5BJournal%5D)">Cocaine alters dendritic spine density in cortical and subcortical brain regions of the postpartum and virgin female rat.</a> Synapse. 65 (9), 955-961 (2011).</li>
<li>Frankfurt, M., Luine, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolving+role+of+dendritic+spines+and+memory%3A+Interaction%28s%29+with+estradiol%5BTitle%5D)+AND+%22Hormones+Behavior%22%5BJournal%5D)">The evolving role of dendritic spines and memory: Interaction(s) with estradiol.</a> Hormones Behavior. 74, 28-36 (2015).</li>
<li>Bowman, R. E., Luine, V., Khandaker, H., Villafane, J. J., Frankfurt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adolescent+bisphenol-A+exposure+decreases+dendritic+spine+density%3A+role+of+sex+and+age%5BTitle%5D)+AND+%22Synapse%22%5BJournal%5D)">Adolescent bisphenol-A exposure decreases dendritic spine density: role of sex and age.</a> Synapse. 68 (11), 498-507 (2014).</li>
<li>Bowman, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bisphenol-A+exposure+during+adolescence+leads+to+enduring+alterations+in+cognition+and+dendritic+spine+density+in+adult+male+and+female+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Hormones+Behavior%22%5BJournal%5D)">Bisphenol-A exposure during adolescence leads to enduring alterations in cognition and dendritic spine density in adult male and female rats.</a> Hormones Behavior. 69, 89-97 (2015).</li>
<li>Eilam-Stock, T., Serrano, P., Frankfurt, M., Luine, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bisphenol-A+impairs+memory+and+reduces+dendritic+spine+density+in+adult+male+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioral+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Bisphenol-A impairs memory and reduces dendritic spine density in adult male rats.</a> Behavioral Neuroscience. 126 (1), 175-185 (2012).</li>
<li>Inagaki, T., Frankfurt, M., Luine, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen-induced+memory+enhancements+are+blocked+by+acute+bisphenol+A+in+adult+female+rats%3A+role+of+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Estrogen-induced memory enhancements are blocked by acute bisphenol A in adult female rats: role of dendritic spines.</a> Endocrinology. 153 (7), 3357-3367 (2012).</li>
<li>Jacome, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gonadal+Hormones+Rapidly+Enhance+Spatial+Memory+and+Increase+Hippocampal+Spine+Density+in+Male+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Gonadal Hormones Rapidly Enhance Spatial Memory and Increase Hippocampal Spine Density in Male Rats.</a> Endocrinology. 157 (4), 1357-1362 (2016).</li>
<li>Frankfurt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bisphenol-A%3A+a+plastic+manufacturing+compound+disrupts+critical+brain+structures+and+impairs+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Research+Features%22%5BJournal%5D)">Bisphenol-A: a plastic manufacturing compound disrupts critical brain structures and impairs memory.</a> Research Features. , https://researchfeatures.com/wp-content/uploads/2021/05/Maya-Frankfurt.pdf (2021).</li>
<li>Wallace, M., Luine, V., Arellanos, A., Frankfurt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovariectomized+rats+show+decreased+recognition+memory+and+spine+density+in+the+hippocampus+and+prefrontal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Ovariectomized rats show decreased recognition memory and spine density in the hippocampus and prefrontal cortex.</a> Brain Research. 1126 (1), 176-182 (2006).</li>
<li>Wallace, M., Frankfurt, M., Arellanos, A., Inagaki, T., Luine, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+recognition+memory+and+decreased+prefrontal+cortex+spine+density+in+aged+female+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Science%22%5BJournal%5D)">Impaired recognition memory and decreased prefrontal cortex spine density in aged female rats.</a> Annals of the New York Academy of Science. 1097, 54-57 (2007).</li>
<li>Bowman, R. E., Hagedorn, J., Madden, E., Frankfurt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+adolescent+Bisphenol-A+exposure+on+memory+and+spine+density+in+ovariectomized+female+rats%3A+Adolescence+vs+adulthood%5BTitle%5D)+AND+%22Hormones+Behavior%22%5BJournal%5D)">Effects of adolescent Bisphenol-A exposure on memory and spine density in ovariectomized female rats: Adolescence vs adulthood.</a> Hormones Behavior. 107, 26-34 (2019).</li>
<li>Novaes, L. S., Dos Santos, N. B., Perfetto, J. G., Goosens, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+enrichment+prevents+acute+restraint+stress-induced+anxiety-related+behavior+but+not+changes+in+basolateral+amygdala+spine+density%5BTitle%5D)+AND+%22Psychoneuroendocrinology%22%5BJournal%5D)">Environmental enrichment prevents acute restraint stress-induced anxiety-related behavior but not changes in basolateral amygdala spine density.</a> Psychoneuroendocrinology. 98, 6-10 (2018).</li>
<li>Trzesniewski, J., Altmann, S., Jäger, L., Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+Purkinje+cell+size+is+compatible+with+near+normal+morphology+and+function+of+the+cerebellar+cortex+in+a+mouse+model+of+spinocerebellar+ataxia%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Reduced Purkinje cell size is compatible with near normal morphology and function of the cerebellar cortex in a mouse model of spinocerebellar ataxia.</a> Experimental Neurology. 311, 205-212 (2019).</li>
<li>Zemmar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligodendrocyte-+and+Neuron-Specific+Nogo-A+Restrict+Dendritic+Branching+and+Spine+Density+in+the+Adult+Mouse+Motor+Cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Oligodendrocyte- and Neuron-Specific Nogo-A Restrict Dendritic Branching and Spine Density in the Adult Mouse Motor Cortex.</a> Cerebral Cortex. 28 (6), 2109-2117 (2018).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本实验方案描述了一种高尔基染色方法，可实现多个切片的快速同步处理。该方法改进了此前报道的5更为耗时费力的技术，能够稳定地获得可用于分析的染色神经元。此外，该方法减少了实验人员接触高尔基染色过程中所用有毒化学试剂的机会。该操作过程中最具挑战性的环节是使切片在载玻片上保持平整，这需要大量实践才能掌握。使用冷冻喷雾使所有操作尽可能保持低温至关重要。
一旦切片干燥并可进行分析，选择计数细胞时保持一致性非常重要。海马体锥体细胞应选自CA1区。对于包含多个亚区的内侧前额叶皮层（mPFC），应选用其中下边缘皮层的锥体细胞。原因尚不明确，mPFC中的染色细胞数量通常少于海马体CA1区。此外，由于操作上的限制，若无法同时处理所有切片，可将实验分批进行。为保证一致性，同一组细胞应由同一个人完成计数。
该方法的局限性与其他高尔基浸渍法相似。仅少量细胞被染色这一特点实际上是一种优势，因为被浸渍的细胞数量较少，便于对整个细胞进行三维观察。高尔基法的缺点在于，尚不清楚被标记的是哪一类细胞亚群。因此，在实验中...

使用重铬酸钾和硝酸银标记神经元的方法最早由卡米洛·戈尔吉（Camillo Golgi）描述1,2，随后被圣地亚哥·拉蒙·卡哈尔（Santiago Ramon y Cajal）用于大量研究工作，以区分不同类型的神经元和胶质细胞。目前已有收录其插图的出版专著3。在拉蒙·卡哈尔发表这些研究（距今已超过100年）之后，戈尔吉浸渍法极少被使用。戈尔吉浸渍是一种费力的过程，但可借助光学显微镜实现神经元的三维可视化。多年来，该方法经历了诸多改进，以简化操作流程并提高染色的一致性4。1984年，加博特（Gabbott）和索莫吉（Somogyi）5提出了单切片戈尔吉浸渍法，使处理过程更为快速。该方法需使用4%多聚甲醛和1.5%苦味酸进行灌注，固定后经振动切片机将组织切片置于3%重铬酸钾溶液中。切片被贴附于载玻片上，盖玻片四角用胶水封固，以便在浸入硝酸银溶液时实现缓慢扩散。随后移除盖玻片，对切片进行脱水，并最终用封片介质永久封片。该技术已成功用于标记海马区的神经元和胶质细胞6,7,8。本文所述的快速戈尔吉法进一步优化了该技术，显著减少了对重铬酸钾和硝酸银的暴露，且无需使用多聚甲醛和苦味酸。此外，尽管采用加博特和索莫吉5方法的改良版也可分析浸渍后的细胞，但切片常出现染色过深或不足，或在脱水过程中从载玻片脱落，通常需要合并多个实验的数据才能获得足够数量的细胞用于分析。
本实验方案描述了使用高尔基染色试剂盒（见材料表）对大鼠海马和内侧前额叶皮层（mPFC）中的树突及树突棘进行标记的方法。与以往方法相比，该方法的优势在于操作快速、研究人员接触有害化学物质的时间更短，且神经元染色效果稳定一致。以下所述的实验方案已在多项研究中经少量修改后用于评估大鼠海马和内侧前额叶皮层（mPFC）中树突棘密度9,10,11,12,13,14,15。

<table><tbody><tr><td>纸板载玻片托盘</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-587-10</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片 24 × 60 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-M</td><td></td></tr><tr><td>FD Rapid GolgiStain 试剂盒</td><td>FD Neurotechnologies</td><td>PK 401</td><td>避光室温下可长期稳定；Golgi 染色试剂盒</td></tr><tr><td>冷冻喷雾剂</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-022524</td><td></td></tr><tr><td>HISTO-CLEAR</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-899-90147</td><td>透明剂</td></tr><tr><td>NCSS 软件</td><td>Kaysville, UT, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP-15-100</td><td>封片介质</td></tr><tr><td>Superfrost Plus 显微载玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Tek CTYO OCT 包埋剂</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-373-65</td><td>用于将脑组织固定在冷冻切片机样品夹头上</td></tr></tbody></table>

快速高尔基染色法用于海马和前额叶皮层树突棘的可视化

Rapid Golgi Stain for Dendritic Spine Visualization in Hippocampus and Prefrontal Cortex

高尔基浸染法采用高尔基染色试剂盒并稍作改进，用于浸染大鼠海马和内侧前额叶皮层中的树突棘。该技术相较于以往的高尔基浸染方法具有显著改进：预混试剂更安全，神经元浸染效果稳定且良好，背景杂质显著减少，并且在特定脑区，不同实验间树突棘密度的差异极小。此外，脑组织可在某一阶段后积累并冷冻保存，待后续再行处理。利用该方法可研究任何感兴趣的脑区。染色并封片后，通过计算单位长度树突上的树突棘数量来确定树突棘密度，结果以每10 µm树突上的树突棘密度表示。

采用快速高尔基染色法，细胞染色效果稳定且充分，可提供充足的细胞用于分析。这显著优于以往的方法，过去需要合并多个实验才能获得足够的分析数据。因此，现在可以一次性处理更多样本，且脑组织可在冷冻状态下保存直至处理。图 3 展示了海马 CA1 区经高尔基染色的细胞在低倍和高倍镜下的图像。对特定区域树突棘的计数结果具有一致性，标准误较小。这一点也十分重要，因为它使得不同实验之间可以进行有效比较。图 4 展示了一项实验结果：在环境富集（EE）后，青春期雄性和雌性大鼠的 CA1 区和内侧前额叶皮层（mPFC）中的锥体细胞基底树突棘密度均有所增加。简而言之，雄性和雌性大鼠在出生后第 21 天断奶，并被分配至对照组或环境富集组。环境富集组在出生后第 24 至 42 天期间，每天有 2 小时处于富集环境中，而对照组在此期间饲养于普通笼具中。结果表明，环境富集可诱导两性青春期大鼠在 CA1 区和 mPFC 中的基底树突棘密度增加。请注意，所有树突棘数值的平均值标准误（SEM）均较小。
<p class="jove_content" ...

该方案描述了快速高尔基染色法的一种改良方法，可适用于神经系统的任何部分，用于对大鼠海马和内侧前额叶皮层中的神经元进行染色。

高尔基浸染法，采用高尔基染色试剂盒并稍作改进，用于浸染大鼠海马和内侧……的树突棘

尽管高尔基染色技术相对简单，但仍有一些关键步骤较为棘手，若操作不当，将导致细胞无法用于分析。该技术可实现高尔基染色神经元的快速、可重复标记，且由于均值的标准误较小，便于不同实验之间的比较。该技术最具挑战性的部分是切割冷冻切片机切片，因为组织的一致性和固定状态较为特殊，因此要将切片平整地贴附在载玻片上具有一定难度，需要经过练习才能掌握。首先，在预冷的冷冻切片机持块器上放置少量组织包埋介质。将脑组织块安装到持块器上时，需用手套包裹组织块使其一侧轻微融化，然后将其置于组织介质上。使用冷冻喷雾处理刀片和组织块。切片时使用防滚板或刷子保持切片平整。在–22 °C条件下，用冷冻切片机切割100 µm厚的切片。如果可能，使用室温载玻片进行解冻贴片，并迅速将其与切片贴合。或者，将载玻片保留在冰冻切片机中使其保持冷冻状态。用预冷的镊子或冷毛笔转移切片，然后进行解冻贴片。将三到四个冠状切片贴附于载片上。每切完一片后，用纸巾擦拭刀片。若刀片需要进一步清洁，使用100%乙醇清洗，并在切割下一片前晾干。将载玻片放入支架中，间隔足够距离以确保溶液能够接触到切片。将切片先后浸入蒸馏水中两次，每次四分钟，然后将其放入高尔基浸渍液中10分钟。分开盖玻片，确保仅将单个盖玻片覆盖在切片上。在载玻片上加入足量封片剂，然后将盖玻片覆盖在载玻片上。盖好盖玻片后，将载玻片放置于任何非多孔性纸张上干燥3至5天，并在干燥过程中轻微移动载玻片，尤其是在第一天之后，以防止粘连。随后将载玻片转移至载玻片盒中，并最好在观察前干燥至少三周。为了分析内侧前额叶皮层和海马CA1区锥体神经元的树突棘密度，使用图像分析程序测量树突长度。用手工计数器计数树突上的树突棘，并记录树突长度及树突棘数量。进行分析时，应选择胞体和树突均被浸渍染色、且树突连续并可与邻近细胞清晰区分的神经元。该图展示了海马体CA1区高尔基染色细胞在低倍和高倍镜下的示例。该图说明了一项实验，在该实验中，经过环境富集后，青春期雄性和雌性大鼠CA1区及内侧前额叶皮层的锥体细胞基底树突棘密度增加。切片过程中保持足够低温具有挑战性，为此我们使用了大量冷冻喷雾以实现这一目的。随后，将切片转移到载玻片上并使其平整干燥也较为困难。该技术用于观察神经解剖学特征，可单独使用，也可与其他神经解剖学示踪方法结合使用。

rapid-golgi-stain-for-dendritic-spine-visualization-hippocampus

Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

快速高尔基染色用于海马体和前额叶皮层树突状脊柱可视化

FRAP 已被用于定量培养细胞中绿色荧光蛋白（GFP）标记蛋白的移动性。我们通过分析光漂白后荧光恢复的百分比，来检测 GFP 的可移动组分与不可移动组分。在本研究中，FRAP...

培养的海马神经元树突棘中荧光标记蛋白的光漂白后荧光恢复（FRAP）

最近的多项研究已发现与脑部病理相关的突触蛋白存在突变。原代培养的皮层神经元为研究这些致病相关蛋白对树突棘形态和运动性的影响提供了极大的灵活性。...

培养的中枢神经系统神经元中树突棘形态的分析

来源：McLeod, F., 等. 海马啮齿类脑切片中突触密度的评估. J. Vis. Exp.

使用免疫荧光法对小鼠海马脑片中突触进行显微分析

蛋白质的定位与分布为其细胞功能的研究提供了重要信息。电子显微镜（EM）具有较高的空间分辨率，可用于免疫组织化学后特定抗原亚细胞定位的确定。对于中枢神经系统（CNS）组织而言，在电子显微镜研究中同时保持结构完整性和抗原性尤为困难。本文采用一种已用于保存CNS中结构与抗原的方法，以研究和表征大鼠海马CA1区锥体神经元中的突触蛋白。...

海马脑片培养中突触蛋白的包埋后免疫金标记

本文描述了对新生大鼠幼崽进行触觉刺激以及随后进行高尔基-考克斯染色以观察神经元形态的实验步骤。触觉刺激是一种在围产期施加的积极刺激，通过使用家用除尘刷轻柔刷拭幼崽来实现。高尔基-考克斯染色是一种可靠的技术，能够实现完整神经元的可视化。...

通过高尔基-考克斯染色法观察早期积极经验——触觉刺激对树突形态和突触连接的影响

本文介绍了一种用于成像海马神经元树突棘的工作方案 体外...

使用结构光照明显微镜成像大鼠原代海马神经元的树突棘

我们介绍了两种用于可视化和定量分析小鼠模型海马中树突分支的方法：实时成像和扩展景深成像。前者可实现复杂的拓扑追踪，并对分支程度进行定量分析，后者则能够快速可视化树突树结构。...

小鼠海马区齿状回树突分支的评估

我们介绍一种在厚脑切片中使用高尔基-考克斯染色法的实验方案，以实现对具有长树突的神经元进行可视化观察 单个组织样本中包含的树木。本方案还介绍了两种变体，分别涉及焦油紫复染，以及未处理脑组织的冷冻以实现长期保存。...

使用高尔基-考克斯法对厚脑切片中的神经元进行成像

本文详细介绍了高尔基-考克斯染色法的完整实验方案。这种可靠的组织染色方法可对海马体以及全脑的细胞构筑进行高质量的评估，且几乎无需故障排查。...

利用高尔基-考克斯法评估老龄小鼠海马树突复杂性

连续块面扫描电子显微镜（SBEM）用于对小鼠海马区的树突棘进行成像和分析。...

用于树突棘研究的连续块面扫描电子显微镜技术（SBEM）

学习快速高尔基染色技术用于大鼠海马体和前额叶皮层神经元可视化，实现树突棘密度分析。该方法可重复标记神经元，为神经解剖学研究提供可靠工具。

快速高尔基染色法用于海马和前额叶皮层树突棘的可视化

探索更多视频