来自 S. cerevisiae 细胞的双向驱动蛋白-5 Cin8 单分子及分子簇的运动特性

酿酒酵母中的驱动蛋白-5 Cin8 是一种双向运动的马达蛋白。Cin8 作为单个分子时沿微管的负端方向运动，并在多种不同的实验条件下发生运动方向的改变。我们研究的总体目标是通过研究调控 Cin8 双向运动的因素和结构元件，来阐明其双向运动的分子机制。

本方案全面阐述了在酵母细胞中过表达的GFP标记全长Cin8蛋白的纯化方法、单分子运动活性检测及其后续对Cin8单分子和分子簇运动特性的分析。这种分离至关重要，因为Cin8在微管上形成簇状聚集会对其运动方向性产生影响。该技术可轻松适用于从酵母中纯化其他核蛋白。

此外，该方法还可用于根据荧光强度将任何荧光颗粒按粒径分组。演示该实验流程的人员包括实验室主管 Mary Popov 博士、博士后研究员 Alina Goldstein-Levitin 博士和 Nurit Siegler 博士；研究生 Tatiana Zvagelsky、Mayan Sadan 和 Shira Hershfinkel；以及来自我们实验室的本科生 Neta Yanir、Yahel Abraham、Roy Avraham 和 Meital Haberman。首先，在 1 升添加了 2% 棉子糖的酵母选择性培养基中，于 28°C 下将含有 Cin8-GFP-6His 过表达质粒的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）细胞培养至对数生长阶段。

然后通过加入2%半乳糖诱导Cin8-GFP-6His过表达，并通过测量600纳米处的吸光度监测酵母培养物的生长。加入半乳糖5小时后，通过离心收集细胞。用裂解缓冲液重悬细胞，并在液氮中冷冻。

接下来，使用预冷的研钵和研杵在液氮中研磨冻存的细胞。研磨过程中需持续添加液氮，以确保提取物始终处于冷冻状态。在相差或微分干涉对比显微镜下观察细胞裂解情况。

然后将破碎的细胞解冻，并进行离心。将上清液上样至装有两毫升镍-NTA（Nickel-NTA）的重力流层析柱中，层析柱预先用裂解缓冲液平衡。让上清液流经层析柱。

用五倍柱体积的裂解缓冲液洗涤层析柱，随后用五倍柱体积的含有25毫摩尔咪唑的裂解缓冲液洗涤。然后用洗脱缓冲液洗脱Cin8-GFP-6His。通过SDS-PAGE分离洗脱组分，随后进行考马斯亮蓝染色，并使用抗GFP抗体进行蛋白质印迹分析。

合并含有 Cin8-GFP-6His 的组分后，以 0.5 毫升/分钟的流速和 1.5 兆帕的柱压限制，通过尺寸排阻色谱进行纯化。同时监测 280 纳米处的吸光度。收集对应于 Cin8-GFP 四聚体的组分，并通过 SDS-PAGE 和 Western 印迹分析这些组分。

然后分装所选组分，速冻，并在负80摄氏度下保存备用。为聚合并稳定生物素和罗丹明标记的微管，将反应组分加入1.5毫升离心管中，在37摄氏度孵育1小时。随后加入80 µL预热的通用微管蛋白缓冲液，轻轻混匀，然后离心。

弃去上清液，用50 µL预热的通用微管蛋白缓冲液轻轻吹打沉淀，使其重悬。随后将悬液置于28或37°C保存。使用647纳米罗丹明通道，通过荧光显微镜观察微管。

接下来，从胶带条上移除保护纸，并将硅化盖玻片放置在胶带条上，形成三个体积为10微升的流动池。然后通过依次添加指定试剂，对盖玻片进行亲和素（avidin）包被。将盖玻片孵育3至5分钟，随后用80微升通用微管蛋白缓冲液洗涤。

接下来，将 20 微升生物素标记的微管插入流动池中，使其与包被了 b-BSA/亲和素的盖玻片结合。将载玻片倒置放入黑暗的湿盒中，在室温下孵育五分钟。随后用 200 微升通用微管蛋白缓冲液洗涤载玻片。

接下来，向流动池中加入30微升运动反应混合液，随后加入用20微升运动反应混合液稀释的Cin8-GFP分子马达，并立即开始对分子马达沿微管的运动进行成像。进行分子马达运动成像时，先在显微镜物镜上滴加一滴浸油，然后将流动池放置在荧光显微镜载物台上，使盖玻片朝向物镜。打开罗丹明通道，对焦到附着在盖玻片表面的微管上。

然后，使用 ImageJ Micro-Manager 软件，以 20 毫秒曝光时间采集图像。接着，打开 GFP 通道，以 1 秒间隔和 800 毫秒曝光时间采集 90 张延时图像。在 ImageJ Fiji 软件中，打开延时视频以及对应的微管视野图像。

通过选择“分析”，然后选择“工具”和“同步窗口”，来同步这两个窗口。要生成线扫图，使用“分段线”选项高亮一条微管。然后，在“分析”中选择“多线扫图”标签。

为了确定 Cin8-GFP 分子的簇大小，依次点击 Process（处理），然后选择 Subtract Background（减去背景），进行背景扣除并校正照明不均。将滚动球半径设置为 100 像素，并勾选滑动抛物面（Sliding paraboloid）选项。随后使用 ImageJ Fiji 软件中的 TrackMate 插件追踪特定的非运动性 Cin8-GFP 分子马达。

选择插件，然后依次选择 Tracking、TrackMate、LoG 检测器和 Simple LAP 跟踪器，以跟踪 Cin8-GFP 驱动蛋白在半径为四个像素的圆形区域内随时间变化的平均荧光强度。对不同的 Cin8-GFP 驱动蛋白重复该过程后，绘制荧光强度随时间变化的曲线。接下来，为了追踪 Cin8-GFP 分子沿微管轨道的运动，使用矩形工具在记录的帧时间序列中高亮选定待分析的微管区域，然后点击 Image，再选择 Crop 进行裁剪。

选择一个用于分析的荧光 Cin8-GFP 颗粒。使用点工具和“测量”选项，记录该颗粒在时间序列每帧中的坐标。同样地，记录时间序列中其他荧光颗粒的坐标。

然后，如前所述，为所有被检测的 Cin8-GFP 颗粒在首次出现的第一帧中分配簇大小。接着，利用指定的公式和已确定的 Cin8-GFP 运动坐标，计算每个时间点 Cin8-GFP 相对于初始坐标的位移。根据这些位移值，计算特定 Cin8-GFP 颗粒在所有可能时间间隔内的位移。

对所有被检测的 Cin8-GFP 颗粒重复该步骤。最后，绘制所有被检测 Cin8-GFP 颗粒的平均位移随时间间隔的变化关系图，并对其进行线性拟合。该拟合的斜率代表可运动 Cin8-GFP 颗粒的平均速度。

不同簇大小的双向运动蛋白Cin8在单根微管上的运动特性如图所示。对于每个簇大小类别，从记录中提取了超过40条单个Cin8-GFP的运动轨迹。将单个分子及Cin8运动蛋白簇的平均位移对时间间隔作图表明，单个Cin8-GFP分子以高速度向微管负端进行单向运动。

相比之下，Cin8 簇表现出较低的速度和较高的双向运动性。进行此操作时，必须使用高纯度的马达蛋白，以避免任何可能影响马达蛋白成簇的污染。在分析马达荧光强度时，重要的是在马达首次出现的第一帧对其进行检测，以避免光漂白的影响。

在研究双向运动分子马达的运动性时，分别分析单个分子和分子簇至关重要，因为马达的成簇现象是影响其运动方向的关键因素之一。