在保留全长蛋白表达的同时移除 mRNA 中的内部翻译起始位点
2022年3月16日
本方案描述了Gja1基因中一个M213L突变，该突变可维持全长连接蛋白43的正常生成，但阻止较小的GJA1-20k内部翻译异构体的翻译。
单个残基替换的难点在于，尽管存在单个残基的差异，仍需高效地对动物进行基因分型。通过特别使用限制性内切酶，只需在常规基于PCR的基因分型流程中增加一个简单、快速且低成本的步骤即可。如果目标序列可被某种限制性内切酶识别（通常情况下均能满足），该方案可适用于任何其他具有点突变的小鼠模型。
用干净的剪刀剪取尾尖一至三毫米，转移至0.2毫升八联PCR管中。按照文稿所述包含尾部样本后，于零下20摄氏度保存，直至提取，最长可保存约一周。每管加入100微升组织裂解液，充分混匀，随后在室温下使用台式小型离心机以2,200 × g离心10秒。
确保尾部样本完全浸入溶液中。将试管放入已设定好组织裂解、灭活和保存程序参数的热循环仪中。若无法立即进行PCR，可将组织裂解液在4°C下保存最多一周。
在新的PCR管中，为每个样本配制PCR反应液，包含5 µL无核酸酶水、0.75 µL 10 µmol/L的正向引物和反向引物，以及7.5 µL PCR预混液。向PCR反应液中加入1 µL先前制备的组织裂解液。充分混匀PCR反应液后，使用台式小型离心机在室温下以2,200 × g离心10秒。
将试管放入程序化热循环仪中。反应完成后，将PCR产物在4摄氏度下保存一至两个月，或在零下20摄氏度下保存约一年。配制酶解溶液，其中包含7 µL无核酸酶水、2 µL 10X浓度的CutSmart缓冲液和1 µL NlaIII限制性内切酶。
若有多个样本，需将各组分按比例混合，并分装为每管10微升。向每管酶溶液中加入10微升先前获得的PCR产物。充分混匀后，用台式小型离心机离心沉淀，操作方法同前。
将试管置于程序化热循环仪或加热块上。孵育后，在低温条件下保存产物。在50毫升1倍浓度的TAE缓冲液中加入0.75克琼脂糖。
将琼脂糖在微波炉中加热并混匀，直至完全溶解。冷却后，加入5 µL DNA染料并轻轻混匀。将25 mL琼脂糖凝胶倒入凝胶模具中，静置使其完全凝固。
将10微升消化后的PCR产物加入加样孔中。以100伏电压电泳35分钟。在紫外光下成像观察琼脂糖凝胶。
使用消化后的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，在每种基因型中均观察到多条不同大小的条带，其中野生型有两条条带，杂合子有三条条带，纯合子有一条条带。通过囊胚注射检测分析，每微升含有50纳克供体质粒的注射组成功率为76.9%，每微升含有25纳克供体质粒的注射组成功率为25%。最后，将每微升50纳克的供体质粒经乙醇沉淀后注射，获得的 founder 动物成功率为50%。
通过乙醇沉淀法纯化寡核苷酸供体可在保持高效基因组编辑的同时降低毒性。操作过程中需谨慎处理，并加入少量试剂，这一点至关重要。确保试剂正确添加并充分混匀。
查看完整文字稿并访问数千部科学视频
概述
本方案介绍了一种对Gja1基因中具有单个M213L突变的动物进行基因分型的方法，该突变可导致全长Connexin43的表达，同时阻止较小的GJA1-20k亚型蛋白的翻译。该方法强调了在基于PCR的基因分型中使用限制性内切酶的高效性和成本效益。
关键研究组成部分
研究领域
- 遗传学
- 分子生物学
- 动物模型
背景
- 识别基因突变的重要性
- 单个氨基酸残基替换的挑战
- 限制性内切酶在基因分型中的应用
使用的方法
- 基于PCR的基因分型
- 携带点突变的小鼠模型
- 用于DNA分析的琼脂糖凝胶电泳
主要结果
- 成功鉴定出具有不同条带模式的基因型
- 产生 Founder 动物的高成功率
- 验证了所述方法在基因分析中的有效性
结论
- 该研究展示了一种在小鼠模型中进行突变基因分型的高效方案。
- 它为发育生物学中的遗传学研究提供了重要的方法学贡献。
常见问题
行业重要性概述
该方案可实现对小鼠模型中点突变的精确基因分型，支持需要解析亚型特异性蛋白表达的靶点验证研究。通过消除干扰性的截短亚型，同时保留全长蛋白功能，该方法增强了早期发现阶段的机制性风险排除能力。该策略提高了针对连接蛋白43（Connexin 43）生物学及其相关缝隙连接通路的治疗假设的预测可信度。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：通过分离全长Cx43与N端截短亚型的功能性贡献，可验证治疗假设。
- 操作价值：提供一种可扩展的基因分型方法，用于在大样本队列中区分野生型、杂合型和纯合型突变等位基因。
- 预测价值：通过明确所观察到的表型是源于全长蛋白的缺失还是特定亚型的机制，支持研究项目的优先筛选。
筛选与检测方法开发
- 检测准备就绪： 生成具有适合高通量筛选工作流程的限制性片段模式的DNA样本。
- 定量输出： 通过PCR-限制性片段长度多态性分析实现等位基因特异性定量。
- 可重复性： 在现有PCR方案中添加低成本的单一酶，即可在不同实验室之间标准化基因分型。
转化与临床前研究
- 疾病相关性：在Cx43转运和间隙连接组装与心脏、神经或肿瘤疾病相关的临床前模型中具有重要意义。
- 转化连续性：在维持全长Cx43表达的同时降低GJA1-20k，从而将分子基因型与表型结果关联起来。
- 风险调整决策：通过实现亚型表达水平与体内功能读数的相关性分析，为推进或终止决策提供依据。
流程与工作流整合
该方法适用于从早期靶点验证到临床前药效测试的整个发现过程，特别是在需要解析亚型特异性蛋白功能时尤为适用。
- 发现生物学：通过建立能够区分全长蛋白功能与截短亚型活性的遗传模型，支持假设验证。
- 筛选：提供适用于下游应用（如CRISPR验证或繁育群体管理）的即用型基因组DNA。
- 分析：在琼脂糖凝胶上产生清晰且可判读的条带模式，无需测序即可快速进行基因型判定。
- 转化研究：支持以Cx43膜定位和细胞间通讯为关键机制终点的临床前研究。
- 企业级复用：可适用于任何可通过引入或破坏限制性酶切位点检测的点突变，提供可重复使用的基因分型平台。
运营与企业影响
- 科学价值：通过分离特定亚型的贡献，减少靶点验证中的机制模糊性。
- 操作价值：通过单一的PCR后限制性消化步骤，提高样本通量并降低单样本成本。
- 战略价值：通过阐明基因型-表型关系，提升先导化合物优化过程中的决策信心。
- 项目组合影响：促进针对Cx43依赖性通路的候选分子进行风险调整后的推进。
实施注意事项
- 需要具备PCR引物设计和限制性内切酶选择方面的分子生物学专业知识。
- 依赖于热循环仪、琼脂糖凝胶电泳系统和紫外成像设备的可用性。
- 为获得一致的结果，需在不同操作者之间标准化组织裂解和PCR反应条件。
- 应用于其他模式系统时，取决于序列背景和限制性内切酶的兼容性。
- 仅适用于改变或创建限制性内切酶识别位点的突变；对于沉默突变，可能需要采用其他策略。
