Name: 从mRNA中去除内部翻译起始位点，同时保留全长蛋白的表达 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-16T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 48 s
Description: 学习使用PCR结合限制性内切酶对小鼠Gja1基因M213L突变进行高效基因分型的方法。该技术可快速鉴定野生型、杂合子和纯合子基因型，为发育生物学中的基因功能研究提供经济可靠的实验方案。

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本项目由美国国立卫生研究院基金（R01HL152691、R01HL138577 和 R01HL159983）资助，授予 RMS。

所有动物护理和研究方案均经西达斯-西奈医学中心和犹他大学的机构动物护理与使用委员会批准。实验使用从商业来源获得的8至9周龄C57BL/6J雌性小鼠（见材料表）。
1. 基因靶向的准备工作
<ol>
	<li>使用 CRISPOR 网络算法4,9,10（参见材料表），在编码 M213 的靶向突变位点附近选择引导靶序列。 
	注意：选择了一个长度为 20 个碱基的引导序列（ATTCAGAGCGAGAGACACCA），位于 GJA1 编码序列的反向链上，其 MIT 评分11 为 62，潜在切割位点位于待突变密码子（ATG）下游 16 个碱基处（图 1；完整的 crRNA 序列见表 1）。</li>
	<li>合成与 Cas9 相互作用作为引导 RNA 的 crRNA 和 tracrRNA12。 
	注意：尽管该引导 RNA 的 MIT 评分为 62，但仅存在一个潜在的脱靶突变位点，且该位点有四个错配，距离 PAM 区域超过 12 个碱基。因此，该引导 RNA 被认为是安全的。</li>
	<li>设计一条与引导序列互补的供体寡核苷酸，用于引入单个氨基酸替换（ATG 变为 TTA；M213L），其 5' 和 3' 侧分别具有 60 和 48 个碱基的同源臂。 
	注意：该供体寡核苷酸包含一个用于破坏 PAM 序列的点突变（AGG 变为 ACG），通过引入一个同义突变（TCC 变为 TCG；S217S）来避免在 CRISPR 同源定向修复（HDR）13 引入目标突变后发生再次编辑（图 1 和 表 1）。</li>
	<li>使用 NaCl（终浓度为 200 mM）沉淀 10 µg 寡核苷酸，以最大限度减少盐分带入原核显微注射缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH 7.5；0.1 mM EDTA 和 100 mM NaCl，不含亚精胺和精胺14）中。 
	注意：不要用 70% 乙醇洗涤 DNA 沉淀，因为沉淀可直接溶解于溶液中。</li>
	<li>将 50 ng/µL 的供体寡核苷酸、60 ng/µL 的 crRNA/tracrRNA 混合物（1:1 摩尔比）（来自步骤 1.2）和 50 ng/µL 的 eSpCas9 蛋白（参见材料表）混合，配制成终体积为 20 µL 的 CRISPR 混合物（表 2）。若观察到较高毒性，可降低供体寡核苷酸的浓度（例如降至 25 ng/µL）。</li>
</ol>
2. 超数排卵诱导、卵母细胞采集、CRISPR 混合物原核显微注射及囊胚筛选
注意：本实验步骤遵循先前已发表的通用方案14。
<ol>
	<li>在第1天下午约15:00，通过腹腔注射方式，将5 IU的PMSG（孕马血清促性腺激素）（参见材料表）溶于100 µL无菌水中，注射至5-10只8周龄的小鼠。</li>
	<li>在注射PMSG后46-48小时（第3天），通过腹腔注射方式，将5 IU的hCG（人绒毛膜促性腺激素）（参见材料表）溶于100 µL无菌水中，注射至卵子供体小鼠。随后以1:1比例与种公鼠进行交配设置。</li>
	<li>使用透明质酸酶在M2培养基中收集受精卵，并于上午约10:00在100 µL M2培养基中洗涤三次，随后置于mWM15或KSOM16培养基中培养（第4天）（参见材料表）。</li>
	<li>在倒置显微镜下，使用带对比度增强光学系统的培养皿中，将石蜡油覆盖的100 µL M2培养基中的CRISPR混合物（步骤1.3）通过原核显微注射14导入从小鼠中收获的1细胞期胚胎中（下午早至晚些时候）（视频1）。 
	注：CRISPR混合物的原核显微注射在受精后14-16小时（p.c.）的1细胞期胚胎上进行。注射后的胚胎在5% CO2培养箱中培养数小时，并于受精后18-20小时手术移植至同日上午发现阴栓的受体ICR小鼠体内。</li>
	<li>将20-30个2细胞期胚胎移植至每只受体小鼠，以产生重组个体。 
	注：可按照通用方案14进行操作，或将胚胎在mWM或KSOM培养基中培养4天，以评估效率并检测毒性。当至少三分之一的注射胚胎发育至早期至完全扩张的囊胚阶段，且其中包含多个重组个体时，CRISPR混合物的毒性可接受。同时，在平行培养中，超过90%的未处理胚胎应达到相同的囊胚阶段。如需定量评估HDR成功率，可按步骤2.6-2.9进行囊胚筛选（非必需步骤）。</li>
	<li>使用带滤芯的精细移液吸头和移液器，将2 µL培养液连同早期至完全扩张的囊胚逐个转移至单独的PCR管中（第8天；视频2）。</li>
	<li>在8 µL裂解消化液（同步骤3.2；参见材料表）中裂解囊胚，75 °C处理10分钟，95 °C处理5分钟，随后冷却至4 °C保存。取2 µL裂解液作为模板，加入总反应体积为15 µL的PCR体系中进行PCR扩增（步骤3）。</li>
	<li>通过NlaIII酶切后的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳17，检测HDR效率。</li>
	<li>对首建鼠及其后代中668 bp的扩增子进行测序17，以确认靶向重组的状态并验证突变的完整性。</li>
</ol>
3. DNA 提取
注意：由于GJA1-20k基因敲除小鼠在出生后2至4周左右会出现突发性死亡，本实验采用出生后第10天的小鼠进行。4. 也可参照先前发表的报告采用更为通用的实验方案18.
<ol>
	<li>使用干净的剪刀剪取脚趾或尾尖1-3 mm，并转移至0.2 mL 8联PCR管中。为避免脚趾或尾部样本之间的污染，请使用预先清洁的剪刀，或每只小鼠使用单独刀片，或每次取样前用70%乙醇或10%次氯酸钠溶液清洁。若取样后尾部出血，可用纱布轻压片刻以止血。尾部样本可在-20 °C保存至多&#160;约一周，直至进行DNA提取。</li>
	<li>每管加入100 µL组织裂解液（见材料表），充分混匀，随后使用台式小型离心机离心（室温下2,200 x g，10 s）。确保尾部组织完全浸没于溶液中。</li>
	<li>将PCR管置于PCR仪中，按以下程序运行：75 °C孵育10 min（组织裂解），95 °C孵育5 min（酶失活），4 °C保存（暂存）。若无法立即进行PCR反应，组织裂解液可在4 °C保存至多一周。</li>
</ol>
4. 通过PCR进行DNA扩增
<ol>
	<li>为每个新 PCR 管配制 PCR 溶液，每管包含 5 µL 无核酸酶水（H2O）、0.75 µL 的 10 µM 正向引物和反向引物，以及 7.5 µL PCR 预混液（参见材料表）。引物序列见表 1。若样本较多，可按比例放大配制，每管分装 14 µL。</li>
	<li>向第 3.1 步配制好的 PCR 溶液中加入 1 µL 组织裂解液。注意不要触碰到尾部。</li>
	<li>充分混匀后，使用台式小型离心机在室温下以 2,200 × g 离心 10 秒。</li>
	<li>将 PCR 管放入已设定好如下程序的热循环仪中。PCR 产物可保存于 4 °C 1–2 个月，或在 -20 °C 保存约 1 年。 
	&#8203;注意：95 °C 3 分钟（第 1 步，初始变性），95 °C 15 秒（第 2 步，变性），60 °C 15 秒（第 2 步，退火），72 °C 45 秒（第 2 步，延伸），重复第 2 步共 35 个循环，72 °C 10 分钟（第 3 步，最终延伸），4 °C（第 4 步，保存）。</li>
</ol>
5. 用限制性内切酶孵育
<ol>
	<li>准备酶溶液，其中包含 7 µL 无核酸酶水（H2O）、2 µL 10x CutSmart 缓冲液和 1 µL NlaIII 限制性内切酶（见材料表）。如有多个样品，按比例扩大各组分体积配制混合液，并分装为每管 10 µL。</li>
	<li>向每管酶溶液中加入 10 µL 第 3 步获得的 PCR 产物。</li>
	<li>充分混匀后，使用台式小型离心机离心（室温下 2,200 × g 离心 10 秒）。</li>
	<li>将各管置于热循环仪或恒温金属浴中，按照下述程序进行反应。反应完成后，产物可于 4 °C 保存 1–2 个月，或于 -20 °C 保存约 1 年。 
	&#8203;注意：37 °C 孵育 16 小时（至少 2 小时；孵育时间过短可能导致切割不完全），随后在 4 °C 保存。</li>
</ol>
6. DNA 条带检测
<ol>
	<li>制备含有DNA凝胶染料的1.5%琼脂糖凝胶用于电泳。
	<ol>
		<li>将0.75 g琼脂糖加入50 mL的1×TAE缓冲液中，混匀后放入微波炉加热至琼脂糖完全溶解。冷却后，加入5 µL DNA染料并轻轻混匀。</li>
		<li>倒入凝胶模具中（每模具25 mL），静置使其凝固。如需获得更好的分辨率和分离效果，可根据需要将琼脂糖浓度提高至2.5%–4%。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将10 µL酶切后的PCR产物上样至加样孔中。如有需要，可加入6×上样缓冲液并混匀。</li>
	<li>以100 V电压电泳35分钟。 
	注意：这些参数可能需要优化。</li>
	<li>在紫外光（302 nm波长）下成像。</li>
</ol>

<ol><li>Smyth, J. W., Shaw, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoregulation+of+connexin43+gap+junction+formation+by+internally+translated+isoforms%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Autoregulation of connexin43 gap junction formation by internally translated isoforms.</a> Cell Reports. 5 (3), 611-618 (2013).</li>
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<li>Shimura, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+mitochondrial+fission+induced+by+stress-responsive+protein+GJA1-20k%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Protective mitochondrial fission induced by stress-responsive protein GJA1-20k.</a> Elife. 10, 69207(2021).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

基因修饰小鼠模型是研究基因功能的常用方法。然而，由于GJA1-20k这一由内部翻译产生的同源蛋白与全长Cx43蛋白来源于相同的Gja1 mRNA，因此需要设计一种创新策略，在保留全长Cx43表达的同时抑制GJA1-20k的表达。该策略基于对GJA1-20k内部起始密码子的突变。通过单点突变，将Gja1 mRNA上的M213位点突变为L，成功抑制了GJA1-20k的表达，同时保留了全长Cx43的表达4。
然而，单个内部翻译起始位点的点突变带来了另一个难题：小鼠基因型的鉴定。单个氨基酸残基的替换过于微小，难以设计特异性引物。此外，野生型（WT）和突变等位基因具有完全相同的碱基对。为了克服这些问题，在基因分型流程中增加了一个步骤。由于GJA1-20k的起始密码子（目标突变位点）可被限制性内切酶NlaIII识别，因此将该位点突变为不能被NlaIII识别的序列（图1；CATG突变为CTTA）。此外，设计用于扩增PCR产物的引物时，确保其产物中不含任何...

全长连接蛋白43（Connexin 43, Cx43）及其N端截短异构体GJA1-20k由同一GJA1 mRNA编码，但利用不同的起始密码子1启动翻译。Cx43的翻译起始于第一个AUG起始密码子，而GJA1-20k的翻译则起始于第213位残基处的AUG密码子。先前研究发现，GJA1-20k在全长Cx43的转运、肌动蛋白稳定以及线粒体形态调控中具有重要作用in vitro1,2,3。
为了理解GJA1-20k的作用 体内，一种GJA1-20k &#34;敲除&#34; 小鼠模型保留了生成全长Cx43的能力。该方法采用CRISPR-Cas9系统，将第213位的甲硫氨酸（M）替换为亮氨酸（L）（Gja1M213L/M213L)4内部的 M 至 L 突变显著降低了内部翻译发生的风险，同时保留了全长蛋白的翻译与功能4由于野生型（WT）和突变等位基因的大小相同且mRNA产物极为相似，因此在小鼠中确认基因型存在较大困难。DNA测序能够鉴定突变，但成本较高且耗时，不适合常规使用。目前已有多种快速基因分型方法，如实时聚合酶链式反应（RT-PCR）、微测序-连接法、高分辨率熔解曲线分析以及四引物扩增阻滞突变系统PCR（ARMS-PCR）。5,6,7,8然而，这些替代方法需要多个步骤、特殊的资源和/或多组特异性引物，可能引发非特异性的PCR产物。
本方案介绍了一种利用CRISPR-Cas9进行基因靶向与编辑的详细方法，用于构建单个氨基酸突变，并提供了快速基因分型方法以确认该突变。基因型鉴定采用了一种创新性的限制性内切酶策略，仅需一对引物即可识别目标基因。读者可参考文献4，了解单个残基Gja1M213L/M213L替换突变所导致的严重电生理效应——该突变仍可产生全长蛋白，但无法生成较小的内部翻译截短异构体。本方案将有助于构建其他小鼠模型，通过点突变来降低特定异构体的内部翻译，同时保留内源性全长蛋白的表达。

<table><tbody><tr><td>0.2 mL 8联排PCR管</td><td>托马斯科学公司</td><td>1148A28</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M EDTA pH 8.0</td><td>Invitrogen</td><td>15575-038</td><td>用于原核显微注射的缓冲液</td></tr><tr><td>10x CutSmart 缓冲液</td><td>新英格兰生物实验室</td><td>B7204S</td><td>NlaIII 消化缓冲液</td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl pH 7.5</td><td>Invitrogen</td><td>15567-027</td><td>用于原核显微注射的缓冲液</td></tr><tr><td>50x TAE 缓冲液</td><td>Invitrogen</td><td>24710-030</td><td></td></tr><tr><td>96孔热循环仪</td><td>应用生物系统公司</td><td>型号 # 9902</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J</td><td>杰克逊实验室</td><td>664</td><td>小鼠品系</td></tr><tr><td>Chemidoc MP 成像系统</td><td>Bio-rad</td><td></td><td>使用302 nm紫外光拍摄凝胶图像</td></tr><tr><td>eSpCas9蛋白</td><td>MilliporeSigma</td><td>ESPCAS9PRO-50UG</td><td></td></tr><tr><td>紫色上样缓冲液（6×）</td><td>New England Biolabs</td><td>B7024S</td><td>电泳上样缓冲液</td></tr><tr><td>手套</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>hCG（人绒毛膜促性腺激素）</td><td>MilliporeSigma</td><td>23-073-425G</td><td></td></tr><tr><td>透明质酸酶</td><td>MilliporeSigma</td><td>H3884-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Image Lab 软件</td><td>伯乐（Bio-rad）</td><td></td><td>分析凝胶图像</td></tr><tr><td>带微分干涉（plasDIC）的倒置体视显微镜</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert A1</td><td></td></tr><tr><td>KAPA 小鼠基因分型试剂盒</td><td>罗氏诊断</td><td>KK7352</td><td>用于组织或细胞裂解、DNA提取和PCR预混液</td></tr><tr><td>KSOM</td><td>利富高</td><td>ZEKS-050</td><td>胚胎培养液</td></tr><tr><td>实验室共艺</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>M2 培养基</td><td>MilliporeSigma</td><td>MR015D</td><td></td></tr><tr><td>NlaIII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0125S</td><td>消化PCR产物</td></tr><tr><td>无核酸酶水</td><td>Ambion</td><td>AM9937</td><td>稀释试剂</td></tr><tr><td>石蜡油</td><td>Nacalai USA</td><td>2613785</td><td></td></tr><tr><td>堵塞 20 &amp;mu;L型细口移液管尖端</td><td>FisherScientific</td><td>02-707-171</td><td>拾取囊胚</td></tr><tr><td>PMSG（孕马血清促性腺激素）&amp;rsquo;血清促性腺激素</td><td>ProSpec-Tany</td><td>HOR-272</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Invitrogen</td><td>AM9760G</td><td>用于原核显微注射的缓冲液</td></tr><tr><td>SYBR safe DNA凝胶染料</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td>检测凝胶中的条带</td></tr><tr><td>tracrRNA</td><td>Dharmacon</td><td>U-002000-120</td><td>向导RNA</td></tr></tbody></table>

在保留全长蛋白表达的同时移除 mrna 中的内部翻译起始位点

Removal of an Internal Translational Start Site from mRNA While Retaining Expression of the Full-Length Protein

CRISPR-Cas9 基因编辑系统基于基因组修复机制，相较于传统的同源重组技术，能够更快、更简便地构建基因修饰小鼠模型。当目标为引入单点突变时，CRISPR-Cas9 系统尤为适用。间隙连接蛋白 Connexin 43（Cx43）由基因 Gja1 编码，该基因仅含一个编码外显子，无法发生剪接。然而，Gja1 不仅可产生全长 Cx43 蛋白，还可通过一种称为内部翻译的机制，在内部 AUG（甲硫氨酸）起始密码子处启动核糖体翻译，生成多达六种 N 末端截短的亚型。GJA1-20k 是最常见的一种截短亚型，由 Gja1 mRNA 第 213 位的 AUG 密码子起始翻译产生。由于第 213 位残基位于 Cx43 最后一个跨膜结构域的末端，GJA1-20k 实质上是作为独立蛋白存在的 Cx43 的 20 kDa C 末端尾部。前期研究已在细胞中发现，GJA1-20k 的关键作用是促进全长 Cx43 间隙连接半通道向细胞膜的转运。为研究这一现象 体内一种携带Gja1点突变的转基因小鼠被构建出来，该突变将第213位残基的ATG（甲硫氨酸）替换为TTA（亮氨酸，M213L突变）。M213L突变的结果是Gja1 mRNA和全长Cx43仍可正常生成，但Gja1-20k的翻译显著减少。本报告重点介绍如何选择限制性酶切位点以构建单氨基酸突变（Gja1M213L/M213L) 小鼠模型。本方案描述了利用 CRISPR-Cas9 系统构建基因修饰小鼠，并通过结合 PCR 与限制性内切酶处理进行快速基因分型的方法。

CRISPR/Cas9 基因编辑系统在小鼠 10 号染色体的 56,264,279 至 56,264,281 位点和 56,264,291 至 56,264,293 位点分别引入 ATG 到 TTA 的突变以及一个同义的 TCC 到 TCG 突变，或相当于 Gja1 mRNA 的 869 至 871 位点和 881 至 883 位点。这些突变导致 GJA1 蛋白发生甲硫氨酸 213 到亮氨酸（M213L）的改变，而 TTC 到 TTG 的突变则破坏了邻近的 PAM 序列，以避免发生非预期的基因编辑（图 1）。该突变的详细信息已在先前的报道中描述4。
为了分析正确的基因型，PCR产物在进行琼脂糖凝胶电泳前需用限制性内切酶“NlaIII”进行消化（图2，步骤4）。如图2A所示，野生型（WT）等位基因的PCR产物会被切割成两个不同大小的碱基对片段（227 bp和4...

本方案描述了Gja1基因中一个M213L突变，该突变可维持全长连接蛋白43的正常生成，但阻止较小的GJA1-20k内部翻译异构体的翻译。

在保留全长蛋白表达的同时移除 mRNA 中的内部翻译起始位点

基于基因组修复机制的CRISPR-Cas9基因编辑系统，能够更快速、更简便地构建基因修饰小鼠模型……

单个残基替换的难点在于，尽管存在单个残基的差异，仍需高效地对动物进行基因分型。通过特别使用限制性内切酶，只需在常规基于PCR的基因分型流程中增加一个简单、快速且低成本的步骤即可。如果目标序列可被某种限制性内切酶识别（通常情况下均能满足），该方案可适用于任何其他具有点突变的小鼠模型。用干净的剪刀剪取尾尖一至三毫米，转移至0.2毫升八联PCR管中。按照文稿所述包含尾部样本后，于零下20摄氏度保存，直至提取，最长可保存约一周。每管加入100微升组织裂解液，充分混匀，随后在室温下使用台式小型离心机以2,200 × g离心10秒。确保尾部样本完全浸入溶液中。将试管放入已设定好组织裂解、灭活和保存程序参数的热循环仪中。若无法立即进行PCR，可将组织裂解液在4°C下保存最多一周。在新的PCR管中，为每个样本配制PCR反应液，包含5 µL无核酸酶水、0.75 µL 10 µmol/L的正向引物和反向引物，以及7.5 µL PCR预混液。向PCR反应液中加入1 µL先前制备的组织裂解液。充分混匀PCR反应液后，使用台式小型离心机在室温下以2,200 × g离心10秒。将试管放入程序化热循环仪中。反应完成后，将PCR产物在4摄氏度下保存一至两个月，或在零下20摄氏度下保存约一年。配制酶解溶液，其中包含7 µL无核酸酶水、2 µL 10X浓度的CutSmart缓冲液和1 µL NlaIII限制性内切酶。若有多个样本，需将各组分按比例混合，并分装为每管10微升。向每管酶溶液中加入10微升先前获得的PCR产物。充分混匀后，用台式小型离心机离心沉淀，操作方法同前。将试管置于程序化热循环仪或加热块上。孵育后，在低温条件下保存产物。在50毫升1倍浓度的TAE缓冲液中加入0.75克琼脂糖。将琼脂糖在微波炉中加热并混匀，直至完全溶解。冷却后，加入5 µL DNA染料并轻轻混匀。将25 mL琼脂糖凝胶倒入凝胶模具中，静置使其完全凝固。将10微升消化后的PCR产物加入加样孔中。以100伏电压电泳35分钟。在紫外光下成像观察琼脂糖凝胶。使用消化后的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，在每种基因型中均观察到多条不同大小的条带，其中野生型有两条条带，杂合子有三条条带，纯合子有一条条带。通过囊胚注射检测分析，每微升含有50纳克供体质粒的注射组成功率为76.9%，每微升含有25纳克供体质粒的注射组成功率为25%。最后，将每微升50纳克的供体质粒经乙醇沉淀后注射，获得的 founder 动物成功率为50%。通过乙醇沉淀法纯化寡核苷酸供体可在保持高效基因组编辑的同时降低毒性。操作过程中需谨慎处理，并加入少量试剂，这一点至关重要。确保试剂正确添加并充分混匀。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

从mRNA中去除内部翻译起始位点，同时保留全长蛋白的表达

对含有新生肽酰-tRNA的核糖体进行生化分析的主要障碍在于，同一样品中存在其他核糖体，这些核糖体并未参与待分析的特定mRNA序列的翻译。我们开发了一种简单的方法，可特异性纯化仅含有目标新生肽酰-tRNA的核糖体。...

分离含有肽基-tRNA的翻译核糖体用于功能与结构分析

本文描述了一种用于鉴定mRNA上翻译暂停位点的技术。该方法基于在体外翻译目标mRNA时，分离在核糖体上积累的新生多肽链，随后通过变性凝胶电泳对新生肽链的大小进行分析。...

核糖体结合新生多肽的分离 体外 识别mRNA上的翻译暂停位点

本文介绍一种目前常规用于分离稳定结合的核糖体新生肽链复合物（RNCs）的技术。该技术利用了以下发现：当一段长为17个氨基酸的SecM“阻滞序列”被插入（或融合至C末端）几乎任何蛋白质时，可在原核生物（E.

利用SecM阻滞序列作为分离核糖体结合多肽的工具

本文介绍一种在哺乳动物组织培养细胞中可视化内质网相关mRNA的方法。该技术包括利用皂苷选择性通透细胞膜以去除胞质内容物，随后进行荧光标记 原位 杂交以检测总多聚(A) mRNA...

哺乳动物细胞中内质网定位mRNA的可视化

许多编码线粒体蛋白的mRNA与线粒体外膜相关联。本文描述了一种旨在分离酵母线粒体及其相关mRNA和核糖体的亚细胞分级分离方法。该方案可应用于在不同条件下培养的细胞。 关键词：线粒体，mRNA，核糖体，亚细胞分级分离，酵母 为了揭示线粒体附近 mRNA...

分离与酵母线粒体相关的mRNAs以研究局部翻译机制

本文描述了一种用于可视化并定量亚细胞区室中局部翻译事件的方法。该方法仅需基础的共聚焦成像系统及试剂，具有快速、经济高效的特点。...

定量免疫荧光法检测全局限域性翻译

哺乳动物mRNA上翻译起始复合物形成的脚印分析

直接递送预先组装的Cas9/向导RNA核糖核蛋白复合物是实现造血细胞基因组编辑的一种快速高效的方法。在此，我们利用该方法删除RUNX1基因内含子中的沉默子，并检测OCI-AML3白血病细胞中的转录应答。...

利用 CRISPR/Cas9 核糖核蛋白在急性髓系白血病细胞中研究 RUNX1 内含子沉默子的转录调控作用

本实验方案描述了如何从小鼠骨髓中建立原代造血细胞培养，并随后使用 Gene Pulser MXCell...

小鼠骨髓来源的原代造血细胞培养物制备及其电穿孔

对完整质粒进行定点突变是创建原始质粒微小变异体的简便方法。本文中，我们展示了一种利用常规试剂在质粒中引入碱基替换的简单且经济有效的方法。...

全质粒自制定点突变

学习使用PCR结合限制性内切酶对小鼠Gja1基因M213L突变进行高效基因分型的方法。该技术可快速鉴定野生型、杂合子和纯合子基因型，为发育生物学中的基因功能研究提供经济可靠的实验方案。

在保留全长蛋白表达的同时移除 mRNA 中的内部翻译起始位点

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