通过嗅觉挖掘任务评估小鼠的判断偏差

这是首个经过验证可敏感检测小鼠情感状态（即情绪或心境）变化的认知偏差任务。该任务可用于研究任何变量对小鼠情感状态的影响。本实验方案采用动物行为学设计，易于小鼠学习，同时有利于动物福利，因为该任务避免了惩罚或负向强化的使用。

该任务可评估饲养或实验操作对小鼠情感状态的影响，因此在动物福利研究或人类情感障碍建模等不同领域均具有重要价值。假设研究人员已熟练掌握非厌恶性抓取方法，我们的主要建议是在正式训练前先开展预实验，以确定合适的行为测试用气味混合物，即小鼠会将其视为模糊刺激的气味组合。该行为测试是一种基于气味的“趋向性”挖掘任务，小鼠需通过挖掘行为获取高价值或低价值的食物奖励。

实验装置包括一个带有两个臂的矩形区域。其中一个臂始终位于中央，并标记有阳性或阴性辨别性刺激气味，另一个臂则始终无气味。挖掘容器包含一个可进入的隔间和一个不可进入的隔间，两者之间由带孔的塑料屏障分隔。

装置中的两个容器始终分别放置高价值和低价值的食物，但食物是否可获取取决于所选的臂以及试验类型。在正向训练试验中，小鼠可选择探索并挖掘带有气味的臂，该臂中的容器标记有正向辨别性刺激气味，并埋藏有高价值的食物奖励；小鼠也可选择挖掘无气味的臂，该臂以蒸馏水标记，内含低价值的食物奖励。

在负性训练试验中，小鼠可再次在有气味的臂和无气味的臂之间进行选择：有气味的臂现在放置了一个标有负性辨别刺激气味的容器，且其中没有可获取的食物奖励；而无气味的臂则仍标记有蒸馏水，并包含一个低价值的食物奖励。随后，小鼠将接受无强化的正性和负性测试试验，即在这些试验中不提供任何食物奖励。对于已学会该任务的小鼠，将进一步进行一次无强化的模糊试验。在模糊试验中，有气味的臂放置了一个标有正性和负性辨别刺激气味混合物的容器，从而形成模糊气味；而无气味的臂则始终如一地仅标记有蒸馏水。

在这一模糊性试验中，小鼠表现出其判断偏差。实验准备时，使用1毫升注射器或微量移液器，将薄荷香精和香草香精分别加入已标记的离心管中。用蒸馏水将提取物按1:4比例稀释，并通过反复倒置混匀。

每天配制并反复颠倒混匀，以确保混合物新鲜且均匀。对于模糊气味混合物，在薄荷和香草香精稀释后，取等体积的稀释香精加入离心管中，配制成1:1的稀释香精混合物。随后，在强化试验期间，对于阳性辨别刺激气味罐，在不可进入的隔间内放置一块饲料，并将一片香蕉片埋入罐子的可进入区域。

对于负性辨别刺激气味罐，在不可进入的隔间内放置一块饲料和一片香蕉片。然后，在罐中加入三厘米厚的玉米芯垫料。该罐的可进入区域中不提供食物奖励。

对于无气味的容器，在不可触及的隔间中放入一片香蕉片，并在容器的可触及区域掩埋一片饲料。在所有无强化的试验测试中，将一片饲料和一片香蕉片放入不可触及的隔间中。然后，在容器中填入三厘米厚的玉米芯垫料。

在此容器的可进入区域中将不提供食物奖励。填充容器后，使用注射器或微量移液器吸取100 µL相应的气味混合物或蒸馏水，并以环形方式直接注入玉米芯顶部。接下来，为准备气味释放装置，在组织学包埋盒底部放置一片棉垫。

然后，使用一个1毫升的注射器或微量移液器吸取100 µL适当的气味混合物或蒸馏水，并将其注入棉片上。用组织盒的盖子盖住盒体，以封闭带气味的棉片，制成一个气味释放装置。将挖掘用的容器放置在迷宫臂的末端，而将气味释放装置放置在每条臂的起始端。

在开始实验前，立即将可拆卸门插入盒体隔间槽中，以阻断进入迷宫臂的通道，形成起始区。所有训练和测试阶段均需在小鼠的黑暗活跃期、红光照明条件下进行。每次训练或测试前，将小鼠在其饲养笼中禁食一小时，方法是移除食槽中的食物。

在挖掘训练的第一天，将食物奖励放置在三厘米厚的玉米芯垫料表面，而不是埋在下方。在接下来的四天中，逐渐将奖励埋入玉米芯垫料更深的位置，直到第五天时将其置于三厘米厚垫料的底部。开始训练试验时，将小鼠从运输笼转移到行为箱的起始区域。

移除起始门，立即放下覆盖在实验区域上的聚碳酸酯盖板，并启动五分钟的试验计时器。记录挖掘潜伏期，即首次观察到挖掘行为的时间；同时记录进食潜伏期，即首次观察到进食行为的时间。对于辨别训练，在第1至第5天每天进行一次正向强化试验，随后进行一次负向强化试验。

在第6至10天，将试验顺序伪随机化，使每只小鼠每天接受两次阳性试验和两次阴性试验。在测试阶段，每天对每只小鼠进行一次阳性或阴性非强化测试试验，直至达到学习标准。每天在视频记录的测试试验前，以随机顺序进行一次阳性强化试验和一次阴性强化试验，并在测试试验后再次进行一次阳性强化试验和一次阴性强化试验。

确保在不同天数中，正向和负向测试试验交替进行。进行录像记录的无强化测试试验时，将小鼠从运输笼转移到迷宫起始区。然后，将摄像机安装在三脚架上，调整位置以确保两条臂末端的两个容器均在视野范围内，并开始录像。

在视频评分期间，务必记录小鼠盲代码和试验类型的提示卡。移除起始门后，立即放下覆盖在实验区域上的有机玻璃盖，并启动两分钟试验计时器。测试结束后，将小鼠放回其运输笼中。

在测试当天对阳性与阴性测试试验的视频进行评分，以评估小鼠是否达到学习标准。务必在同一天完成视频评分，因为达到学习标准的动物将在次日接受模糊性测试。使用事件记录软件或秒表，由对处理分组不知情的研究人员记录每只小鼠在阳性与阴性测试试验第一分钟内对每个花盆的首次挖掘潜伏期及挖掘持续时间。

以首次观察到挖掘行为的时间记录潜伏期，以小鼠挖掘的总时间记录挖掘持续时间。通过比较小鼠在有气味的花盆中正向试验与负向试验的挖掘持续时间，判断小鼠是否能够区分任务。若在测试的第一分钟内，小鼠在正向辨别刺激气味花盆中的挖掘持续时间至少是负向辨别刺激气味花盆中的两倍，则视为达到学习标准。

对于已达到学习标准的小鼠，测试其对模糊气味混合物的反应。以随机顺序进行一次阳性强化试验和一次阴性强化试验。然后，使用模糊气味混合物进行一次录像记录的测试试验。

进行数据分析时，绘制每种试验类型的潜伏期最小二乘均值图，以确认所呈现的模糊线索被解释为中间状态。在评估一分钟和两分钟测试期间的判断偏差时，试验类型与阳性辨别性刺激-气味之间的交互作用具有显著性。这表明，以薄荷作为阳性辨别性刺激的小鼠出乎意料地将模糊气味混合物解释为阳性，而以香草作为阳性辨别性刺激的小鼠则将相同的模糊气味混合物视为中间状态。

这一结果表明，只有以香草作为阳性辨别刺激的小鼠满足将气味混合物视为介于阳性与阴性辨别刺激之间的技术要求。因此，在后续的判断偏差分析中排除了以薄荷作为阳性辨别刺激的小鼠。在以香草作为阳性辨别刺激的小鼠中，饲养环境影响了挖掘潜伏期，与环境丰富化饲养的小鼠相比，常规饲养的小鼠在模糊试验中的挖掘反应更慢，但在阳性或阴性试验中则无此差异。

传统饲养小鼠对模糊线索的这些悲观性解读反映了负性判断偏差，提示存在负性情绪状态。在执行本方案时，需确保满足各项技术标准：小鼠应达到学习标准，表明其能够区分不同线索，并将模糊线索解读为介于两者之间的中间状态。

这一新型判断偏差任务的开发为检验关于小鼠情感状态的重要假设打开了大门，具有动物福利和临床应用的双重意义。