Name: 从 酿酒酵母 细胞中纯化的双向驱动蛋白-5 Cin8的单分子和簇的运动性 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: 了解酿酒酵母双向驱动蛋白Cin8的单分子运动机制。本研究通过纯化GFP标记的全长Cin8并进行单分子运动实验，分析其聚集状态对运动速度和方向性的影响，为深入理解马达蛋白动态提供重要方法。

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本研究部分得到了以色列科学基金会资助（ISF-386/18）和以色列二国科学基金会资助（BSF-2019008）的支持，上述资助授予 L.G.。

<ol><li>Singh, S. K., Pandey, H., Al-Bassam, J., Gheber, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bidirectional+motility+of+kinesin-5+motor+proteins%3A+structural+determinants%2C+cumulative+functions+and+physiological+roles%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Bidirectional motility of kinesin-5 motor proteins: structural determinants, cumulative functions and physiological roles.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (10), 1757-1771 (2018).</li>
<li>Hoyt, M. A., He, L., Totis, L., Saunders, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+function+of+Saccharomyces+cerevisiae+kinesin-related+CIN8+and+KIP1+is+suppressed+by+KAR3+motor+domain+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Loss of function of Saccharomyces cerevisiae kinesin-related CIN8 and KIP1 is suppressed by KAR3 motor domain mutations.</a> Genetics. 135 (1), 35-44 (1993).</li>
<li>Saunders, W. S., Hoyt, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinesin-related+proteins+required+for+structural+integrity+of+the+mitotic+spindle%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Kinesin-related proteins required for structural integrity of the mitotic spindle.</a> Cell. 70 (3), 451-458 (1992).</li>
<li>Hoyt, M. A., He, L., Loo, K. K., Saunders, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+Saccharomyces+cerevisiae+kinesin-related+gene+products+required+for+mitotic+spindle+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Two Saccharomyces cerevisiae kinesin-related gene products required for mitotic spindle assembly.</a> Journal of Cell Biology. 118 (1), 109-120 (1992).</li>
<li>Gerson-Gurwitz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mid-anaphase+arrest+in+S.+cerevisiae+cells+eliminated+for+the+function+of+Cin8+and+dynein%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Mid-anaphase arrest in S. cerevisiae cells eliminated for the function of Cin8 and dynein.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 66 (2), 301-313 (2009).</li>
<li>Fridman, V., Gerson-Gurwitz, A., Movshovich, N., Kupiec, M., Gheber, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Midzone+organization+restricts+interpolar+microtubule+plus-end+dynamics+during+spindle+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Midzone organization restricts interpolar microtubule plus-end dynamics during spindle elongation.</a> EMBO Reports. 10 (4), 387-393 (2009).</li>
<li>Movshovich, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slk19-dependent+mid-anaphase+pause+in+kinesin-5-mutated+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Slk19-dependent mid-anaphase pause in kinesin-5-mutated cells.</a> Journal of Cell Science. 121 (15), 2529-2539 (2008).</li>
<li>Gerson-Gurwitz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directionality+of+individual+kinesin-5+Cin8+motors+is+modulated+by+loop+8%2C+ionic+strength+and+microtubule+geometry%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+Journal%22%5BJournal%5D)">Directionality of individual kinesin-5 Cin8 motors is modulated by loop 8, ionic strength and microtubule geometry.</a> Embo Journal. 30 (24), 4942-4954 (2011).</li>
<li>Roostalu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directional+switching+of+the+kinesin+Cin8+through+motor+coupling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Directional switching of the kinesin Cin8 through motor coupling.</a> Science. 332 (6025), 94-99 (2011).</li>
<li>Shapira, O., Goldstein, A., Al-Bassam, J., Gheber, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+potential+physiological+role+for+bi-directional+motility+and+motor+clustering+of+mitotic+kinesin-5+Cin8+in+yeast+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">A potential physiological role for bi-directional motility and motor clustering of mitotic kinesin-5 Cin8 in yeast mitosis.</a> Journal of Cell Science. 130 (4), 725-734 (2017).</li>
<li>Goldstein-Levitin, A., Pandey, H., Allhuzaeel, K., Kass, I., Gheber, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+functions+and+motile+properties+of+bi-directional+kinesin-5+Cin8+are+regulated+by+neck+linker+docking%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Intracellular functions and motile properties of bi-directional kinesin-5 Cin8 are regulated by neck linker docking.</a> eLife. 10, 71036(2021).</li>
<li>Pandey, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drag-induced+directionality+switching+of+kinesin-5+Cin8+revealed+by+cluster-motility+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Drag-induced directionality switching of kinesin-5 Cin8 revealed by cluster-motility analysis.</a> Science Advances. 7 (6), 1687(2021).</li>
<li>Pandey, H., Popov, M., Goldstein-Levitin, A., Gheber, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+by+which+kinesin-5+motors+perform+their+multiple+intracellular+functions%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Mechanisms by which kinesin-5 motors perform their multiple intracellular functions.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6420(2021).</li>
<li>Fridman, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinesin-5+Kip1+is+a+bi-directional+motor+that+stabilizes+microtubules+and+tracks+their+plus-ends+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Kinesin-5 Kip1 is a bi-directional motor that stabilizes microtubules and tracks their plus-ends in vivo.</a> Journal of Cell Science. 126, 4147-4159 (2013).</li>
<li>Edamatsu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bidirectional+motility+of+the+fission+yeast+kinesin-5%2C+Cut7%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Bidirectional motility of the fission yeast kinesin-5, Cut7.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 446 (1), 231-234 (2014).</li>
<li>Popchock, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitotic+kinesin-14+KlpA+contains+a+context-dependent+directionality+switch%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The mitotic kinesin-14 KlpA contains a context-dependent directionality switch.</a> Nature Communications. 8, 13999(2017).</li>
<li>Bodrug, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kinesin-5+tail+domain+directly+modulates+the+mechanochemical+cycle+of+the+motor+domain+for+anti-parallel+microtubule+sliding%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">The kinesin-5 tail domain directly modulates the mechanochemical cycle of the motor domain for anti-parallel microtubule sliding.</a> eLife. 9 (9), 51131(2020).</li>
<li>Gheber, L., Kuo, S. C., Hoyt, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motile+properties+of+the+kinesin-related+Cin8p+spindle+motor+extracted+from+Saccharomyces+cerevisiae+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Motile properties of the kinesin-related Cin8p spindle motor extracted from Saccharomyces cerevisiae cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (14), 9564-9572 (1999).</li>
<li>Pandey, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flexible+microtubule+anchoring+modulates+the+bi-directional+motility+of+the+kinesin-5+Cin8%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Flexible microtubule anchoring modulates the bi-directional motility of the kinesin-5 Cin8.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (16), 6051-6068 (2021).</li>
<li>Shapira, O., Gheber, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motile+properties+of+the+bi-directional+kinesin-5+Cin8+are+affected+by+phosphorylation+in+its+motor+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Motile properties of the bi-directional kinesin-5 Cin8 are affected by phosphorylation in its motor domain.</a> Scientific Reports. 6, 25597(2016).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Britto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schizosaccharomyces+pombe+kinesin-5+switches+direction+using+a+steric+blocking+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Schizosaccharomyces pombe kinesin-5 switches direction using a steric blocking mechanism.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (47), 7483-7489 (2016).</li>
<li>Kapitein, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+cross-linking+triggers+the+directional+motility+of+kinesin-5%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Microtubule cross-linking triggers the directional motility of kinesin-5.</a> Journal of Cell Biology. 182 (3), 421-428 (2008).</li>
<li>Furuta, K., Edamatsu, M., Maeda, Y., Toyoshima, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+and+directed+movement+in+vitro+motile+properties+of+fission+yeast+kinesin-14+Pkl1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Diffusion and directed movement in vitro motile properties of fission yeast kinesin-14 Pkl1.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (52), 36465-36473 (2008).</li>
<li>Katrukha, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+cytoskeletal+modulation+of+passive+and+active+intracellular+dynamics+using+nanobody-functionalized+quantum+dots%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Probing cytoskeletal modulation of passive and active intracellular dynamics using nanobody-functionalized quantum dots.</a> Nature Communications. 8, 14772(2017).</li>
<li>Tinevez, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TrackMate%3A+An+open+and+extensible+platform+for+single-particle+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking.</a> Methods. 115, 80-90 (2017).</li>
<li>Jakobs, M. A. H., Dimitracopoulos, A., Franze, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KymoBulter%2C+a+deep+learning+software+for+automated+kymograph+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">KymoBulter, a deep learning software for automated kymograph analysis.</a> eLife. 8, 42288(2019).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

本研究介绍了利用双向驱动蛋白-5 Cin8 进行单分子运动实验的方案及运动分析方法。全长 Cin818（包含C端天然核定位信号（NLS））已从天然宿主 S. cerevisiae 中纯化获得。由于 Cin8 是一种核内马达蛋白，研磨液氮中的 S. cerevisiae 细胞被发现是最有效的细胞裂解方法。裂解后，通过结合金属亲和层析和尺寸排阻层析，可获得高纯度的 Cin8，这对于单分子运动实验至关重要。先前已有报道指出，Cin8 在粗提物与纯化样品中的运动特性存在差异8。此外，也有研究报道，微管上马达蛋白和非马达蛋白的拥挤效应会影响双向驱动蛋白-5 Cut7 的运动方向性22。因此，为获得可靠的运动分析结果并得出有关野生型与突变型马达蛋白行为的准确结论，必须使用高纯度的马达蛋白。本文所述技术可经适当的缓冲液调整后，便捷地应用于从酵母中纯化其他核蛋白。
本文介绍了一种利用GFP标记的Cin8进行的高稳健性和高...

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Erratum: Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells

真核细胞内的大量运动过程由分子马达蛋白的功能介导。这些马达蛋白沿着细胞骨架纤维（包括肌动蛋白丝和微管（MTs））移动，并将ATP水解的化学能转化为细胞内生物运动所需的动能和机械力。S. cerevisiae 中基于微管的Cin8是一种双极性同源四聚体kinesin-5马达蛋白，能够交联纺锤体微管并使其相互滑动1。Cin8在有丝分裂过程中发挥着关键作用，参与纺锤体组装2,3,4以及后期（anaphase）的纺锤体延长过程5,6,7。先前研究表明，Cin8是一种双向运动的马达蛋白，可在不同实验条件下切换运动方向。例如，在高离子强度条件下，单个Cin8马达向微管的负端移动；而在多马达聚簇状态、多马达微管滑动实验以及反向平行微管之间，Cin8马达主要向微管的正端移动8,9,10,11,12。这些发现令人高度意外，原因有三：第一，Cin8的催化马达结构域位于氨基末端，而此类马达此前被认为仅朝向微管正端运动，但Cin8在单分子水平上却被证明可朝向微管负端运动；第二，kinesin马达此前被认为仅具有单向运动特性，即要么朝向正端，要么朝向负端，而Cin8则表现出依赖实验条件的双向运动特性；第三，由于有丝分裂纺锤体中微管的排列方向，kinesin-5马达在纺锤体组装和后期B阶段推动纺锤极分离的经典功能，只能通过其在所交联微管上朝向正端的运动来解释1,13。在首次报道Cin8的双向性之后，又有若干其他kinesin马达被证实具有双向运动能力14,15,16，表明kinesin马达的双向运动可能比早先认为的更为普遍。
先前已有报道称，在细胞中，Cin8 也以双向方式移动8，这支持了某些驱动蛋白-5（kinesin-5）马达的双向运动性对其细胞内功能具有重要意义的观点。此外，由于目前已报道的三种具有双向运动性的驱动蛋白-5均来自真菌细胞，近期有研究提出，这种双向性在真菌细胞中可能具有特定功能10。根据该模型，在真菌细胞的闭合式有丝分裂过程中，核膜在有丝分裂期间不会解体，驱动蛋白-5马达可提供初始作用力，使纺锤体两极在纺锤体组装之前分离。为完成这一任务，在纺锤体两极分离之前，驱动蛋白-5马达通过在单个核微管（MTs）上向微管负端移动，定位于纺锤体两极附近。到达该位置后，驱动蛋白-5马达发生聚集，转换运动方向，捕获并交联来自相邻纺锤体极的微管。随后，驱动蛋白-5马达通过在其交联的微管上向微管正端移动，提供两极最初的分离动力。根据该模型，真菌驱动蛋白-5马达在纺锤体组装中发挥功能需要两个过程：一是在单个微管上向负端的运动，二是在交联微管上通过反向平行滑动实现向正端的运动1,13。
本方法的总体目标是获得高纯度的真菌GFP标记的驱动蛋白-5 Cin8，并进行单分子运动分析（图1），同时分别研究Cin8单分子及其聚集体的运动行为。区分单分子与聚集体至关重要，因为已有研究表明，Cin8在微管（MTs）上形成聚集体是影响其运动方向性的因素之一10,12。其他运动分析方法，如微管表面滑动和微管滑移实验，无法提供关于单个马达蛋白活性的信息17,18。本文所描述的稳健的单分子运动实验及分析方法已成功应用于表征驱动蛋白-5马达Cin8和Kip1的多个功能特性10,11,12,14,19,20。
本文详细介绍了Cin8蛋白的过表达与纯化、微管（MTs）的聚合以及单分子运动性实验的完整方案。此外，还描述了用于区分Cin8单分子与分子簇，并通过均位移（MD）和均方位移（MSD）分析来确定单个马达蛋白及分子簇运动速度的分析方法。本方案旨在帮助研究人员直观了解实验各步骤，并为该类实验的故障排查提供指导。
<img alt="微管-马达蛋白相互作用示意图；Cin8 在盖玻片上罗丹明标记的微管上的运动。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63425/63425fig01v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：单分子运动性检测的示意图。 生物素化的荧光微管通过与表面固定的生物素化BSA结合的亲和素附着在玻璃表面。绿色箭头表示在高离子强度条件下单个Cin8分子的运动方向。+/- 表示微管的极性。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63425/63425fig01largev2.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>腺嘌呤</td><td>用于培养基</td><td>DOC0230</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma</td><td>A7699</td><td></td></tr><tr><td>生物素标记的BSA</td><td>Sigma</td><td>A8549</td><td></td></tr><tr><td>酪蛋白</td><td>Sigma</td><td>C7078</td><td></td></tr><tr><td>过氧化氢酶（C40）</td><td>Sigma</td><td>C40</td><td></td></tr><tr><td>肌酸激酶</td><td>Sigma</td><td>C3755</td><td></td></tr><tr><td>二硫苏糖醇（DTT）</td><td>Sigma</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>GFP荧光滤光片组</td><td>色度</td><td>49002：ET-EGFP（FITC/Cy2）</td><td></td></tr><tr><td>罗丹明荧光滤光片组</td><td>色度</td><td>49004：ET-CY3/TRITC</td><td></td></tr><tr><td>荧光倒置显微镜</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert 200M</td><td></td></tr><tr><td>半乳糖</td><td>Tivan Biotech</td><td>GAL02</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖氧化酶</td><td>Sigma</td><td>G7141</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>甘氨酰甘氨酸</td><td>默克</td><td>G0674</td><td></td></tr><tr><td>GMPCPP</td><td>Jana Bioscience</td><td>Nu-405L</td><td></td></tr><tr><td>GTB</td><td>细胞骨架</td><td>BST01-010</td><td></td></tr><tr><td>GTP</td><td>Sigma</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>组氨酸</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>H0710.0100</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ-FIJI 软件</td><td>https://imagej.net/plugins/trackmate/</td><td>版本 2.1.0/1.53c；适用于 Windows 10 的 Java 1.8.0_172 [64 位]</td><td></td></tr><tr><td>咪唑</td><td>Sigma</td><td>I0125</td><td></td></tr><tr><td>InstantBlue 考马斯亮蓝蛋白质染色液</td><td>Abcam</td><td>ab119211</td><td></td></tr><tr><td>透镜</td><td>Zeiss</td><td>100x/1.4 油镜 DIC 物镜</td><td></td></tr><tr><td>赖氨酸</td><td>用于培养基</td><td>DOC0161</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>甲硫氨酸</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>M0715.0100</td><td></td></tr><tr><td>Neo</td><td>Andor Technologies</td><td>sCMOS相机</td><td></td></tr><tr><td>NeutraAvidin</td><td>生命</td><td>A2666</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA 琼脂糖</td><td>Invitrogen</td><td>R901-15</td><td></td></tr><tr><td>磷酸肌酸</td><td>Sigma</td><td>P1937</td><td></td></tr><tr><td>管道</td><td>Sigma</td><td>P1851</td><td></td></tr><tr><td>泊洛沙姆 F-127（Pluronic acid F-127）</td><td>Sigma</td><td>P2443</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>棉子糖</td><td>Tivan Biotech</td><td>RAF01</td><td></td></tr><tr><td>尺寸排阻色谱仪器</td><td>GE Healthcare</td><td>AKTA Pure</td><td></td></tr><tr><td>分光光度计</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NanoDrop</td><td></td></tr><tr><td>Superose-6 10/300 GL</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5172-01</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Roshe</td><td>10708976001</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>色氨酸</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>T0720.0100</td><td></td></tr><tr><td>微管蛋白</td><td>细胞骨架</td><td>T240</td><td></td></tr><tr><td>微管蛋白，生物素化</td><td>细胞骨架</td><td>T333P</td><td></td></tr><tr><td>微管蛋白，TRITC罗丹明</td><td>细胞骨架</td><td>TL530M</td><td></td></tr><tr><td>尿嘧啶</td><td>Sigma</td><td>U0750-100G</td><td></td></tr><tr><td>酵母氮源基础</td><td>培养基</td><td>CYN0401S</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-GFP 抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC8036</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-巯基乙醇</td><td>Sigma</td><td>M3148</td><td></td></tr></tbody></table>

来自 s. cerevisiae 细胞的双向驱动蛋白-5 cin8 单分子及分子簇的运动特性

Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-Directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells

有丝分裂双极驱动蛋白-5马达在纺锤体动力学中发挥着关键作用。这类马达蛋白具有同源四聚体结构，其活性复合物的两端各含有一对催化性马达结构域。这种独特的结构使驱动蛋白-5能够交联并推动反向平行的纺锤体微管（MTs）彼此滑动，从而产生将纺锤体两极向外推开的作用力。过去认为驱动蛋白-5仅朝微管正端移动，但近期研究表明，多种真菌来源的驱动蛋白-5在单分子水平上表现出朝微管负端移动的特性，并可在不同实验条件下发生运动方向的转换。 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） 驱动蛋白-5 Cin8 就是一种具有双向运动特性的马达蛋白：在高离子强度条件下，Cin8 单分子沿微管（MTs）的负端方向运动。研究还表明，Cin8 会在微管的负端区域形成可运动的簇状结构，这种成簇现象使 Cin8 能够转换运动方向，实现缓慢的、朝向正端的运动。本文提供了使用 GFP 标记的驱动蛋白-5 Cin8 进行实验的完整操作流程，涵盖从蛋白在 S. cerevisiae 细胞及其纯化至 体外 单分子运动性分析。本文介绍了一种新开发的方法，可根据荧光强度区分Cin8单分子与Cin8聚集体。该方法可分别分析Cin8单分子和聚集体的运动性，从而实现对Cin8运动性与其聚集体大小之间依赖关系的表征。

本实验旨在研究不同簇大小的双向运动蛋白Cin8在单根微管（MT）上的运动特性。从图5A中的时空图也可明显看出Cin8-GFP的代表性运动行为，其中显示了马达蛋白随时间变化的空间位置。
为分析Cin8-GFP的运动特性，首先为每个与微管结合的运动性Cin8-GFP颗粒分配簇大小（步骤4.3），然后追踪所检测的Cin8颗粒位置随时间的变化（步骤4.4）。针对每个簇大小类别， &gt;从记录中提取了40条单独的Cin8-GFP运动轨迹（图5B）。根据追踪分析获得的坐标，对每个簇大小群体分别进行MD和MSD分析。速度值通过MD的线性拟合获得，如文中所示 图5C. 研究发现，单个Cin8-GFP分子以高速度向微管负端进行单向运动，而Cin8聚集体则表现出明显较低的运动速度，并更倾向于双向运动（图5B, C).
<p...

双向有丝分裂驱动蛋白-5 Cin8 在运动过程中会聚集形成不断分裂和融合的簇状结构。聚集形成簇状结构还会改变 Cin8 的运动速度和方向性。本文介绍了一种利用纯化的 Cin8-GFP 进行运动性检测的实验方案，以及对 Cin8 单分子和簇状结构运动特性的分析方法。

来自 S. cerevisiae 细胞的双向驱动蛋白-5 Cin8 单分子及分子簇的运动特性

有丝分裂双极驱动蛋白-5马达在纺锤体动力学中发挥着关键作用。这些马达具有同源四聚体结构，包含两对……

酿酒酵母中的驱动蛋白-5 Cin8 是一种双向运动的马达蛋白。Cin8 作为单个分子时沿微管的负端方向运动，并在多种不同的实验条件下发生运动方向的改变。我们研究的总体目标是通过研究调控 Cin8 双向运动的因素和结构元件，来阐明其双向运动的分子机制。本方案全面阐述了在酵母细胞中过表达的GFP标记全长Cin8蛋白的纯化方法、单分子运动活性检测及其后续对Cin8单分子和分子簇运动特性的分析。这种分离至关重要，因为Cin8在微管上形成簇状聚集会对其运动方向性产生影响。该技术可轻松适用于从酵母中纯化其他核蛋白。此外，该方法还可用于根据荧光强度将任何荧光颗粒按粒径分组。演示该实验流程的人员包括实验室主管 Mary Popov 博士、博士后研究员 Alina Goldstein-Levitin 博士和 Nurit Siegler 博士；研究生 Tatiana Zvagelsky、Mayan Sadan 和 Shira Hershfinkel；以及来自我们实验室的本科生 Neta Yanir、Yahel Abraham、Roy Avraham 和 Meital Haberman。首先，在 1 升添加了 2% 棉子糖的酵母选择性培养基中，于 28°C 下将含有 Cin8-GFP-6His 过表达质粒的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）细胞培养至对数生长阶段。然后通过加入2%半乳糖诱导Cin8-GFP-6His过表达，并通过测量600纳米处的吸光度监测酵母培养物的生长。加入半乳糖5小时后，通过离心收集细胞。用裂解缓冲液重悬细胞，并在液氮中冷冻。接下来，使用预冷的研钵和研杵在液氮中研磨冻存的细胞。研磨过程中需持续添加液氮，以确保提取物始终处于冷冻状态。在相差或微分干涉对比显微镜下观察细胞裂解情况。然后将破碎的细胞解冻，并进行离心。将上清液上样至装有两毫升镍-NTA（Nickel-NTA）的重力流层析柱中，层析柱预先用裂解缓冲液平衡。让上清液流经层析柱。用五倍柱体积的裂解缓冲液洗涤层析柱，随后用五倍柱体积的含有25毫摩尔咪唑的裂解缓冲液洗涤。然后用洗脱缓冲液洗脱Cin8-GFP-6His。通过SDS-PAGE分离洗脱组分，随后进行考马斯亮蓝染色，并使用抗GFP抗体进行蛋白质印迹分析。合并含有 Cin8-GFP-6His 的组分后，以 0.5 毫升/分钟的流速和 1.5 兆帕的柱压限制，通过尺寸排阻色谱进行纯化。同时监测 280 纳米处的吸光度。收集对应于 Cin8-GFP 四聚体的组分，并通过 SDS-PAGE 和 Western 印迹分析这些组分。然后分装所选组分，速冻，并在负80摄氏度下保存备用。为聚合并稳定生物素和罗丹明标记的微管，将反应组分加入1.5毫升离心管中，在37摄氏度孵育1小时。随后加入80 µL预热的通用微管蛋白缓冲液，轻轻混匀，然后离心。弃去上清液，用50 µL预热的通用微管蛋白缓冲液轻轻吹打沉淀，使其重悬。随后将悬液置于28或37°C保存。使用647纳米罗丹明通道，通过荧光显微镜观察微管。接下来，从胶带条上移除保护纸，并将硅化盖玻片放置在胶带条上，形成三个体积为10微升的流动池。然后通过依次添加指定试剂，对盖玻片进行亲和素（avidin）包被。将盖玻片孵育3至5分钟，随后用80微升通用微管蛋白缓冲液洗涤。接下来，将 20 微升生物素标记的微管插入流动池中，使其与包被了 b-BSA/亲和素的盖玻片结合。将载玻片倒置放入黑暗的湿盒中，在室温下孵育五分钟。随后用 200 微升通用微管蛋白缓冲液洗涤载玻片。接下来，向流动池中加入30微升运动反应混合液，随后加入用20微升运动反应混合液稀释的Cin8-GFP分子马达，并立即开始对分子马达沿微管的运动进行成像。进行分子马达运动成像时，先在显微镜物镜上滴加一滴浸油，然后将流动池放置在荧光显微镜载物台上，使盖玻片朝向物镜。打开罗丹明通道，对焦到附着在盖玻片表面的微管上。然后，使用 ImageJ Micro-Manager 软件，以 20 毫秒曝光时间采集图像。接着，打开 GFP 通道，以 1 秒间隔和 800 毫秒曝光时间采集 90 张延时图像。在 ImageJ Fiji 软件中，打开延时视频以及对应的微管视野图像。通过选择“分析”，然后选择“工具”和“同步窗口”，来同步这两个窗口。要生成线扫图，使用“分段线”选项高亮一条微管。然后，在“分析”中选择“多线扫图”标签。为了确定 Cin8-GFP 分子的簇大小，依次点击 Process（处理），然后选择 Subtract Background（减去背景），进行背景扣除并校正照明不均。将滚动球半径设置为 100 像素，并勾选滑动抛物面（Sliding paraboloid）选项。随后使用 ImageJ Fiji 软件中的 TrackMate 插件追踪特定的非运动性 Cin8-GFP 分子马达。选择插件，然后依次选择 Tracking、TrackMate、LoG 检测器和 Simple LAP 跟踪器，以跟踪 Cin8-GFP 驱动蛋白在半径为四个像素的圆形区域内随时间变化的平均荧光强度。对不同的 Cin8-GFP 驱动蛋白重复该过程后，绘制荧光强度随时间变化的曲线。接下来，为了追踪 Cin8-GFP 分子沿微管轨道的运动，使用矩形工具在记录的帧时间序列中高亮选定待分析的微管区域，然后点击 Image，再选择 Crop 进行裁剪。选择一个用于分析的荧光 Cin8-GFP 颗粒。使用点工具和“测量”选项，记录该颗粒在时间序列每帧中的坐标。同样地，记录时间序列中其他荧光颗粒的坐标。然后，如前所述，为所有被检测的 Cin8-GFP 颗粒在首次出现的第一帧中分配簇大小。接着，利用指定的公式和已确定的 Cin8-GFP 运动坐标，计算每个时间点 Cin8-GFP 相对于初始坐标的位移。根据这些位移值，计算特定 Cin8-GFP 颗粒在所有可能时间间隔内的位移。对所有被检测的 Cin8-GFP 颗粒重复该步骤。最后，绘制所有被检测 Cin8-GFP 颗粒的平均位移随时间间隔的变化关系图，并对其进行线性拟合。该拟合的斜率代表可运动 Cin8-GFP 颗粒的平均速度。不同簇大小的双向运动蛋白Cin8在单根微管上的运动特性如图所示。对于每个簇大小类别，从记录中提取了超过40条单个Cin8-GFP的运动轨迹。将单个分子及Cin8运动蛋白簇的平均位移对时间间隔作图表明，单个Cin8-GFP分子以高速度向微管负端进行单向运动。相比之下，Cin8 簇表现出较低的速度和较高的双向运动性。进行此操作时，必须使用高纯度的马达蛋白，以避免任何可能影响马达蛋白成簇的污染。在分析马达荧光强度时，重要的是在马达首次出现的第一帧对其进行检测，以避免光漂白的影响。在研究双向运动分子马达的运动性时，分别分析单个分子和分子簇至关重要，因为马达的成簇现象是影响其运动方向的关键因素之一。

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从 酿酒酵母 细胞中纯化的双向驱动蛋白-5 Cin8的单分子和簇的运动性

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秀丽隐杆线虫 (秀丽隐杆线虫是一种研究轴突和细胞内运输的良好模型。在此，我描述了一种实验方案 体内 轴突内运输与鞭毛内运输的记录与分析 秀丽隐杆线虫.

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组装由可逆附着驱动蛋白驱动的分子穿梭器

本实验方案的目的是在DNA折纸纳米结构上组装分子马达的集合体，并利用全内反射荧光显微镜观察该集合体的运动行为。...

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此处，我们介绍一种微管束的重建方案 体外...

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本研究详细描述了利用Sf9-杆状病毒表达系统纯化驱动蛋白-3家族成员KIF1A(1-393LZ)的方法。体外对这些纯化的马达蛋白进行单分子及多马达滑动分析，结果显示其运动特性...

单分子分析Sf9纯化的超进程性驱动蛋白-3家族马达

了解酿酒酵母双向驱动蛋白Cin8的单分子运动机制。本研究通过纯化GFP标记的全长Cin8并进行单分子运动实验，分析其聚集状态对运动速度和方向性的影响，为深入理解马达蛋白动态提供重要方法。

来自 S. cerevisiae 细胞的双向驱动蛋白-5 Cin8 单分子及分子簇的运动特性

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