用于荧光成像的植物组织的光学清除

这里描述了一种使植物组织透明同时保持荧光蛋白稳定性的方法。该技术有助于对清除的植物组织进行深度成像，而无需物理切片。

该方法有助于全植物成像，以揭示完整的形态，发育过程和植物 - 微生物相互作用。这种技术的主要优点是我们可以直接观察植物体的内部而不会对其造成损害。由于这种方法适用于广泛的植物物种和组织，因此可以帮助加速植物生物学研究中新现象的发现。

固定是该过程的关键步骤。在清除步骤之前，需要检查固定后荧光蛋白的强度。开始将植物样品浸入微管中的固定溶液中，并确保固定溶液的体积超过样品体积的五倍。

用石膏膜密封微管，并用针头打孔。将微管置于干燥器中，缓慢将真空度调节到约690毫米汞柱，以便样品逐渐出现气泡。抽真空干燥器后关闭真空泵。

小心通风干燥剂，不要打扰样品。再次打开真空泵，并在抽空干燥器后将其关闭。小心打开干燥器，不要将固定溶液撞到微管中。

取出固定溶液，用微量移液管加入1x PBS。存储一分钟后，将旧的 PBS 替换为新的 1x PBS。以清除溶液样品体积的五倍除去PBS后，用石蜡膜密封微管并用针头打孔。

将样品放入干燥器中。排空并关闭真空泵。轻轻打开干燥器，然后关闭微管。

倒置微管，每隔一到两天加快清除过程。对于间隔框架，用剃须刀片切割硅橡胶片，根据样品厚度调整硅橡胶片厚度。将硅胶框架放在盖板上，然后将处理过的样品放在框架内，并加入约100微升的清除溶液以除去任何气泡。

盖上另一个盖玻片，以防止清除溶液蒸发。在荧光显微镜下观察样品。观察后，将样品返回微管中的清除溶液。

各种物种的固定叶子在PBS或ClearSee中孵育八天，在ClearSee或ClearSeeAlpha中孵育两天。ClearSee可以清除各种物种的叶子。提取角质层后，ClearSee可以清除稻叶。

由于ClearSeeAlpha中的亚硫酸钠成分可防止多酚由于还原作用而氧化，因此ClearSeeAlpha可以清除烟草和蒂拉尼亚雌蕊，而不会有任何棕色色素沉着。拟南芥的泛素-10启动子H2B-mClover叶用PBS或ClearSee处理3天。与PBS孵育相比，ClearSee处理降低了拟南芥H2B-mClover叶片的淡绿色，并增强了H2B-mClover的荧光强度。

ClearSee处理的叶子通过950纳米激发的双光子激发显微镜观察。细胞壁被钙质白色染色。细胞核用泛素-10启动子H2B-mClover标记。

Y Z 和 X Z 图像是白色虚线所指示位置处的横截面。固定溶液的制备对于固定样品非常重要。但是，应注意防止样品在真空下损坏。

可以进行显微镜成像以研究该程序后植物发育和感染期间的多种基因表达模式和细胞内通讯。