基于结构的转录因子蛋白沿DNA从原子级步进到粗晶扩散运动的模拟和采样

该协议的目标是揭示蛋白质沿DNA的一维扩散的结构动力学，使用植物转录因子WRKY结构域蛋白作为示例系统。马尔可夫状态模型构建下的原子模拟揭示了蛋白质在原子细节下沿DNA的1-bp步进运动。而粗粒度模拟侧重于沿DNA的蛋白质过程扩散超过10个bps的采样。

首先，使用10微秒的全原子MD轨迹来平均向前提取10， 000帧，一个基本对步进路径。通过单击文件和保存坐标，在 VMD 中准备具有 10， 000 帧的过渡路径。然后，在"选定的原子"框中键入蛋白质或细胞核。

在"框架"框中选择"框架"，然后单击"保存"以获取所需的框架。将参考的长轴从DNA的晶体结构对齐到x轴，并通过单击扩展，然后在VMD中选择TkConsole，将完整的34个碱基对DNA的初始质心设置为坐标空间的原点。然后，在 TkConsole 命令窗口中键入该命令。

然后，通过单击 VMD 计算蛋白质主链的均根平方距离，然后转到扩展，单击分析，然后选择 RMSD 轨迹工具。在原子选择框中，键入原子核和残基14至23和46至55。单击"对齐"，然后单击"RMSD"框。

要计算蛋白质围绕DNAθ T的旋转度，在MATLAB的XY平面上，使用定义为θ 0的初始角度定位，执行命令。在 MATLAB 中输入指令以使用 K 均值方法，并将 10， 000 个结构分类为 25 个聚类。完成后，收集25个集群中心的结构以进行进一步的MD模拟。

要进行第一轮 MD 仿真，请使用 GROMACS 和构建系统 sh 文件为 25 个结构构建一个原子系统。通过在壳中处理命令，对 NPT 集成下的 25 个系统进行 60 纳秒的 MD 仿真，时间步长为 2 飞秒。要对第一轮 MD 轨迹进行聚类，请删除每个仿真轨迹的前 10 纳秒，并从 25 乘以 50 纳秒的轨迹收集确认。

对于与时间无关的成分分析，请在GROMACS中输入脚本，然后选择蛋白质和DNA之间的距离对作为输入参数投影。从索引。ndx 文件，到新的文本文件索引.dat。

要获取这些原子之间的对信息，请使用 Python 脚本。在 MSMBuilder 命令窗口中计算每个轨迹的 415 个距离对。接下来，执行与时间无关的分量分析，通过执行命令将数据维度减少到前两个时间独立分量或向量上。

通过处理 MSMBuilder 中的指令，使用案例中心方法将投影数据集聚类为 100 个聚类，并选择每个聚类的中心结构。要进行第二轮MD仿真，请从100个初始结构开始进行60纳秒的MD仿真。对所有原子施加随机初始速度后，通过打开 MDP 文件中的速度生成来添加随机初始速度。

如前所述，删除每个模拟的前 10 纳秒。并从 100 乘以 50 纳秒的轨迹中均匀地收集 2， 500，000 个快照，以构建 MSM。要对第二轮 MD 轨迹进行聚类，请在 MSMBuilder 中对第二轮轨迹执行与时间无关的分量分析，如下所示。

并通过执行Python脚本计算隐含的时间尺度以验证参数。然后，通过改变参数来改变滞后时间tau和微态数。通过执行命令将确认分类为 500 个群集。

对于 MSM 构造，将 500 个微状态集中为三到六个宏状态。若要找出最适合的宏状态的数量，请根据 MSMBuilder 中的 PCCAplus 算法，使用 Python 脚本。将高维确认映射到蛋白质沿每个微观状态的DNA的X和旋转角度。

为了计算平均首次通过时间，基于500微态MSM的转移概率矩阵进行5个10毫秒的蒙特卡罗轨迹，滞后时间为10纳秒作为蒙特卡罗的时间步长。使用 Bash 文件计算 Python 脚本中每对宏状态之间的平均首次通过时间，以及平均首次通过时间的标准误差平均值。在CafeMol 3.0软件中，通过在终端上执行命令来运行课程粒度模拟。

在输入文件中指定块后，使用各个命令设置文件名块和job_cntl块。接下来，设置unit_and_state块，然后设置energy_function块和md_information块。DNA上的所有蛋白质确认都映射到蛋白质沿DNA的纵向运动X和旋转角度，这可以进一步聚类为三种宏观状态。

S1状态不太有利，因为氢键与建模结构相似，而S3指的是亚稳态，其中所有氢键在一个碱基对步进后移动并且看起来稳定，最高总体为63%中间状态S2连接S1和S3，中等高群体为30%S2到S3的转换允许在大约七个中集体破坏和重整氢键微秒，而 S1 到 S2 的转换可以在大约 0.06 微秒内发生。计算蛋白质和DNA之间的接触次数，并确定四种状态。在状态 1 和 3 中，锌指区域向 Y 方向结合。

而在状态2和3中，锌指区域向Y方向结合。测量了不同DNA序列上每个保守残基的步进尺寸，结果表明，这些残基的步进尺寸在polyA DNA上比在polyAT或随机DNA序列上更同步。马尔可夫状态模型构建的重要步骤是选择蛋白质和DNA数据之间的距离对，修复成1-bp步进运动，并选择合适数量的微观状态和宏观状态。