Name: 利用显微CT扫描分析寄生植物与宿主的相互作用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 23 s
Description: 学习利用显微CT扫描和真空灌注技术增强寄生植物与宿主组织对比度的方法。该技术可实现三维无损成像，清晰观察吸器维管核心及寄生结构，为植物生物学研究提供重要工具。

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我谨向巴西圣保罗大学显微断层扫描实验室的 Simone Gomes Ferreira 博士和美国哈佛大学纳米系统中心的 Greg Lin 博士致以诚挚感谢，感谢他们在多种显微断层扫描系统及数据分析软件方面提供的至关重要的帮助和不可或缺的用户培训。同时感谢美国康涅狄格大学 EEB 温室的工作人员，特别是 Clinton Morse 和 Matthew Opel，为本研究提供了 Viscum minimum 的标本。John Wenzel 博士为 Pyrularia pubera 的采样工作提供了宝贵机会和大力支持。Carolina Bastos 硕士、Yasmin Hirao 硕士和 Talitha Motta 在 Scybalium fungiforme 的标本采集过程中给予了极大帮助。Ariadne Furtado 硕士以及 Fernanda Oliveira 博士和 Maria Aline Neves 博士提供了关于使用曙红 B 染色分析内生真菌的参考依据。在比利时布鲁塞尔自由大学进行视频录制期间，Philippe Claeys 博士、Christophe Snoeck 博士、Jake Griffith 硕士、Barabara Veselka 博士和 Harry Olde Venterink 博士提供了大力支持。&#160;本研究得到了巴西高等教育人员改善协调办公室（CAPES）和美国哈佛大学植物标本馆的资助。

1. 寄生植物样品选择
<ol>
	<li>采集完整的寄生植物吸器，包括附着的寄主茎/根以及寄生器官近端和远端的两段组织；每段的理想长度应相当于吸器直径的两倍。 
	注意：对于侧生吸器，应包含形成该吸器的寄生植物母体茎/根的一部分（图1A、B、D）。对于内寄生植物，应采集寄主茎/根中可见寄生迹象的一段组织（图1B）。对于顶端连接的情况，应采集整株植物（图1E）。</li>
	<li>将整个样品浸入固定液（如FAA）中，样品与固定液的体积比为1:10。根据样品大小，固定时间至少为1天27。 
	​注意：样品可在扫描前长期保存于固定液中，或转移至保存液（如70%乙醇）中。若无需进行后续解剖学分析，也可使用新鲜样品（参见讨论部分）。若使用新鲜材料，应先设置好对比剂灌注装置，再采集样品，并防止样品干燥。</li>
</ol>
2. 对比溶液的应用
<ol>
	<li>选择要使用的方法。对于较小的（图 1A）或非木质的（图 1B）样品，使用真空法（步骤 2.3）。对于较大的样品，使用灌注法，前提是样品包含一段寄主茎/根（图 1A，C-E）。</li>
	<li>无论选择以下哪种方法，在操作样品时均需佩戴橡胶手套及其他适当的个人防护装备（例如实验服）。 
	警告：所有对比溶液均含有重金属盐成分，因此必须在配备适当个人防护装备并在通风橱内操作，不得徒手接触。</li>
	<li>对于真空法，请遵循以下步骤。
	<ol>
		<li>选择合适的小瓶并进行标记。小瓶的尺寸必须足以容纳样品和对比溶液，通常体积比为 1:10。请查阅制造商的说明，确保小瓶能够承受低至中等程度的真空。 
		注意：不要将小瓶装满，因为负压（真空）可能导致液体溢出。</li>
		<li>将样品放入装有对比溶液（1% 碘液或 3% 磷钨酸盐，参见材料表）的小瓶中。然后将小瓶置于连接真空泵的真空室或干燥器中。取下小瓶盖，再关闭真空室或干燥器。</li>
		<li>检查真空室/干燥器是否存在裂纹，并确认真空泵油量充足。</li>
		<li>关闭泵的排气阀以防止空气逸出，打开真空室/干燥器的排气阀以强制排出空气。</li>
		<li>启动泵，等待压力降至约 20" Hg。 
		警告：该过程通常较快，因此不得无人看管真空系统。 
		注意：尽管压力的国际单位制单位为帕斯卡（Pa），但大多数实验室真空泵的压力表显示单位为英寸汞柱（"Hg）、磅每平方英寸（psi）或巴（bar）。20" Hg 约等于 67.7 Pa、10 psi 或 0.7 bar。</li>
		<li>关闭真空室/干燥器的排气阀以防止空气重新进入，然后迅速关闭泵。</li>
		<li>使样品在真空下至少保持 2 小时；较大的样品需要更长时间，以确保对比溶液充分渗透。</li>
		<li>经过所需时间后，将样品从对比溶液中取出，准备进行扫描。</li>
		<li>缓慢打开真空室/干燥器的排气阀，使空气缓慢进入。</li>
		<li>等待真空室/干燥器内的压力完全释放（即压力表接近 0），然后小心打开以取出样品。</li>
		<li>妥善处理用过的对比溶液，并将样品保留以备扫描。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对于灌注法，请遵循以下步骤。
	<ol>
		<li>根据样品大小选择合适的对比溶液储液罐。对于小样品使用 50 mL 注射器（无针头和活塞）（图 2A），对于大样品使用 1 L 静脉输液医疗套件（图 2B）。</li>
		<li>将一段透明塑料管（参见材料表）的一端连接至储液罐，另一端连接至一个二通或三通阀。将第二段管子连接至阀的另一个出口（图 2A，B）。</li>
		<li>将储液罐固定在较高位置，同时不拆卸前一步骤中已组装的装置。 
		注意：储液罐与样品之间的垂直距离将决定灌注压力（图 2B）。对于小样品，20–50 cm 的距离已足够；对于大样品，1 m 的距离更为合适。</li>
		<li>关闭三通（图 2C）或二通（图 2D）阀以防止液体从管路系统流出，然后将对比溶液倒入储液罐。若使用静脉输液医疗套件，则先将溶液注入袋中，在将装置固定于高处前关闭阀门。</li>
		<li>确保管路系统中未形成较大的气泡（图 2E）。如有必要，让对比溶液从管路中流出，直至气泡排出。再次关闭阀门，并将装置保持原位。</li>
		<li>为准备样品进行对比溶液灌注，将样品保持浸没在液体（水、乙醇或固定液）中，并在样品中切断寄主茎/根近端的顶端（图 2F）。</li>
		<li>将样品从储存液体中取出，并用石蜡膜包裹以防止干燥。将样品置于附近，准备连接至装置。</li>
		<li>小心打开阀门，使对比溶液缓慢流动并充满连接至储液罐的塑料管，同时将系统开口端略抬高，以防止溶液溢出。再次确认管路中未形成较大气泡。</li>
		<li>将样品中寄主茎/根的近端连接至管路系统的开口端（图 2B，放大区域）。此步骤中应避免引入气泡。如有必要，将样品与装置断开，通过让溶液流动来清除系统中的气泡。</li>
		<li>在保持样品与装置连接的同时，将其放入容器中，以防止对比溶液泄漏至实验区域。使用不同直径的管子、塑料扎带和阀门适配器（图 2G）确保装置各连接处紧密贴合，适配不同尺寸的寄主枝条，并防止溶液从管路系统泄漏（图 2B，放大区域）。</li>
		<li>让溶液对样品灌注至少 2 小时，或直至溶液在容器中积聚。</li>
		<li>关闭阀门，小心地将样品从装置上断开。将剩余溶液排入容器中，并妥善处理。</li>
		<li>在准备扫描前，从样品上去除石蜡膜。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="静态平衡装置示意图；包含蒸腾作用研究中的导管、阀门和植物。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63423/63423fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图2"> 
图2灌注法用于对比剂给药 小 (A）和大型（B灌流装置的示意图版本包括一个供液罐（st）和两条通过阀门（va）连接的塑料管（t1 和 t2）。寄生植物（P）附着于寄主茎段（H）的近端 通过 吸器（ha）与系统的开口端相连（B，放大图）。一个三通（C）或双向（D）阀用于帮助防止管路系统内形成气泡，以免气泡阻塞造影溶液的流动E）。接穗基部末端的顶端（H）在水下切割，以允许对比溶液通过（F）。扎带、阀门接头以及不同直径的管路有助于实现系统中更牢固的连接，并防止泄漏（G）。图 2B、D 和 F 使用 BioRender 制作。比例尺 = 2 cm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63423/63423fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
3. 样品制备与安装
<ol>
	<li>将样品浸入水中清洗 2 分钟。 
	注意：请勿在水槽中清洗样品，因为所有对比溶液均含有重金属盐。用于清洗的水应视为稀释的对比溶液，并应妥善处理。</li>
	<li>将样品置于室温下的纸巾上，使多余水分蒸发 2–5 分钟，具体时间根据样品大小而定。也可用纸巾轻轻吸干样品表面水分，但不得让样品完全干燥。</li>
	<li>用石蜡膜包裹样品，并将其拉伸成一层薄膜。避免将石蜡膜折叠在样品上方。</li>
	<li>将包裹好的样品固定在样品台上，确保其在扫描旋转过程中保持稳定和位置固定。可使用胶带、低密度泡沫、移液器吸头和/或透明塑料容器来固定样品。</li>
	<li>根据所用 micro-CT 系统的特定协议和指南对样品进行扫描并分析图像。</li>
</ol>

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<li>Ellis, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staining+sectioned+biological+specimens+for+transmission+electron+microscopy%3A+Conventional+and+En+bloc+stains%5BTitle%5D)+AND+%22Electron+Microscopy%3A+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">Staining sectioned biological specimens for transmission electron microscopy: Conventional and En bloc stains.</a> Electron Microscopy: Methods and Protocols. 1117, 57-72 (2014).</li>
<li>Brodersen, C. R., McElrone, A. J., Choat, B., Matthews, M. A., Shackel, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamics+of+embolism+repair+in+xylem%3A+In+vivo+visualizations+using+high-resolution+computed+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">The dynamics of embolism repair in xylem: In vivo visualizations using high-resolution computed tomography.</a> Plant Physiology. 154 (3), 1088-1095 (2010).</li>
<li>Brodersen, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+analysis+of+three-dimensional+xylem+networks+using+high-resolution+computed+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Automated analysis of three-dimensional xylem networks using high-resolution computed tomography.</a> New Phytologist. 191 (4), 1168-1179 (2011).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

使用重金属溶液提高植物组织对比度已成为微计算机断层扫描（micro-CT）分析样品制备中的关键步骤。Staedler 等人测试了植物微形态学实验室中常见的多种化合物，推荐磷钨酸作为穿透样品并提高对比度指数的最有效试剂8。本文对 P. pubera 吸器的分析结果进一步证实了该建议的可靠性。在对比剂应用方面，Staedler 等人描述，对比溶液通过被动渗透方式进入被分析材料（花和花蕾，大小范围为 1 mm 至 10 mm），处理时间为 1 至 8 天8。其他研究者在分析较大样品（如内寄生大花草科 Rafflesiaceae 物种宽度达 30 cm 的花朵）时，采用了类似的被动渗透方案，但处理时间更长（1–4 周）28。尽管该方法已被证明有效，但本研究所获得的结果表明，在真空条件下可显著加快渗透过程，从而改进已有方法。真空室或真空泵可迫使植物组织中的空气逸出，从而更有利于对比溶液的渗透。即使对于脆弱结构，也可应用真空处理，本文中对 P. pubera 吸器以及被 ...

高分辨率X射线显微计算机断层扫描（micro-CT）是一种成像方法，通过从不同观察角度记录样品的多张X光片（投影），随后用于对样品进行虚拟重建1。该虚拟结构可进一步被分析、操作和分割，从而实现对样品内部的三维无损观察2。micro-CT最初为医学分析设计，随后拓展至工业应用，其优势在于无需侵入性操作即可可视化样品内部器官和组织3。与其他成像技术类似，micro-CT在视场范围与像素尺寸之间存在权衡关系，这意味着对大尺寸样品实现高分辨率成像几乎难以实现4。随着高能X射线源（如同步辐射）和次级光学放大技术的不断进步，目前最小分辨率已可达到100 nm以下5,6。然而，对大尺寸样品进行扫描需要更长的扫描时间，从而增加了因样品在扫描仪内移动或变形而产生伪影的风险。此外，micro-CT的成像效果通常受限于样品内部天然的密度差异及其与X射线的相互作用方式。较高的X射线剂量虽有利于穿透密度较大的样品，但在检测样品内部及其周围介质之间的密度差异方面效率较低7。相反，较低的X射线剂量穿透能力较弱，通常需要更长的扫描时间，但对密度变化的检测更为敏感7。
由于大多数植物组织由轻质（低密度）组织构成，对X射线吸收较弱，这些限制长期阻碍了显微断层扫描技术在植物科学中的应用8。显微CT技术最早的应用集中于绘制土壤基质中的根系网络9，10。随后，研究人员开始探索组织密度差异更显著的植物结构，例如木材，从而实现了对木质部功能11，12、复杂组织结构发育13，14以及植物间相互作用15，16，17的研究。随着对比剂的应用，对柔软且均质组织的分析正日益普及，目前对比剂已成为植物样品显微CT扫描前处理的标准步骤。然而，对比剂引入方案的效果可能因样品体积、结构特性以及所用溶液类型的不同而存在差异8。理想情况下，对比剂应能增强不同组织之间的区分度，支持对组织/器官功能的评估，和/或提供有关组织的生化信息18。因此，在扫描前对样品进行恰当的处理、制备和固定，对于任何显微CT分析都至关重要。
寄生植物吸器的显微CT成像 
寄生性开花植物是一类独特的被子植物功能类群，其特征在于具有一种称为吸器（haustorium）的特殊器官19。这种多细胞器官是经过修饰的茎与根之间的发育混合体，介导寄生植物与寄主之间的附着、侵入和接触过程20。因此，吸器被认为是“体现植物间寄生关系核心概念”的结构21。深入理解该器官的发育过程、结构特征及功能机制，对于研究寄生植物的生态学、进化及防控管理具有重要意义。然而，由于寄生植物整体结构复杂且高度特化，其吸器结构往往难以进行细致的分析与比较。此外，吸器内部的组织和细胞分布通常广泛且不均一（图1）。在此背景下，尽管使用小块组织样本便于操作并可获得更高分辨率，但可能对复杂结构（如寄生植物吸器）的三维构型得出错误结论。
尽管大多数寄生植物物种的吸器解剖结构和超微结构已有大量文献报道，但其三维组织结构以及寄生植物与寄主组织之间的空间关系仍鲜有研究17. 在Masumoto等人最近的一项研究中22，对300余张连续的半薄切片进行了成像，并重建为一个三维虚拟结构，用以表征两种寄生植物吸器的形态。该方法具有极高的细节分辨率，为吸器的细胞与解剖学三维结构提供了前所未有的观察视角。然而，此类耗时的技术难以应用于具有更广泛吸器连接的寄生植物的类似分析。微计算机断层扫描（micro-CT）作为一种优秀的工具，正适用于对寄生植物复杂且常具较大体积的吸器进行三维分析。尽管其无法完全替代精细的解剖切片及其他互补的显微分析方法17,23，获得的结果 通过 微型计算机断层扫描（micro-CT）尤其适用于大样本，还可用于指导小片段的取样，这些小片段可进一步利用共聚焦显微镜、电子显微镜等其他工具进行分析，或使用高分辨率micro-CT系统重新分析。
<img alt="植物寄生过程；标注寄主-共生体关系的示意图；植物相互作用研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63423/63423fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 1"> 
图 1：本实验方案中使用的不同功能类群的寄生植物。 附生型寄生植物 Pyrularia pubera（A），内寄生植物 Viscum minimum（B），具绿色果实（黑色虚线圆圈），寄生藤本植物 Cuscuta americana（C），槲寄生 Struthanthus martianus（D），专性根寄生植物 Scybalium fungiforme（E）。寄主根（Hr）或茎（Hs）的片段有助于将对比剂引入寄生植物的吸器（P）。样品中寄生植物母根/母茎的存在（箭头所示）可用于分析吸器导管的组织结构。矩形框表示用于分析的样品区域。比例尺 = 2 cm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63423/63423fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
随着显微CT在植物科学中日益普及，已有多种指南、实验方案和文献涉及样品扫描、三维重建、分割和分析3,10,24。因此，本文不再讨论这些步骤。与任何成像技术一样，样品的适当处理和固定是一项基础但常被忽视的关键步骤。为此，本实验方案重点介绍用于显微CT扫描的吸器样品的制备方法。更具体而言，本方案描述了两种将对比剂引入吸器样品的方法，以增强吸器中不同组织和细胞类型的可视化效果，便于在寄主根或茎中识别寄生组织，并实现对寄生植物与寄主间维管连接的三维分析。此处描述的制备方法也可适用于其他植物结构的分析。
本研究选取了五个物种，以更好地展示本文所述实验方案的便捷性。每个物种代表寄生开花植物的五个功能类群之一，从而涵盖与每个类群功能特性相关的具体问题。Pyrularia pubera（檀香科）被选为代表真根寄生植物（euphytoid parasites），这类植物在土壤中萌发，并形成多个吸器，将寄生植物与寄主植物的根部相连25。这些植物形成的吸器通常较为脆弱，容易从寄主上断裂26（图1A），因此需要更为精细的操作处理。内寄生植物（endoparasites）由Viscum minimum（槲寄生科）代表，该功能类群仅在寄主体外短暂可见（图1B），其生命周期的大部分时间以显著退化、菌丝状的细胞束形式存在于寄主组织内部25。第三类功能类群为寄生藤本植物，它们在土壤中萌发，但仅形成初生根，依靠多个吸器附着于寄主植物的茎部25（图1C）。本研究中，该类群由Cuscuta americana（旋花科）代表。与寄生藤本不同，槲寄生类植物直接在寄主植物的枝条上萌发，并发育出多个或单一的吸器25。用于代表该功能类群的物种是Struthanthus martianus（桑寄生科），其可与寄主枝条形成多种连接方式（图1D）。对单一槲寄生吸器的分析可结合显微CT与光学显微镜技术进行，详见Teixeira-Costa &amp; Ceccantini17的研究。最后，专性根寄生植物类群包括那些在土壤中萌发后侵入寄主植物根部，并从最早期生长阶段起即完全依赖寄主的物种25。本研究中，该类群由Scybalium fungiforme（蛇菰科）代表，其可形成大型块茎状的吸器（图1E）。
本方案中使用的所有植物样品均用70%福尔马林-醋酸-酒精（FAA 70）固定。取样后立即固定对保存植物组织至关重要，尤其是在需要进行后续解剖学分析的情况下。对于寄生植物的吸器而言，固定同样必不可少，因为该器官通常主要由非木质化的薄壁细胞组成20。有关植物组织固定的详细方案，包括固定液的配制，可参见其他文献27。然而，固定剂在不同程度上可能引起样品物理和化学性质的改变，从而使其不适用于某些特定的生物力学和组织化学分析。因此，也可使用新鲜样品，即在制备前立即采集的未经固定的材料。关于新鲜样品的处理方法以及对固定材料的问题排查建议，将在讨论部分予以说明。

<table><tbody><tr><td>3D X射线显微镜（XRM）系统</td><td></td><td>Zeiss Versa 620</td><td>用于扫描 &lt;em&gt;Pyrularia pubera&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>3D X射线显微镜 + A2:D22</td><td>Zeiss</td><td>Versa 620</td><td>用于扫描物种 &lt;em&gt;P. pubera&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>CT-Pro 3D 软件</td><td>Nikon</td><td>版本 XT 3.1.11</td><td>用于扫描图像的三维重建</td></tr><tr><td>CT-Vox 软件</td><td>Bruker</td><td>版本 3.3.1</td><td>用于图像和视频的分析与获取</td></tr><tr><td>Dragonfly 软件</td><td>Object Research Systems - ORS</td><td>版本</td><td>用于图像和视频的分析与获取</td></tr><tr><td>玻璃小瓶</td><td>Glass Vials Inc. SE</td><td>V2708C-FM-SP</td><td>由 VWR - USA 销售；确保小瓶能承受约 10 psi 的真空压力</td></tr><tr><td>Inspect-X</td><td>Zeiss</td><td>版本 XT 3.1.11</td><td>用于控制 Nikon X-Tek HMXST225 系统</td></tr><tr><td>0.0282 N 碘溶液</td><td>WR Chemicals BDH</td><td>BDH7422-1</td><td>由 VWR - USA 销售</td></tr><tr><td>硝酸铅 II PA 500 g</td><td>Vetec</td><td>361.08</td><td>由 SPLab 销售</td></tr><tr><td>显微断层扫描仪</td><td>Bruker</td><td>Skyscan1176</td><td>用于扫描物种 &lt;em&gt;C. americana&lt;/em&gt;、&lt;em&gt;S. martianus&lt;/em&gt; 和 &lt;em&gt;S. fungiforme&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>显微断层扫描仪</td><td>Nikon</td><td>X-Tek HMXST225</td><td>用于扫描物种 &lt;em&gt;V. minimum&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>NRecon 软件</td><td>Bruker</td><td>版本 1.0.0</td><td>用于三维重建</td></tr><tr><td>3% 磷钨酸水合物水溶液</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>101410-756</td><td>由 VWR - USA 销售</td></tr><tr><td>塑料薄膜（Parafilm）</td><td>Heathrow Scientific</td><td>PM996</td><td>由 VWR - USA 销售</td></tr><tr><td>500 mL 塑料输液袋</td><td>Taylor</td><td>3478</td><td>由 Fibra Cirurgica Produtos para Saude 销售</td></tr><tr><td>3/4'' PVC 管道</td><td>Nalge Nunc International</td><td>SC63013-164</td><td>由 VWR - USA 销售</td></tr><tr><td>扫描系统</td><td></td><td>Nikon X-Tek HMXST225</td><td>用于扫描 &lt;em&gt;Viscum minimum&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>扫描系统</td><td></td><td>Bruker Skyscan 1176</td><td>用于扫描 &lt;em&gt;C. americana&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>Scout-and-ScanTM 软件</td><td>Zeiss</td><td>版本 16</td><td>用于控制 Zeiss Versa 620 系统及扫描图像的三维重建</td></tr><tr><td>三通阀</td><td>ToToT</td><td>DMTWVS-5</td><td>由 Amazon USA 销售</td></tr><tr><td>两部分注射器</td><td>HSW Henke-Ject</td><td>4850001000</td><td>使用时不带活塞</td></tr><tr><td>真空室</td><td>Binder</td><td>80080-434</td><td>由 VWR - USA 销售；包含泵和连接管</td></tr><tr><td>VG Studio Max 软件</td><td>Volume Graphics</td><td>版本 3.0</td><td>用于图像和视频的分析与获取</td></tr></tbody></table>

利用微计算机断层扫描技术分析寄生植物与寄主的相互作用

Leveraging Micro-CT Scanning to Analyze Parasitic Plant-Host Interactions

微型计算机断层扫描（Micro-CT）已成为研究植物结构与功能的成熟工具。其非破坏性特点，结合三维可视化和虚拟切片的可能性，使得对复杂植物器官进行新颖且日益精细的分析成为可能。植物之间的相互作用，包括寄生植物与其寄主之间的相互作用，也可通过该技术进行探索。然而，由于这些植物之间存在相互作用，且其组织结构和组成常有差异，扫描前的样品制备变得尤为关键。此外，在采集、处理和制备寄生-寄主材料时，还必须考虑到寄生被子植物广泛的多样性，其形态从高度退化的营养体到乔木、草本和灌木不等。本文介绍了两种不同的方法，用于将对比剂溶液引入寄生植物和/或寄主植物中，重点关注对吸器（haustorium）的分析。该器官促进两种植物之间的连接与通讯。通过一种简便的方法，可对吸器组织结构进行三维解析，本文以真菌型、藤本及槲寄生类寄生植物为例进行了展示&#160;。选择特定的对比剂及施用方式，还可实现对内寄生体在寄主体内扩散路径的详细观察，并检测寄生植物与寄主之间直接的导管-导管连接，本文以一种专性根寄生植物为例进行了说明。因此，本方案可应用于多样化的寄生被子植物，以推动对其发育过程、结构特征及功能机制的理解。

寄生植物的吸器是一种复杂的器官，由多种不同组织和细胞类型构成，这些组织和细胞相互缠绕并与作为寄主的另一植株的组织相连20。在分析小型（图1A–C）和大型（图1D、E）吸器时，可利用显微CT扫描以无损且三维的方式深入理解这一复杂结构。为此，可将对比剂溶液施加于寄生植物与寄主植物的界面处，从而使原本X射线吸收率低且均一、难以分辨的样品得以清晰成像。本实验方案中描述的两种简便方法均通过加压推动对比剂溶液，以加快其在样品中的渗透。正如预期，本文所述方案适用于不同的显微CT系统。然而，扫描设置与参数会因系统型号和待测样品的不同而有所差异（Table 1）。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always...

微型计算机断层扫描（Micro-CT）是一种非破坏性工具，可用于三维分析植物结构。本实验方案描述了利用微型计算机断层扫描分析寄生植物结构与功能所需的样品制备方法。通过使用不同物种，展示了该方法在结合特定样品制备技术时的优势。

微型计算机断层扫描（Micro-CT）已成为研究植物结构与功能的成熟工具。其非破坏性特点，结合……的可能性，……

该方案显著提高了利用显微断层扫描技术分析样品时寄生植物与寄主植物组织之间的对比度。本文所述技术可加速对比剂在样品中的灌注过程，从而实现对寄生植物与寄主之间形成的特定组织和结构的分析。真空处理方法非常简便，操作上不应存在困难。另一方面，灌注装置的安装可能稍具挑战性，但提前练习会有帮助。对于小型非木质样本，可采用真空法进行处理。对于较大且木质化的样本（包括寄主茎或根的一段），应采用浸润法。若使用真空法，先将样本放入含有对比溶液的小瓶中，然后将小瓶置于连接真空泵的真空室或干燥器内。打开小瓶盖子，关闭真空室或干燥器。检查真空室或干燥器上是否有裂纹。打开真空室或干燥器的排气阀，以排出内部空气。打开泵，等待压力达到约20英寸汞柱，或10 psi。关闭腔室或干燥器的排气阀，以防止空气重新进入。然后迅速关闭泵。将样品置于真空条件下至少两小时。若采用灌注法，应根据样品大小选择供液罐。对于小型样品，可使用无针头的50毫升注射器作为储液罐。将一段透明塑料管的一端连接到供液罐。然后将另一端连接至一个两通或三通阀。将第二段管路连接至该阀的另一个出口。将供液罐固定在较高位置，同时不要拆卸前一步骤中已组装好的装置。关闭三通或两通阀门，防止液体流出管路系统，然后将造影溶液倒入供液罐中。确保管路系统中无较大气泡，再次关闭阀门，保持装置原位不动。为准备对比溶液的灌注，将样品保持浸没在液体中，并切掉寄主茎或根近端的尖端。小心打开阀门，使对比溶液缓慢流动，并充满连接到储液罐的塑料管路，同时将系统开口端保持在略高的位置，以防止对比溶液溢出。将样品中寄主茎或根的近端连接至管路系统的开口端。让溶液灌注样品至少两小时，或直至溶液在容器内积聚。关闭阀门，并小心地将样品从装置上拆下。将样品浸入水中清洗两分钟。将样品置于室温下的纸巾上，使多余的水分蒸发 2 到 5 分钟，注意避免样品完全干燥。用石蜡膜包裹样品，并避免将膜直接折叠在样品上方。微计算机断层扫描（Micro-CT）可用于以非破坏性、三维的方式深入理解寄生植物复杂结构及其与寄主的相互作用。此处描述的方案适用于不同的显微CT系统。然而，设置和参数取决于具体系统和样本。三维X射线显微镜图像在分析寄生虫与宿主界面处的组织结构和拓扑特征方面，效果与在光学显微镜下观察的解剖切片相当。根据由于对对比溶液吸收程度不同而产生的亮白色与深灰色的色差，可以观察到寄生吸器维管核心周围大量存在的薄壁组织。在横切面上，维管核心清晰可见，由薄壁组织分隔成两条维管束。内寄生植物最小槲寄生（Viscum minimum）在肉质宿主植物体内生长时，其薄壁组织细胞显示出以淀粉形式储存碳水化合物的特征。碘吸收的差异使得能够检测到内寄生植物在寄主体内形成的复杂皮层束网络。对美洲菟丝子（Cuscuta Americana）和马氏独脚金（Struthantus marcianus）所获得的结果分别有助于说明显微断层扫描技术在小样本和大样本中的应用便利性。对舌菌形西贝柳姆（Sibelium fungiform）的虚拟连续切片显示，寄主根部的导管分叉进入寄生块茎，且两种植物之间的木质部连续性是通过穿孔板实现的导管与导管连接而形成的。此处描述的方法可与其他技术（如虚拟分割）相结合，为深入了解寄生植物与其寄主之间连接的三维结构提供新的视角。该技术为分析寄生植物生物学的多个方面奠定了基础，包括内寄生物的发育过程以及超寄生连接的功能特性。

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